Izolacija in kvantifikacija ginsenozida Rh23, nove antimelanogene spojine iz listov panax ginsenga

Povzetek:

Nov ginsenozid, imenovan ginsenoside Rh23 (1), in 20-O- -D-glukopiranozil-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahidroksidamar-23-en (2) so izolirali iz listov hidroponičnega ginsenga Panax. Spojine smo izolirali z različnimi kolonskimi kromatografijami in njihove strukture določili na podlagi spektroskopskih metod, vključno z visokoločljivo kvadrupolno/časovno masno spektrometrijo (HR-QTOF/MS), spektroskopijo z jedrsko magnetno resonanco (NMR) in infrardečo (IR) spektroskopijo . Za določitev antimelanogene aktivnosti so testirali spremembo vsebnosti melanina v celicah Melan-a, obdelanih z identificiranimi spojinami.

Poleg tega smo raziskali zaviralne učinke ginsenozida Rh23 na melanin na pigmentacijo v modelu cebrice in vivo. Spojina 1 je zavirala močno melanogenezo v celicah melan-a s 37.0 odstotno inhibicijo melanogeneze pri 80 µM in je predstavljala tudi inhibicijo pigmentacije telesa v modelu cebrice. Čeprav je spojina 2 pokazala nekoliko nižjo inhibitorno aktivnost kot spojina 1, je pokazala tudi znatno zmanjšano melanogenezo v celicah Melan-a in modelu cebrice. Ti rezultati so pokazali, da se lahko spojine, izolirane iz hidroponičnega P. ginsenga, uporabijo kot nove spojine za beljenje kože v sistemih in vitro in in vivo. Poleg tega je ta študija pokazala uporabnost spojine 1 na osnovi MS za kvantitativno analizo. Ginsenoside Rh23 (1) je bil najden na ravni 0,31 mg/g v listih hidroponičnega P. ginsenga.

Za melanin smo ugotovili, da lahko Cistanche znatno zmanjša aktivnost tirozinaze, ki je glavni encim, ki omejuje hitrost v biosintezi kožnega melanina in je kompleks bakra in beljakovin. Lahko hidroksilira tirozin, glavno surovino za proizvodnjo melanina v telesu, da proizvede L-dopo, in nato oksidira dopo v dopakinon. Dopakinon je podvržen vrsti presnovnih procesov, se preuredi in polimerizira ter se končno združi z beljakovinami, ki tvorijo vrsto melaninskih pigmentov, ki povzročajo porjavitev. Melanin je najpomembnejši dejavnik pri določanju barve kože človeškega telesa. Prekomerna sinteza lahko povzroči nastanek pigmentiranih kožnih bolezni, kot so pege, kloazma, starostne pege in melanom. Zato je mogoče z raziskavo o zaviranju aktivnosti tirozinaze izločiti učinkovite sestavine za zaviranje pigmentacije kože, tako da je razvidno, da imajo skupni glikozidi Cistanche deserticola učinek zaviranja pigmentacije kože in beljenja lepote.

Kliknite izdelek za odmerjanje cistanche

Ključne besede:

ginsenozid Rh23; Panax ginseng; NMR; UPLC-QTOF/MS; cebrica; kvantitativna analiza.

1. Uvod

Panax ginseng CA Meyer je zelo znana tradicionalna zdravilna rastlina v azijskih državah. Panax izvira iz "panacea", kar pomeni zdravilo za vse bolezni. P. ginseng je trajna zelnata rastlina iz družine Araliaceae [1]. V terapevtske namene se uporabljajo predvsem štiri do šest let stare korenine P. ginsenga. Cvetovi cvetijo junija, listi pa imajo obliko neba. P. ginseng so gojili predvsem v vzhodni Aziji, vključno s Korejo, Kitajsko in Japonsko [2]. Do danes so poročali o številnih študijah o kemičnih sestavinah korenin, listov in jagod ginsenga; izoliranih je bilo več kot 100 vrst ginsenozidov. Poročali so o različnih bioaktivnostih P. ginsenga, kot so izboljšanje imunomodulatorne aktivnosti, prehranska okrepitev, izboljšanje delovanja jeter, proti diabetesu, proti raku, proti apoptotičnim in antioksidativnim aktivnostim [3–10].

