Natalenamidi A–C, ciklični tripeptidi iz Actinomadura Sp. RB99

Povzetek:

V zadnjih letih so se raziskave biokemije bakterij, povezanih z žuželkami, povečale. V kombinaciji z analitičnimi postopki dereplikacije te študije zagotavljajo močno strategijo za prepoznavanje strukturno in/ali biološko novih spojin. Neribosomsko sintetizirani ciklični peptidi imajo širok spekter bioaktivnosti z visokim medicinskim potencialom.

Tukaj poročamo o odkritju treh novih cikličnih tripeptidov: natalenamidov A–C (spojine 1–3). Te spojine so bile identificirane iz juhe kulture gobe Actinomadura sp. RB99 z uporabo metode dereplikacije, ki temelji na tekočinski kromatografiji (LC)/ultravijolični (UV)/masni spektrometriji (MS). Kemijske strukture novih spojin (1–3) so bile ugotovljene z analizo obsežnih spektroskopskih metod, vključno z enodimenzionalnimi (1H in 13C) in dvodimenzionalnimi (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) jedrskimi magneti resonančne spektroskopije (NMR), skupaj s podatki visokoločljive elektrosprejne ionizacijske masne spektrometrije (HR-ESIMS). Absolutne konfiguracije novih spojin so bile pojasnjene z uporabo Marfeyeve analize. Z več testi bioaktivnosti za tripeptide smo ugotovili, da ima spojina 3 pomembne zaviralne učinke na 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) inducirano proizvodnjo melanina. Učinek spojine 3 je bil podoben učinku kojične kisline, spojine, ki se v veliki meri uporablja kot kozmetični material z učinkom beljenja kože.

Svetla, gladka in nežna koža je že od nekdaj cilj vzhodnjaških žensk. Raziskave in razvoj belilnih sredstev za izdelke za nego kože temeljijo predvsem na zaviranju aktivnosti tirozinaze.

Spojine, ki vsebujejo benzenske obroče ali fenolne hidroksilne strukture, imajo potencialne belilne učinke, kot je trenutno pogosto uporabljeno belilno sredstvo arbutin, ki lahko povzroči belilne učinke z zaviranjem aktivnosti tirozinaze.

In ugotovili smo, da ima Cistanche deserticola belilni učinek. Glavna aktivna sestavina Cistanche deserticola, feniletanoidni glikozidi, je neke vrste naravna glikozidna spojina. Študije so pokazale, da lahko feniletanoidni glikozidi zavirajo aktivnost tirozinaze in proizvodnjo melanina v človeških epidermalnih melanocitih ter imajo učinek beljenja. učinkovitost sredstva.

Kliknite izvleček cistanche tubulosa v prahu

Ključne besede:

termit, ki raste glive; Actinomadura sp.; tripeptidi; natalenamidi A–C; učinki beljenja kože.

1. Uvod

Kemijska analiza zaščitnih bakterijskih simbiontov kmetijskih žuželk je v zadnjih letih pritegnila veliko pozornosti med kemiki naravnih proizvodov [1–5]. Z uporabo najsodobnejših procesov dereplikacije, ki temeljijo na jedrski magnetni resonanci (NMR)/masni spektrometriji (MS), in ekološko pomembnih bioloških testih so odkrili impresivno količino strukturno intrigantnih naravnih produktov, vključno z več neribosomsko sintetiziranimi cikličnimi peptidi. iz mikrobnih simbiontov [6]. Najvidnejši primeri vključujejo protiglivični dentigerumicin, ciklični depsipeptid, izoliran iz Pseudonocardia sp., povezane z rastjo gliv in mravljami. [7], in gerumicini A–C, ciklični depsipeptidi, ki vsebujejo piperazinsko kislino, identificirani iz Pseudonocardia sp. [8].

Pokazalo se je, da ciklični peptidi izkazujejo širok spekter bioloških aktivnosti, kar spodbuja več sintetičnih pristopov do teh farmakološko obetavnih struktur [9–12]. Več kot 40 cikličnih peptidnih zdravil se trenutno trži in široko uporablja v kliničnih okoljih, vsako leto pa v povprečju pride na trg približno eno novo ciklično peptidno zdravilo [13].

Kot del našega nenehnega prizadevanja za identifikacijo strukturno novih in/ali bioaktivnih sekundarnih metabolitov iz mikrobov, povezanih s termiti [14–17], smo se osredotočili na Actinomadura sp., povezano s termiti. RB99, izoliran iz termitov, ki rastejo glive, Macrotermes natalensis. Naša strategija dereplikacije, ki temelji na tekočinski kromatografiji (LC)/ultravijolični (UV)/masni spektrometriji (MS), je prinesla potencialno nove bioaktivne naravne izdelke. V tej študiji poročamo o izolaciji in kemijski identifikaciji treh novih cikličnih tripeptidov, natalenamida A–C (spojine 1–3, slika 1), z uporabo metode dereplikacije, ki temelji na LC/UV/MS, ter njihovih bioloških ocenah za citotoksičnost , protivnetne dejavnosti in dejavnosti za beljenje kože.

2. Rezultati in razprava

2.1. Izolacija spojin 1–3 na osnovi tekočinske kromatografije (LC)/ultravijolične (UV)/masne spektrometrije (MS)

Actinomadura sp. RB99 je bil izoliran s površine termita delavca (M. natalensis). Filogenetska analiza skoraj popolnega zaporedja 16S ribosomske ribonukleinske kisline (rRNA) kaže, da sev RB99 pripada rodu Actinomadura, z najbližjim sosedom Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Kasnejša analiza obogatenih ekstraktov kulture na osnovi LC/UV/MS je pokazala niz značilnih UV absorpcij z edinstvenimi vrhovi molekularnih ionov, ki vsebujejo dušikove atome.

Za identifikacijo zadevnih metabolitov in raziskovanje njihove aktivnosti je bila izvedena obsežna fermentacija z uporabo optimiziranih rastnih pogojev (100 agarskih plošč iz 2 L agarja ISP2, pH 6, 10 dni pri 30 ◦C) ter uveljavljen postopek obdelave in predčiščenja. uporabljeno [17]. Naknadno frakcioniranje pod vodstvom LC-UV/MS in ponavljajoča semi-preparativna tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) sta povzročila izolacijo treh metabolitov z edinstvenim vzorcem NMR/MS. Izvedli smo študije rasti in medijev z uporabo različnih soli (NaCl, KBr 1–3 odstotkov) in sestave medijev (mediji ISP1-6), da bi posnemali naravno okolje in spodbudili proizvodnjo metabolitov, kar je privedlo tudi do prisotnosti treh novih metabolitov (glej dodatno sliko S19).

2.2. Strukturna razlaga spojin

Natalenamid A (1) je bil pridobljen kot amorfen prah. Ugotovljeno je bilo, da je molekulska formula 1 C19H25N3O5 iz z natrijem adduciranega molekularnega iona pri m/z 398,1691 [M plus Na] plus (izračunano za C19H25N3O5Na, 398,1692) z masno spektrometrijo visoke ločljivosti z ionizacijsko elektrosprejem (HR- podatki ESIMS). Infrardeči (IR) spekter je pokazal močan absorpcijski pas pri 1670 cm−1, kar kaže na prisotnost amidnih skupin v molekuli. Podrobna analiza podatkov 1H NMR za 1 (tabela 1) je pokazala tipične signale peptidnega skeleta, ki prikazujeta dva metilna signala (δH 0.91 (3H, d, J=7).{29 }} Hz, H-3) in 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), trije metilenski signali (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) in 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), štirje metinski signali (δH 2,02 (1H , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 4.20 (1H, dd, J=8.5, 4,5 Hz, H-6) in 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)) in pet prekritih aromatskih protonov (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18) in 7,24 (2H, m, H-15/17)).

13C NMR spekter (tabela 1) je s pomočjo spektrov HSQC in HMBC pokazal skupno 19 ogljikovih resonanc, ki so odgovorne za dva metilna signala (δC 18,9 in 19,9), tri metilenske signale (δC 27.0, 30.6 in 38.8), devet metinskih signalov (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) in 130.6 (×2)), vključno s petimi aromatskimi ogljiki, enim olefinskim ogljikom signal (δC 138,8) in štiri karbonilne ogljikove signale (δC 173,2, 173,3, 174,8 in 181,3). V kombinaciji z zgornjimi spektroskopskimi podatki je podroben pregled dvodimenzionalne (2D) NMR (poskusi 1H-1H COSY, HSQC in HMBC) razkril prisotnost treh aminokislin v 1: glutamata (Glu), fenilalanina ( Phe) in valin (Val) (slika 2). Povezljivost teh aminokislin je bila določena s korelacijami HMBC H-1/C-5 in C-19, H-11/C-10 in C{ {50}} ter H-6/C-5 in C-10 (slika 2).