Trenutno se postopoma povečuje zanimanje za kakovostne kmetijske proizvode, ki so povezani z dobrim počutjem, kar vodi v hidroponično gojenje ginsenga. Hidroponsko gojenje ima prednosti enostavnega postopka gojenja in krajše rastne dobe kot gojenje v tleh. Hidroponski ginseng potrebuje samo 2–4 mesece v sistemu, ki nadzoruje temperaturo, je brez pesticidov, vlažen, lahek, ima organske sestavine itd. [11]. Listi ginsenga iz talne pridelave se ne uporabljajo za medicinske namene in funkcionalno zelenjavo, medtem ko se listi hidroponskega ginsenga lahko uporabljajo.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Končno so hidroponski pogoji privedli do visoke vsebnosti ginsenozida in skupna vsebnost ginsenozida v listih je bila znatno višja kot v koreninah, kar nakazuje, da so listi ginsenga lahko dober vir funkcionalne zelenjave in zdravilnih zelišč.

Več znanih belilnih spojin, kot sta arbutin in kojična kislina, so raziskali glede njihove učinkovitosti pri zmanjševanju melanogeneze [13]. Na žalost je treba poiskati varnejša in učinkovitejša sredstva za beljenje kože zaradi rakotvornega potenciala kojične kisline ter varnosti in stranskih učinkov arbutina [14]. Zato se v kozmetični industriji ves čas posveča veliko pozornosti razvoju novih naravnih izdelkov [15,16]. Več študij je poročalo o zaviranju sinteze melanina iz P. ginsenga, gojenega v tleh [17–20].

Vendar pa so te študije poročali z dobro znanimi spojinami, kot so cimetova kislina in fenolne spojine, o belilni aktivnosti pa niso poročali iz listov hidroponičnega P. ginsenga (HPGL). Naše tekoče delo je vodilo do izolacije manjših ginsenozidov iz HPGL. Običajno ginsenozidov v manjših količinah ali v sledovih ni mogoče odkriti s HPLC. V nasprotnem primeru je analitični čas zelo dolg, kar ni primerno za kvalifikacijo ginsenozidov v začimbah ginsenga [21, 22]. Za hitro kvantifikacijo novih spojin je treba vzpostaviti hitro in občutljivo metodo, ki lahko temeljito zazna količine novih spojin v sledovih. V tej študiji je bila za kvantifikacijo nove spojine vzpostavljena občutljiva tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti, povezana s kvadrupolno/časovno masno spektrometrijo (UPLC-QTOF-MS).

Na podlagi zgornjega opisa je bila v tem delu izolacija in identifikacija nove spojine, vključno s fizikalnimi lastnostmi in kvantifikacijo, razkrita s spektroskopskimi metodami, njihove antimelanogene aktivnosti pa so bile raziskane s pomočjo in vitro in in vivo sistemov.

2. Rezultati in razprava

Liste hidroponičnega ginsenga Panax (HPGL) smo ekstrahirali z vodnim MeOH in razdelili v frakcije etil acetata (EtOAc), n-butanola (n-BuOH) oziroma H2O. Ponavljajoče se kolonske kromatografije s SiO2 in ODS frakcije n-BuOH so dale en nov ginsenoside (1) in en redek ginsenoside (2) je bil izoliran iz EtOAc frakcije HPGL.

Spojina 1, bel prah (metanol), je pokazala vijolično barvo na TLC po razprševanju 10 odstotkov H2SO4 in segrevanju. Ugotovljeno je bilo, da je molekulska formula C37H64O10 iz kvazimolekularnega ionskega vrha m/z 713,44723 [M plus COOH]− v negativnem QTOF/MS. IR spekter je pokazal prisotnost hidroksilne skupine (3377 cm-1) in dvojne vezi (1647 cm-1). 1H-NMR spekter (tabela 1 in dodatni materiali) je pokazal dva signala olefin metin protona (δH 6,02, 5,64), tri signale oksigeniranega metina (δH 4,38, 4,03, 3,49), en signal metoksi protona (δH 3,18) in osem signali singlet metil protona (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), kar kaže, da ima spojina 1 tetraciklični triterpenski del, ki vključuje eno dvojno vez s trans konformacijo in tri hidroksilne skupine.