Za identifikacijo absolutne konfiguracije 1 je bila uporabljena Marfeyeva metoda za določitev stereokemije večkratnikov -H (C-1, C-6 in C-11). Kislinski hidrolizati 1 in standardnih aminokislin (L/D-Glu, Phe in Val) so bili derivatizirani z 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alaninom amid (L-FDAA). Zaporedoma smo derivatizirano mešanico 1 in standardnih aminokislin analizirali s LC/MS, da bi preverili njihov retenzijski čas. Absolutne konfiguracije delov Glu, Phe in Val so bile vse določene kot L-oblike na podlagi retenzijskih časov derivatov L-FDAA 1 v primerjavi s tistimi standardnih aminokislin. Tako je bila struktura 1 pojasnjena kot ciklični tripeptid, prikazan na sliki 1.

Natalenamid B (2) smo izolirali kot amorfen prah. Njegovo molekulsko formulo (C20H27N3O5) so izpeljali iz vrhov molekularnih ionov, ki so bili aducirani z vodikom in natrijem, pri 390,2032 [M plus H] plus (izračunano za C20H28N3O5, 390,2029) oziroma 412,1849 [M plus Na] plus (izračunano za C20H27N3O5Na, 412,1848). V primerjavi z molekulsko formulo in NMR spektralnimi podatki 1 se zdi, da ima spojina 2 dodatno skupino CH2 v peptidnem skeletu. Obsežen pregled enodimenzionalnih (1D) (1H in 13C NMR) in 2D NMR (1H–1H COSY, TOCSY, HSQC in HMBC) spektrov 2 je razkril obstoj treh aminokislinskih ostankov: Glu, Phe in Leu (levcin). Zaporedje teh aminokislin je bilo zgrajeno na podlagi HMBC korelacije H-1/C-6 in C-20, H-12/C-11 in C -20 in H-7/C-6 in C-11 (slika 2). Za določitev absolutne konfiguracije 2 je bila izvedena derivatizacija ostankov Glu, Phe in Leu z L-FDAA in nato analizirana s LC/MS. V podatkih LC/MS so L-Glu, L-Phe in L-Leu odkrili s primerjavo retenzijskih časov za L-FDAA derivate 2 s tistimi za standardne aminokisline. Tako je bila kemijska struktura 2 ugotovljena kot ciklični tripeptid, prikazan na sliki 1.

Podatki HR-ESIMS v pozitivnem načinu za natalenamid C (3) so pokazali molekularne ione, ki so bili aducirani z vodikom in natrijem, pri 424,1870 [M plus H] plus (izračunano za C23H26N3O5, 424,1872) in 446,1694 [M plus Na] plus (izračunano za C23H25N3O5Na, 424.1692). To je nakazovalo, da je bila njegova molekulska formula C23H25N3O5. Podrobna analiza 1D in 2D NMR spektrov 3 je pokazala, da je bila njegova kemična struktura podobna strukturi 2, le da je bil Leu nadomeščen s Phe v 3. Povezljivost treh identificiranih aminokislin v 3 je bila preverjena z uporabo korelacije HMBC za H-1/C-9 in C-23, H-15/C-14 in C-23 ter H-10/ C-9 in C-14 (slika 2). Z uporabo Marfeyeve metode za spojino 3 je bilo pojasnjeno, da sta absolutni konfiguraciji večkratnikov -H (C-1, C-10 in C-15) en L-Glu in dva L -Phe deli. V skladu s tem je bila določena celotna struktura 3, kot je prikazano na sliki 1.

Natalenamidi A–C so triciklični peptidi, domnevno neribosomskega izvora. Trenutno je več bioaktivnih cikličnih tripeptidov označenih kot naravnih proizvodov: citotoksični 17-členski ciklični tripeptidi (npr. OF4949 I–IV), izolirani iz Penicillium rugulose [18]; protiglivične sklerotomije A−K, identificirane iz fermentacijske brozge halotolerantnih bakterij [10]; in antiproliferativni psihrofilni E, izoliran iz mešane kulture dveh sevov gliv iz morskih alg iz rodu Aspergillus [19].

2.3. Biološke aktivnosti spojin 1-3

Ker so poročali, da ciklični peptidi izkazujejo širok spekter bioloških aktivnosti, so biološke učinke izoliranih cikličnih tripeptidov ({{0}}) ovrednotili z uporabo treh bioaktivnosti. Citotoksičnost spojin 1-3 so raziskali proti štirim rakavim celičnim linijam (celice raka dojke MCE7, celice raka materničnega vratu HeLa, rakave celice človeškega pljuča A549 in celice raka jeter HepG2) pri različnih koncentracijah (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 in 100 uM). Spojina 1 ni vplivala na sposobnost preživetja celic MCF-7, HeLa ali A549. Vendar pa je obdelava celic HepG2 s 100 M spojine 1 zmanjšala viabilnost celic na 78,5 plus 3,2 odstotka (slika 3). Spojina 2 je zmanjšala viabilnost celic HeLa in celic A549 na 82.9  2.1 odstotkov oziroma 73.5=3.0 odstotkov, ni pa vplivala na viabilnost celic MCF-7 oz. Celice HepG2 (slika 3). Spojina 3 ni vplivala na sposobnost preživetja nobene od celičnih linij (slika 3).

Nato so bili makrofagi RAW264.7 uporabljeni za raziskovanje protivnetnih učinkov izoliranih spojin. Da bi odpravili napake pri proizvodnji NO, ki jih povzroča spreminjanje stopnje preživetja celic, so bile pregledane netoksične koncentracije vsake spojine. Kot je prikazano na sliki 4, so imele spojine 1–3 malo citotoksičnih učinkov v celicah RAW264.7 (slika 4A–C) in niso imele zaviralnih učinkov na proizvodnjo NO v celicah RAW264.7, stimuliranih z lipopolisaharidom (LPS) (slika 4D–F). .

Inhibitorne učinke spojin 1–3 na vsebnost melanina v celicah B16F10 so preučili kot dokaz njihovih aktivnosti beljenja kože (slika 5). Ker spremembe v viabilnosti celic povzročajo napake pri proizvodnji in merjenju melanina, smo najprej preučili učinke spojin 1–3 na preživetje celic B16F10. Spojine 1–3 niso imele citotoksičnih učinkov v celicah B16F10 pri nobeni od uporabljenih koncentracij (slika 5A–C). Nato smo ocenili zaviralne učinke spojin na 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) inducirano proizvodnjo melanina v celicah B16F10 (slika 5D–F). IBMX, dobro znani stimulator melanogeneze, povzroči znatno povečanje proizvodnje melanina po enkratnem zdravljenju v celicah melanoma. Med ocenjenimi spojinami je spojina 3 (pri 5–100 µM) pokazala pomembne zaviralne učinke na sintezo melanina, posredovano z IBMX, na način, ki je odvisen od odmerka. Kojična kislina, naša pozitivna kontrola, se v veliki meri uporablja kot kozmetični material z učinki beljenja kože [20]. Zaviralni učinek spojine 3 na proizvodnjo melanina, ki ga povzroča IBMX, je bil podoben učinku kojične kisline (slika 5F), kar kaže, da spojina 3 deluje kot močan zaviralec proizvodnje melanina, ki ga povzroča IBMX, v celicah melanoma B16F10.

Poleg tega je bila spojina 3 kontaminirana z majhnim številom nečistoč, za katere je bilo ugotovljeno, da so analogi maščobnih kislin z interpretacijo NMR spektroskopskih podatkov in LC/MS analize (dodatni materiali, slike S11–S15 in S23). Za identifikacijo aktivnosti nečistoč so bili izvedeni dodatni poskusi z analogi maščobnih kislin za njihove zaviralne učinke na IBMX-inducirano proizvodnjo melanina v celicah B16F10, kar je razkrilo, da testirane spojine niso imele belilnega učinka (dodatni materiali, slika S24). Čeprav ne moremo izključiti, da so nečistoče v spojini 3 odgovorne za zaviralni učinek na proizvodnjo melanina, ki ga povzroči IBMX, se to zdi malo verjetno.