Poleg tega je bilo potrjeno, da je spojina 1 tipa protopanaksatriola (PPT) iz kemijskega premika signala metilnega protona pri δH 1,94 (H-28). Kemični premik H-28 v protopanaksadiolnem (PPD) tipu običajno opazimo pri približno δH 1,30 [23]. Poleg tega so opazili hemiacetalni protonski signal (δH 5,15) in več oksigeniranih metinov in metilenski protonski signal pri δH 4,45–3,95 kot signale sladkornega dela. Iz sklopitvene konstante anomernega protonskega signala (J=7,6 Hz) sta bila tako hemiacetalni proton kot H-2 sladkornega dela v aksialni razporeditvi. Kombinacija zgoraj omenjenih podatkov je pokazala, da je spojina 1 protopanaksatriol aminoglikozid. 13C-NMR spekter je pokazal 37 ogljikovih signalov zaradi delov triterpena, metoksi in heksoze. Dva olefin metinska ogljika (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), en oksigenirani kvarterni ogljik (δC 74,9 (C-25)), trije oksigenirani metinski ogljiki (δC 78,5 (C-3), 7{{90}}.3 (C-12), 67,7 (C-6)), en metoksi ogljik (δC 50,2 ( 25-OCH3)) in osem metilnih ogljikov (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{ 57}}), 17,6 (C-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C-29)) signale za aglikonski del. Podatki NMR za spojino 1 so bili podobni tistim za spojino 2, razen kemijskega premika za oksigenirani kvarterni ogljik, tj. C-25. Poleg tega je bil sladkor identificiran kot -glukopiranoza iz hemiacetala ogljikovih signalov (δC 98,3, (C-10 )), štirih oksigeniranih metinov (δC 78,9 (C-30), 78,2 (C{{82 }} ), 75,2 (C-20 ), 71,6 (C-40 )) in en oksigeniran metilen (δC 63,0 (C-60 )). V spektrih gradientne heteronuklearne korelacije večkratnih vezi (gHMBC) so opazili korelacijo dolgega dosega med anomernim protonskim signalom (δH 5,15 (H-10 )) in signalom oksigeniranega kvarternega ogljika aglikona (δC 83,0 (C -20)), kar kaže, da so bile -glukopiranoze povezane s hidroksilom C-20 (slika 1).

Poleg tega je korelacija med signalom metoksi protona (δH 3,18 (25-OCH3)) in signalom oksigeniranega kvarternega ogljika (δc 74,9 (C-25)) pokazala, da je metoksi povezan s C{{ 7}} (slika 1). Na podlagi zgornjih podatkov je bilo ugotovljeno, da je kemijska struktura 1 20-O- -D-glukopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahidroksi-25- metoksidammar-23-en in poimenovan kot ginsenosid Rh23. Iz primerjav NMR in MS podatki s tistimi, ki so navedeni v literaturi [23, 24] (slika 1). Spojini 1 in 2 smo prvič izolirali iz HPGL.

Čistost ginsenozida Rh23 je bila ugotovljena na več kot 99 odstotkov z normalizacijo površin vrhov, ki jih je zaznala analiza UPLC. Ker se je izkazalo, da je UPLC-OTOF/MS primerno orodje za identifikacijo ginsenozida Rh23, je bila ločevanje sestavin v ekstraktu HPGL izvedena z UPLC-OTOF/MS v načinu negativnih ionov. Slika 2 prikazuje tipičen totalni ionski kromatogram (TIC) ginsenosida Rh23 in ekstrakta z masno detekcijo.

Dobljena je bila linearna umeritvena krivulja za ginsenosid Rh23 pri različnih ravneh koncentracije. Značilnosti umeritvenih grafov so povzete v tabeli 2. Kot je razvidno iz tabele, kaže ginsenoside Rh23 odlične korelacijske koeficiente. Število detektorjev (relativna površina vrha) je bilo linearno odvisno od koncentracije vzorca v območju 0.02–0.8 µg/mL za ginsenosid Rh23. LOD ginsenosida Rh23 je bil 0.002 ppm. Z UPLC-QTOF/MS v načinu negativnih ionov je bilo ugotovljeno, da so LOQ ginsenosida Rh23 0,005 ppm. Količina ginsenozida Rh23 v HPGL, pridobljeni z validacijskimi metodami (tabela 2), je bila 0,319 mg/g.

Za določitev antimelanogene aktivnosti so proučevali spremembo vsebnosti melanina v celicah melan-a, obdelanih s prečiščenimi in identificiranimi spojinami. Celice Melan-a smo 72 ur obdelovali s spojinama 1 in 2 v koncentracijah od 0 do 80 µM in viabilnost celic ocenili s kompletom za testiranje viabilnosti celic CCK-8. Preživetje celic spojin 1 in 2 pri koncentraciji 80 µM za celico melan-a je bilo več kot 98,1 odstotka oziroma 97,8 odstotka (podatki niso prikazani). Ti rezultati so pokazali, da sta spojini 1 in 2 necitotoksični. Učinek antimelanogenih aktivnosti spojin je prikazan na sliki 3. Inhibicija sinteze melanina spojine 1 pri 20, 40 in 80 µM je bila 8,4 odstotka, 15,6 odstotka in 37,0 odstotka v primerjavi s kontrolo. Spojina 2 je pokazala nekoliko nižjo inhibitorno aktivnost kot spojina 1 pri 7,6 odstotka, 12,8 odstotka in 17,8 odstotka pri 20, 40 oziroma 80 µM. Obe spojini sta zavirali sintezo melanina na način, ki je odvisen od odmerka.

Predvsem je spojina 1 pokazala najvišjo aktivnost zaviranja melanina, 37.0 odstotkov pri koncentraciji 80 µM. Po poročilih izvleček radix ginsenga pri 0–1000 µg/mL ni pokazal pomembne inhibicije melanina [19], cimetova kislina, belilno sredstvo, ki ga večinoma najdemo v P. ginsengu, pa je pokazala 29-odstotno inhibicijo sinteze melanina pri 675 µM. [20]. V primerjavi z izvlečkom radix ginsenga in cimetove kisline je spojina 1 pokazala močno inhibitorno aktivnost na sintezo melanina in celo pokazala 12-krat večjo inhibitorno aktivnost na sintezo melanina pri osemkrat nižji koncentraciji v primerjavi s kumarno kislino [ 17,20].

Cebrica je zelo ugoden model vretenčarjev zaradi organskih sistemov in genskih zaporedij, podobnih človeškim [25]. Poleg tega je uporaba zarodkov cebric deležna vse večje pozornosti, saj veljajo za nadomestno metodo za poskuse na živalih [26]. Cebrice imajo na površini pigmente melanina, kar omogoča preprosto opazovanje procesa pigmentacije brez zapletenih eksperimentalnih postopkov [27].

Tako smo raziskali učinke spojine 1 na zaviranje melanina na pigmentacijo rib cebric. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili PTU (N-feniltiosečnina; zaviralec tirozinaze, ki vsebuje žveplo) (slika 4B), ki se pogosto uporablja pri raziskavah cebric [28, 29]. Kot je prikazano na sliki 4C, je D, 40 in 80 µM obdelava s spojino 1 povzročila izjemno inhibicijo pigmentacije telesa cebrice, kar je izjemno zmanjšalo skupno vsebnost melanina v primerjavi s kontrolnim vehiklom (slika 4A).

V tej študiji smo izolirali nov ginsenosid Rh23 (1) iz hidroponskih listov P. ginsenga. Do sedaj so poročali o več kot 100 ginsenozidih iz vrst ginsenga. Vendar se 25-hidroksilirani ginsenozidi redko pojavljajo v naravi, tudi v rastlinah ginsenga. Poleg tega niso poročali o aktivnosti beljenja. Inhibicijska aktivnost ginsenozida Rh23 je pokazala 37 odstotkov pri koncentraciji 80 uN brez celične citotoksičnosti v celicah melan-a, medtem ko ginsenozid Rh23 (podatki niso prikazani) niso opazili inhibicije aktivnosti gobje tirozinaze in vitro. Nedavno se je izkazalo, da imajo izvlečki ali prečiščeni ginsenozidi iz korenin in listov ginsenga številne antioksidativne lastnosti (30, 31), medtem ko je vodni ali organski izvleček ginsenga pokazal lovilne aktivnosti proti DPPH, superoksidnemu anionu in hidroksilnemu radikalu (32). Zato ima naš novi ginsenosid Rh23, izoliran iz listov hidroponičnega P. ginsenga, morda znižano tirozinazo zaradi svojih antioksidativnih lastnosti. Vendar pa njegova vloga melanogeneze še ni bila raziskana. Zato je treba v nadaljnji študiji določiti natančne mehanizme delovanja ginsenozida Rh23 na regulacijo sinteze melanina.

3. Eksperimentalno

3.1. Splošno

Za kolonsko kromatografijo smo uporabili smoli Kieselgel 60 in LiChroprep RP-18 (Merck, Darmstadt, Nemčija). Kot trdni fazi za TLC poskus smo uporabili Kieselgel 60 F254 (Merck) in RP-18 F254S (Merck). Zaznavanje madežev na plošči TLC je bilo izvedeno z opazovanjem pod UV žarnico (Spectroline, model ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, ZDA) ali z razprševanjem 10-odstotne vodne raztopine H2SO4 na razvito ploščo, ki ji sledi segrevanje. Optične rotacije so bile izmerjene z digitalnim polarimetrom JASCO P-1010 (Tokio, Japonska). Tališča so bila določena z uporabo Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher science company, Pittsburgh, PA, ZDA) z mikroskopom. Ultravijolične spektre smo izmerili na spektrofotometru modela Shimadzu UV-1601 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japonska). IR spektri so bili pridobljeni iz Perkin Elmer Spectrum One FT-IR spektrometra (Buckinghamshire, UK). NMR spektri so bili posneti na spektrometru Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, ZDA). Analiza UPLC-QTOF/MS je bila izvedena z uporabo serije Waters Xevo G2-S (Waters Corp., Milford, MA, ZDA), ki deluje v načinu negativnih ionov.