3. Materiali in metode

3.1. Splošni eksperimentalni postopki

Infrardeči spektri so bili pridobljeni na spektrometru Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, ZDA). Spektri ionizacije z elektrosprejem in HR-ESIMS so bili izmerjeni na SI-2/LCQ DecaXP masnem spektrometru za tekočinsko kromatografijo (LC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). NMR spektri, vključno s poskusi 1H–1H COSY, HSQC in HMBC, so bili izvedeni z uporabo NMR spektrometra Varian UNITY INOVA 800 (Varian, Palo Alto, CA, ZDA), ki deluje pri 800 MHz (1H) in 200 MHz (13C), z kemijski premiki podani v ppm (δ). Preparativna HPLC je uporabila Waters 1525 Binary HPLC črpalko z Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, ZDA). Za kolonsko kromatografijo sta bila uporabljena silikagel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, ZDA) in silikagel RP-C18 (230–400 mesh, Merck). Semipreparativna HPLC je uporabila sistem Shimadzu Prominence HPLC s SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultravijolično–vidni (UV–Vis) detektorji (Shimadzu, Tokio, Japonska). LC/MS analize so bile izvedene na sistemu HPLC serije Agilent 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA), opremljeno z detektorjem diodnih nizov in masnim spektrometrom serije 6130 ESI z analitičnim Kinetexom (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Merckove plošče s silikagelom F254, predhodno prevlečene s silikagelom, in plošče RP-18 F254s so bile uporabljene za tanke -plastna kromatografija (TLC) Na TLC smo odkrili madeže pod UV svetlobo ali s segrevanjem po pršenju z raztopino anisaldehida in žveplove kisline.

3.2. Mikrobni material

Actinomadura sp. RB99 je bil izoliran s površine termitov iz rodu M. natalensis (kolonija Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) januarja 2{ {13}}10. Biomaterial smo dali v čiste plastične vrečke in predelali v enem dnevu po odvzemu. Termite smo oprali v sterilni deionizirani vodi in bakterije izolirali tako, da smo nastale suspenzije nasadili na gojišče z nizko vsebnostjo hranil s hitinom (na liter: 4 g hitina, 0.7 g K2HPO4, 0.3 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 in 20 g agarja) [21]. Izolate z morfologijo, podobno Actinobacteria, smo prenesli v agar ISP2 (na liter: 10 g ekstrakta slada, 4 g ekstrakta kvasovk, 4 g glukoze in 20 g agarja) in podgojili, dokler nismo dobili čistih izolatov.

3.3. Ekstrakcija DNK in pomnoževanje verižne reakcije s polimerazo

Actinomadura sp. RB99 smo gojili v s hranili bogatem tekočem mediju ISP2 pet do sedem dni pri 30 ◦C. Celice smo pobrali in genomsko DNK ekstrahirali z uporabo kompleta za čiščenje genomske DNK GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) po navodilih proizvajalca z naslednjimi spremembami: (a) zdravljenje z lizocimom je bilo podaljšano na 40 minut in (b) zdravljenje s proteinazo K je bilo podaljšano na 40 minut. DNK smo kvantificirali fotometrično z uporabo spektrometra Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Za filogenetske študije je bil gen 16S rRNA pomnožen z uporabo niza primerjev, 1492R/27F. Vsaka reakcija pomnoževanja je bila pripravljena v 25 µL končnem reakcijskem volumnu, ki je vseboval 7,25 µL destilirane vode, 5 µL HF pufra, 5 µL vsakega primerja (2,5 µM), {{10}}.5 µL dNTP (10 µM), 0,25 µL Phusion High-Fidelity DNA polimeraze (New England Biolabs, Ipswich, MA, ZDA) in 2 µL ekstrahirane DNA (šablona). Verižno reakcijo s polimerazo (PCR) smo izvedli pri naslednjih pogojih: 98 ◦C 38 s; 32 ciklov 98 ◦ za 30 s, 52 ◦C za 45 s, 72 ◦C za 1 min 20 s; in končno podaljšanje pri 72 ◦C za 8 minut. Produkt PCR smo vizualizirali z elektroforezo v agaroznem gelu in reakcije PCR smo očistili z uporabo kompleta za čiščenje PCR (Thermo Scientific). Fragmente DNA smo sekvencirali na GATC (Konstanz, Nemčija).