3.2. Rastlinski materiali

Hidroponski ginseng Panax so gojili v rastlinjaku Oddelka za raziskave zeliščnih pridelkov v Eumseongu v provinci Chungbuk v skladu s protokolom "standardnega vodnika za gojenje ginsenga GAP" [11,33], ki ga je razvila Uprava za razvoj podeželja Republike Koreje. Enoletne korenine sadik ginsenga s težo 0.8 do 1 g so bile kupljene pri Oddelku za raziskave zelišč, Nacionalnega inštituta za hortikulturo in zeliščarstvo (NIHHS), Uprava za razvoj podeželja (RDA) in shranjene v komoro pri nizki temperaturi (1–2 ◦C) pred uporabo. Korenine sadik ginsenga smo presadili v hranilne kopeli in gojili v hidroponskem sistemu. Po treh mesecih gojenja so hidroponski ginseng izvlekli za obiranje. Pobrane hidroponične rastline ginsenga so bile oprane od prahu z vodo in razvrščene v liste in korenine, ki so bile nato 72 ur sušene v zamrzovalnem sušilniku (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Koreja). Vzorec vavčerja (NIHHS14-03) je bil deponiran v herbariju Oddelka za raziskave zeliščnih pridelkov, NIHHS, RDA, Eumseong, Republika Koreja.

3.3. Ekstrakcija in izolacija

Posušene in v prah zmlete liste hidroponičnega P. ginsenga (HPGL, 6 kg) ekstrahiramo z 80 odstotki MeOH (30 L × 3) pri sobni temperaturi 24 ur. Ekstrakte smo filtrirali skozi filtrirni papir in uparili pod znižanim tlakom pri 45 ◦C, da smo dobili 1,4 kg ekstrakta. Ekstrakt smo zlili v H2O (3 L) in zaporedoma ekstrahirali z EtOAc (3 L × 3) in n-BuOH (2,6 L × 3). Vsako plast smo koncentrirali pod znižanim tlakom, da smo dobili frakcije EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) in H2O (855 g).

Frakcijo n-BuOH (HPGLB, 130 g) smo nanesli na kolono silikagela (φ 13 × 17 cm) in eluirali s CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L), da dobimo 20 frakcij (HPGLB1 do HPGLB20). Frakciji HPGLB3 in HPGLB4 smo združili (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0.12) in nadalje frakcionirali v koloni s silikagelom (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L), da dobimo 14 frakcij (HPGLB3-1 do HPGLB3-14). Frakciji HPGLB3-4 in HPGLB3-5 smo združili (1,27 g, Ve/Vt {{40}}.09–0.16) in nadalje frakcionirali v koloni ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L), da dobimo devet frakcij (HPGLB3-4-1 do HPGLB3-4-9). Frakcija HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0.14–0,26) je bila nadalje frakcionirana preko ODS kolone (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L), da dobimo devet frakcij (HPGLB3-4-3-1 do HPGLB3-4-3-9), vključno s spojino 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0.42–0,55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Frakcije HPGLB5 do HPGLB7 smo združili (24,0 g, Ve/Vt=0.12–0,22) in nadalje frakcionirali v koloni s silikagelom (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L), da dobimo 16 frakcij (HPGLB5-1 do HPGLB5-16). Frakcija HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0.28–0.31) je bila nadalje frakcionirana preko ODS kolone (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1.2 L → 3:1, 1,5 L), da dobimo deset frakcij (HPGLB5-6-1 do HPGLB5-6-10), vključno s spojino 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 0,21–0,23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Spektroskopski podatki

Spojina 1. Bel prah, tal.: 138–140 ◦C; [] 25 D plus 17,4° (c=0.39, MeOH); IR (okno CaF2): 3377, 2932, 1382 cm-1; negativni QTOF/MS m/z 713,44723 [M plus COOH]- (izrač. za C37H64O10, 668,4499); 1H- in 13C-NMR podatki, glejte tabelo 1.

Spojina 2. Bel prah, tališče: 133–136 ◦C; [] 25 D plus 20,2° (c=0,50, MeOH); IR (okno CaF2): 3359, 2929, 1384 cm−1; negativni QTOF/MS m/z 699,48311 [M plus COOH]− (izrač. za C36H62O10, 654,4323); 1H- in 13C-NMR podatki, glejte tabelo 1.