3.4. Sekvenciranje in identifikacija vrst

Sekvence so bile ocenjene glede čistosti in neujemanja z BioEdit [22]. Zaporedje naprej in nazaj, pridobljeno za vsak sev, je bilo sestavljeno z BioEditom in testirano na himere z DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Nastala zaporedja so bila deponirana v GenBank (pristopna številka: KY558684). Blastne analize s skoraj popolnimi sekvencami 16S rRNA (1368 bp) so bile izvedene z uporabo baze podatkov Nacionalnega centra za biotehnološke informacije (NCBI) (referenčne sekvence RNA). Rezultati so pokazali, da je sev RB99 član rodu Actinomadura. Zaporedja prvih 10 zadetkov so bila prenesena iz baze podatkov NCBI in poravnana z zaporedjem 16S rRNA Actinomadura sp. RB99 z uporabo storitve poravnave sekvenc Sina [23]. Dve različni filogenetski drevesi sta bili rekonstruirani s sosednjimi algoritmi ali algoritmi največje verjetnosti z uporabo programske opreme MEGA različice 7.0.26 [24–26]. Model evolucijske razdalje Tamure in Neija je bil uporabljen za generiranje evolucijskih matrik razdalje za algoritme največje verjetnosti in sosednjega združevanja z izbrisom popolnih vrzeli in manjkajočih podatkov [27]. Za algoritem največje verjetnosti je bila uporabljena diskretna porazdelitev gama (plus G), model variacije hitrosti pa je omogočil, da so bila nekatera mesta evolucijsko nespremenljiva (plus I). Za algoritem združevanja sosedov je bila variacija hitrosti med mesti modelirana z gama porazdelitvijo (plus G). Vrednosti zaupanja vozlišč so bile ovrednotene z analizami zagona na podlagi 1000 korakov ponovnega vzorčenja [28].

3.5. Ekstrakcija in izolacija

Actinomadura sp. RB99 smo gojili v 50 ml brozge ISP2 sedem dni pri 30 ◦C (predkultura) in uporabili za inokulacijo 100 plošč z agarjem ISP2. Plošče smo inkubirali 10 dni pri 30 °C, razrezali na majhne koščke, strdili in čez noč potopili v MeOH. Fazo MeOH smo filtrirali in uparili pod znižanim tlakom. Ekstrakt MeOH (20 g) smo raztopili v destilirani vodi (700 ml) in nato trikrat porazdelili s topilom z EtOAc (700 ml), kar je dalo 1,1 g ostanka. V EtOAc topno frakcijo (1,1 g) iz ekstrakta MeOH smo naložili na kolono s silikagelom (230–400 mesh) za kromatografijo in eluirali z gradientnim sistemom topil CH2Cl2-MeOH (100:1 do 1: 1, v/v). To je zagotovilo šest frakcij (A–F), ki so bile izpostavljene LC-UV/MS analizi. Analiza dereplikacije z uporabo interne UV spektralne knjižnice je nakazala obstoj manjših peptidnih analogov v frakciji E. Ti so prikazali preprost UV vzorec pri okoli 220 nm in edinstvene molekulske formule ionskih vrhov, ki vsebujejo dušikove atome. Polarno frakcijo E (233 mg) smo frakcionirali s preparativno HPLC z reverzno fazo (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, ZDA) z uporabo CH3CN/H2O (1:9 do 9:1, v /v, gradientni sistem, hitrost pretoka: 5 ml/min), da dobimo pet podfrakcij (E1–E5). Podfrakcijo E2 (27 mg) smo očistili s semi-preparativno HPLC z reverzno fazo (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) s 33 odstotki MeOH/H2O (izokratski sistem, hitrost pretoka: 2 ml/min). ), da dobimo spojino 1 (5,8 mg, tR=57.0 min). Spojini 2 (1,6 mg, tR=42.0 min) in 3 (1,5 mg, tR=55.0 min) smo izolirali iz podfrakcije E3 (15 mg) s polpreparativno reverzno fazo HPLC z eluiranjem 43 odstotkov MeOH/H2O (izokratni sistem, hitrost pretoka: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamid A (1)

3.5.2. Natalenamid B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Kislinska hidroliza spojin 1–3

Skupno količino 0,4 mg vsake spojine (1–3) smo hidrolizirali s 6 N HCl (500 µL) 1 uro pri 110 ◦C. Po ohlajanju na sobno temperaturo smo hidrolizate 1–3 uparili, da smo odstranili sledi HCl. Mešanicam hidrolizatov smo dodali destilirano vodo (500 µL) in jo nato uparili, da smo odstranili sledi HCl; ta postopek je bil izveden trikrat.