3.5. Kvantitativna analiza nove spojine 1 z uporabo UPLC-QTOF/MS

Standardno osnovno raztopino spojine 1 smo pripravili z raztapljanjem 1.00 mg vsake v 1 mL metanola, da smo dobili koncentracijo 1.00 mg/mL in jo hranili pri 4 ◦C. Standardno osnovno raztopino (1) smo razredčili z metanolom, da smo dobili raztopine za umerjanje z razponi 0.{{10}}2–0,8 µg/mL, v tem zaporedju. En gram ekstrakta HPGL smo natančno stehtali in raztopili v fiksnih volumnih (10 mL) metanola, filtrirali skozi 0.20 mm filter papir in ohladili pri 4 ◦C . UPLC je bil izveden z uporabo Waters ACQUITY H-Class UPLC (Waters Corp., Milford, MA, ZDA) s kolono ACQUITY BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Mobilni fazi sta bili voda (A) z 0,1 % mravljinčne kisline (v/v) in acetonitril (B) z 0,1 % mravljinčne kisline (v/v). Gradient elucije je bil naslednji: 0–4 min, B 10–30 odstotkov; 4–15 min, B 30–60 odstotkov; 15–16 min, B 60–100 odstotkov; 16–19 min, B 100–10 odstotkov. Hitrost pretoka je bila 0,45 mL/min, volumen injekcije pa 2 µL za vsako izvedbo.

Nato je bila izvedena analiza HR-MS z uporabo Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, ZDA), ki deluje v načinu negativnih ionov. Masni spektrometri so izvajali izmenično skeniranje z visoko in nizko energijo, znano kot način pridobivanja MSE. Natančne meritve mase so bile pridobljene z uporabo avtomatiziranega sistema za dostavo kalibracije, ki je vseboval levcinski enkefalin, m/z 554,262 (ESI neg. način) kot interno referenco. Optimalni parametri delovanja so bili nastavljeni, kot je prikazano v tabeli 3.

3.6. Celična kultura

Melanociti Melan-a so visoko pigmentirana, ovekovečena normalna celična linija mišjih melanocitov, pridobljena iz miši C57BL/6. Celice melan-a, uporabljene v tej študiji, so bile pridobljene od dr. Dorothy Bennett (bolnišnica St. George's, London, Združeno kraljestvo). Celice smo gojili pri 37 °C v atmosferi s 95 odstotki zraka, 10 odstotki CO2 v mediju RPMI 1640, dopolnjenem do končne koncentracije z 10 odstotki toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma, 1 odstotkom penicilina/streptomicina in 200 nM PMA. Viabilnost celic je bila določena s kompletom za štetje celic CCK-8-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japonska).

3.7. Test melanina

Celice Melan-a smo 72 h obdelovali s spojinami, nato pa celice 30 minut raztopili v 1 N NaOH pri 60 ◦C. Nato smo lizate izmerili pri 450 nm s spektrofotometrom. Podatki so bili normalizirani na vsebnost beljakovin v celičnih lizatih. Celični lizati so bili nato obdelani za določanje koncentracije proteina z uporabo kompleta za testiranje proteinov BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, ZDA).

3.8. Izvor in vzdrževanje starševskih rib

Odrasle cebrice so bile pridobljene od komercialnega trgovca in 10–15 rib je bilo shranjenih v 5 L akrilnem rezervoarju z naslednjimi pogoji: 28,5 ◦C, s 14/10 h ciklom svetloba/tema. Zebrice so hranili trikrat na dan, šest dni na teden, s hrano iz kosmičev TetraMin, dopolnjeno z živimi morskimi kozicami (Artemia salina). Zarodke smo pridobili iz naravnega drstenja, ki smo ga sprožili zjutraj s prižigom luči. Zbiranje zarodkov je bilo končano v 30 minutah. Vsi eksperimentalni protokoli in postopki so bili odobreni in izvedeni v skladu z odobrenimi smernicami in predpisi Odbora za etiko živali Nacionalne univerze Chungnam (CNU-00866).

3.9. Zdravljenje s spojinami in vrednotenje na podlagi fenotipa

Sinhronizirane zarodke smo zbrali in razvrstili s pipeto (7–9 zarodkov na vdolbino v 24-plošči z vdolbinicami, ki vsebujejo 1 ml medija za zarodke). Testne spojine so bile raztopljene v 0.1 % DMSO in nato dodane v medij zarodka od devet do 72 ur po oploditvi (hpf) (63 ur izpostavljenosti). Pod stereomikroskopom so opazili učinke na pigmentacijo rib cebric. Vsakodnevno smo občasno mešali in zamenjali medij, da smo zagotovili enakomerno porazdelitev spojin. V vseh poskusih je bila 0.2 mM 1-fenil-2-tiosečnina (PTU) uporabljena za ustvarjanje prozorne cebrice brez vmešavanja v razvojni proces [33] in je veljala za standardno pozitivno kontrolo. Ocene telesne pigmentacije na podlagi fenotipa so bile dehorionirane s kleščami, anesteziranimi v raztopini trikain metansulfonata (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), nameščene v 3-odstotni metilcelulozi na 35 mm posodo (SPL Lifesciences, Pocheon, Koreja), in fotografirano pod stereomikroskopom MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Nemčija).