3.7. Določanje absolutne konfiguracije aminokislin v 1–3

Mešanice hidrolizatov (1–3), kot tudi standardne aminokisline (L/D-Leu, Glu, Phe in Val), smo raztopili v 1 N NaHCO3 (100 µL) in nato obdelali s 50 µL L-FDAA (10 mg/mL v acetonu). Zaporedoma smo vsak hidrolizat segrevali 10 minut pri 80 ◦C. Vsako zmes smo pogasili z 2 N HCl (50 uL) in koncentrirali v vakuumu. Ostanek smo raztopili v 300 µL MeOH. Vsak alikvot (5 µL), pridobljen iz zmesi hidrolizatov, je bil neposredno vbrizgan v LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, hitrost pretoka 0,3 ml/min) in celotno skeniranje v pozitivnem in negativnem ionskih načinov (območje skeniranja od m/z 100 do 1000) smo uporabili za identifikacijo retenzijskih časov L-FDAA-derivatiziranih aminokislin.

Mobilno fazo, sestavljeno iz mravljinčne kisline v destilirani vodi ({{0}}.1 % v/v) (A) in acetonitrila (B), smo prenašali s sistemom gradienta topil, kot sledi: 20–40 % (B) 10 min, 100 % (B) izokratično 5 min in nato 20 % (B) izokratično 5 min, da izvedemo postopek pranja kolone po ciklu. Retenzijski časi L-FDAA derivatiziranih aminokislin, uporabljenih kot standardi, so bili 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus ), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus ), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ) in 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ). Retenzijski časi derivatiziranih hidrolizatov 1–3 so bili L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) in L-Val (22,5 min) od 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) in L-Leu (25,6 min) od 2; in L-Glu (16,9 min) in L-Phe (25,7 min) od 3.

3.8. Citotoksični testi z uporabo rakavih celic

Celice MCF7, HeLa in A549 so bile kupljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (Rockville, MD, ZDA). Celice HepG2 so bile kupljene pri korejski banki celičnih linij (Seul, Koreja). Celice MCF7 smo gojili v mediju Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma. Celice HeLa in A549 smo gojili v Dulbeccovem minimalnem esencialnem mediju (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, ZDA), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma. Celice HepG2 smo gojili v minimalnem esencialnem mediju, dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma. Pogoji kulture so bili vzdrževani pri 37 ◦C v vlažni atmosferi, ki je vsebovala 5 odstotkov CO2. Citotoksičnost je bila testirana na teh štirih človeških celičnih linijah (MCF7, HeLa, A549 in HepG2) z uporabo kompleta za testiranje viabilnosti celic EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonska). Na kratko, 5 × 103 celic/vdolbinico smo zasejali v 96-plošče z vdolbinicami. Po 24 urah smo celice obdelali s spojinami v navedenih koncentracijah. Po 72 urah inkubacije smo uporabili komplet za testiranje viabilnosti celic EZ-CyTox. Po 2 urah inkubacije smo izmerili absorbanco pri 450 nm z referenčno vrednostjo pri 620 nm. Viabilnost celic je bila izračunana kot odstotek kontrole.

3.9. Protivnetno delovanje

Celična linija mišjega makrofaga RAW264.7 je bila kupljena pri American Type Culture Collection. Celice smo gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS), 100 enot/ml penicilina in 100 µg/ml streptomicina ter inkubirali pri 37 ◦C v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2. Preživetje celic je bilo izmerjeno s kompletom za odkrivanje preživetja celic Ez-Cytox. Celice smo 24 ur inkubirali v 96-ploščah z vdolbinicami pri koncentraciji 2500 celic na vdolbino in jih 24 ur obdelali z navedenimi koncentracijami spojin 1–3. Nato smo v vsako vdolbinico dodali reagente Ez-Cytox. Optično gostoto pri 450 nm smo izmerili po 1 uri z uporabo bralnika mikroplošč (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, ZDA) za oceno sposobnosti preživetja celic. V ločenem poskusu so bile celice RAW264.7 inkubirane v 96-ploščah z vdolbinicami pri koncentraciji 30,000 celic na vdolbinico 24 ur. Po 12-urnem stradanju v serumu so bile celice predhodno obdelane s spojinami 1–3 1 uro in nato 24 ur stimulirane z 1 µg/mL LPS. Absorpcijo gojišča kulture v Griessovi reakciji smo izmerili pri 540 nm z uporabo bralnika mikroplošč PowerWave XS za oceno ravni NO.