4. Sklepi

V tej študiji je bil ginsenosid Rh23 (1) izoliran iz hidrofoničnih listov Panax ginsenga skupaj z 20-O- -D-glukopiranozilom-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroksidamar-23-en (2). Na splošno smo bili uspešni v našem poskusu pridobitve hipopigmentnega učinka spojin iz hidroponičnega P. ginsenga. Ginsenoside Rh23 in 20-O- -D-glukopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 ,25-pentahidroksidamar23-en zavirata biosintezo melanina brez citotoksičnih učinkov v celici melan-a. Poleg tega je ginsenoside Rh23 okrepil depigmentacijo ribe cebrice kot alternativnega živalskega modela. Zmanjšanje vsebnosti melanina in pigmentacije v telesu ima lahko potencial za belilno aktivnost in necitotoksični učinek je ugodnejša točka, ker je varnost pri belilnih sredstvih v kozmetičnih izdelkih najpomembnejša.

Tako je na podlagi naših trenutnih rezultatov pomembno, da se lahko nove hidrofonične spojine P. ginsenga uporabijo kot potencialno učinkovito sredstvo za posvetlitev kože. Nadaljnje študije bodo razjasnile natančne mehanizme delovanja ginsenozida Rh23 na regulacijo sinteze melanina in razmerje med strukturnimi značilnostmi ginsenozida Rh23 in melanogenezo, da bi ugotovili, ali je potencialno belilno sredstvo za kozmetično industrijo. Prednosti hibridne Q-TOF masne spektrometrije ne vključujejo le zmožnosti zaznavanja kakovosti in občutljivosti, ampak tudi natančno merjenje, zaradi česar so strukturne razlage enostavnejše. Uporablja se lahko za kvalitativno in kvantitativno določanje manjših ali novih spojin, kar pomaga izboljšati nadzor kakovosti začimb ginsenga.

Dodatni materiali:

1H-NMR in 13C-NMR spektri 1 so na voljo v dodatnem materialu.

Zahvala:

To delo je bilo izvedeno s podporo "Sodelovalnega raziskovalnega programa za razvoj znanosti in tehnologije v kmetijstvu" (PJ01136203), Uprava za razvoj podeželja, Republika Koreja. Zahvaljujemo se Cheol-Hee Kim (Chungnam National University) za skupno rabo objekta za ribe cebrice.

Avtorski prispevki:

DYL in N.-IB sta zasnovala in oblikovala poskuse; H.-GK in Y.-GL sta izolirala spojine; DYL je razjasnil strukture; I.-BJ je sodeloval pri pripravi rastlinskega materiala; JHK je izvedel biološki test in pomagal pri pripravi rokopisa; JWL in B.-RC sta opravila NMR in UPLC-QTOF/MS vzorcev; G.-SK je pomagal pri reviziji rokopisa; in DYL sta napisala članek in vodila raziskovalni projekt. Vsi avtorji so prebrali in odobrili končni rokopis.

Nasprotja interesov:

Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov. Ustanovni sponzorji niso imeli nobene vloge pri načrtovanju študije; zbiranje, analize ali interpretacija podatkov; pisanje rokopisa; ali odločitev o objavi rezultatov.

Reference

1. Ben, EW; Michael, W. Zdravilne rastline sveta. V Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, ZDA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Biološke aktivnosti in kemija saponinov iz Panax ginsenga CA Meyer. Fitokemija 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Učinek krepitve imunskega sistema gorskega ginsenga, gorsko gojenega ginsenga in ginsenga Panax. J. Orient. Nevropsihiatrija 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Panax ginseng farmakologija: povezava z dušikovim oksidom? Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Vpliv metanolnega ekstrakta sončnega ginsenga na poškodbo jeter, ki jo povzroča lipopolisaharid, pri podganah. Fitomedicina 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Učinki spojine K na hiperglikemijo in insulinsko rezistenco pri podganah s sladkorno boleznijo tipa 2. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Učinki ginsenozida Rg3 in Rh2 na proliferacijo celic raka prostate. Arh. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Afrodiziak in adaptogene lastnosti ginsenga. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Antioksidativne in protitumorske aktivnosti metanolnega ekstrakta toplotno obdelanega ginsenga. Rak Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; Ne, HJ; Kwon, H.; Lee, JZ; Kim, SY; Kim, YB Učinki naravnih bioaktivnih izdelkov na rast in vsebnost ginsenozida Panax ginsenga, gojenega v aeroponskem sistemu. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Primerjava vsebnosti ginsenozida in fenolnih sestavin v hidroponično gojenih listih, sadju in koreninah ginsenga. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Študije zdravil za obnohtno kožico iz naravnih virov. II. Zaviralni učinki rastlin Prunus na biosintezo melanina. Biol. Pharm. Bik. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Vpliv natrijevega nitrita, natrijevega klorida in natrijevega nitrata na kalitev in razraščanje anaerobnih spor. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. Nov stilben z inhibitorno aktivnostjo tirozinaze iz Chlorophora se odlikuje. Chem. Pharm. Bik. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Park, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Yoo, ID; Park, KC Terrin: Nov zaviralec melanogeneze in njegov mehanizem. Celica. Mol. Življenje 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Sin, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Zaviralni učinki cimetove kisline na biosintezo melanina v koži. Biol. Pharm. Bik. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Kvantitativna analiza fenolnih spojin v različnih delih Panax ginsenga CA Meyer in njegov zaviralni učinek na biosintezo melanina. Korean J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Sem, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Vpliv radix ginsenga in radix trichosanthis na melanogenezo. Biol. Pharm. Bik. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Joj, KM; Jo, YO Primerjava vsebnosti fenolnih spojin med belim in rdečim ginsengom in njihov zaviralni učinek na biosintezo melanina. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Pesem, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Analiza nizkopolarnih ginsenozidov v parjenem ginsengu Panax pri visoki temperaturi s HPLC-ESI-MS/MS. Chem. Res. brada. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Kemične transformacije, povzročene s parjenjem, in celovita ocena kakovosti rdečega ginsenga, pridobljenega iz ginsenga Panax, z uporabo večkomponentnega kvantificiranega prstnega odtisa na osnovi HPLC-ESI-MS/MSn. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MOJ; Yang, B.; Jin, YR Trije novi triterpenski saponini tipa dammarane iz listov Panax ginsenga CA Meyer. J. Asian Nat. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Obsežen HILIC x RPLC z detekcijo masne spektrometrije za analizo saponinov v Panax notoginseng. Analitik 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Ljubezen, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR Tehnologija za zaslon z visoko zmogljivostjo: sedanjost in prihodnost z uporabo rib cebrice. Curr. Opin. Biotehnologija. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Štefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Zarodki cebric kot alternativa poskusom na živalih - Komentar o opredelitvi začetka zaščitenega življenjskega obdobja v predpisih o dobrem počutju živali. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish kot nov model za presejanje melanogenih regulativnih spojin na osnovi fenotipa. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB Feniltiosečnina moti delovanje ščitnice pri razvoju cebric. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Ne, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Potencial manjših ginsenozidov, izoliranih iz listov Panax ginsenga kot zaviralcev melanogeneze. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Človek, RY saponini Panax quinquefolium ščitijo lipoproteine ​​nizke gostote pred oksidacijo. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosides v koreninah in listih ameriškega ginsenga. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717–720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Antioksidativne lastnosti različnih izvlečkov topil iz listov divjega ginsenga. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. Nacionalni inštitut za rastlinstvo. Standardna smernica za gojenje ginsenga GAP; Nacionalni inštitut za rastlinske znanosti, Uprava za razvoj podeželja: Suwon, Koreja, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Ustvarjanje prozorne cebrice: izpopolnjena metoda za izboljšanje odkrivanja izražanja genov med embrionalnim razvojem. Mar. Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Razpoložljivost vzorcev:

Vzorci spojin 1 in 2 so na voljo pri avtorjih.

Dae Young Lee 1 ID, Hyoung-Geun Kim 2, Yeong-Geun Lee 2, Jin Hee Kim 3, Jae Won Lee 1 ID, Bo-Ram Choi 1, In-Bae Jang 1, Geum-Soog Kim 1 in Nam-In Baek 2,*

1 Oddelek za raziskave zeliščnih pridelkov, Nacionalni inštitut za hortikulturo in zeliščarstvo, RDA, Eumseong 27709, Koreja; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Oddelek za biotehnologijo orientalske medicine, Univerza Kyung Hee, Yongin 17104, Koreja; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Prejeto: 28. 11. 2017; Sprejeto: 26. januar 2018; Objavljeno: 29. januar 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com