3.10. Merjenje vsebnosti melanina

Celična linija mišjega melanoma B16F10 je bila kupljena pri American Type Culture Collection. Celice smo gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS, 100 enotami/ml penicilina in 100 µg/ml streptomicina, in inkubirali pri 37 ◦C v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2. Celice B16F10 smo 24 ur inkubirali v 6 cm posodah za kulturo pri 250,000 celicah na jamico v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS, 100 µg/mL streptomicina in 100 U/mL penicilina. Celice smo dvakrat sprali s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) in jih nato stimulirali z IBMX ter inkubirali z različnimi koncentracijami spojin 1–3 ali kojične kisline (pozitivna kontrola) v mediju RPMI brez fenolnega rdečega, dopolnjenem z 10 odstotki FBS, 100 enot /ml penicilina in 100 µg/ml streptomicina 24 ur in 48 ur. Absorbanco gojišča smo izmerili pri 405 nm z uporabo bralnika mikroplošč PowerWave XS za oceno vsebnosti melanina. Rezultati so izraženi kot kratna sprememba v primerjavi s kontrolo (celice, ki niso stimulirane z IBMX).

3.11. Statistična analiza

Vsi podatki, vključno z viabilnostjo celic, NO in proizvodnjo melanina, so bili predstavljeni kot povprečna vrednost in standardni odklon (SD). Vsi testi so bili izvedeni v treh izvodih in ponovljeni vsaj trikrat. V tej študiji je bilo vključenih le nekaj ponovitev vsakega celičnega poskusa, zato je bila za statistično analizo sprejeta metoda neparametrične analize. Za statistično analizo vsake spremenljivke je bil uporabljen Kruskall–Wallisov test. Za vse analize je bil uporabljen statistični paket SPSS (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statistics version 21, Boston, MA, ZDA). Statistična pomembnost je bila upoštevana pri p-vrednosti, nižji od 0.05.

4. Sklepi

Naše poročilo vsebuje kemijsko analizo mikrobnih izolatov termitov, ki rastejo glive. Trije novi ciklični tripeptidi, natalenamidi A–C (1–3), so bili izolirani in strukturno karakterizirani iz juhe kulture Actinomadura sp. RB99 z uporabo metode dereplikacije, ki temelji na LC-UV/MS. Vse izolirane spojine so bile ovrednotene glede biološke aktivnosti z uporabo celičnih testov. Spojini 1 in 2 sta pokazali šibko citotoksičnost proti celicam HepG2 oziroma HeLa/A549. Nobena od izoliranih spojin ni pokazala pomembnih zaviralnih učinkov na proizvodnjo NO v celicah RAW264.7, stimuliranih z LPS. Spojina 3 je pokazala pomembne zaviralne učinke na sintezo melanina, posredovano z IBMX, na način, odvisen od odmerka. Učinek je bil podoben učinku kojične kisline, ki se uporablja kot kozmetični material z učinki beljenja kože.

Zahvala:

Zelo smo hvaležni Michaelu Thomas-Poulsenu (Oddelek za biologijo, Univerza v Kopenhagnu, Danska) za podporo pri našem terenskem delu.

Nasprotja interesov:

Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Reference

1. Newman, DJ; Cragg, GM Naravni izdelki kot viri novih zdravil od 1981 do 2014. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mišra, BB; Tiwari, VK Naravni izdelki: razvijajoča se vloga pri prihodnjem odkrivanju zdravil. EUR. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Naravni izdelki iz mikrobov, povezanih z žuželkami. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Bakterijski simbionti v kmetijskih sistemih so strateški vir za odkrivanje antibiotikov. J. Antibiot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Ponoven pojav naravnih izdelkov za odkrivanje zdravil v dobi genomike. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Celotna biosinteza: In vitro rekonstitucija poliketidnih in neribosomskih peptidnih poti. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, polien peroksid iz vzajemnega proizvajalca Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Sedi, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Spremenljive genetske arhitekture proizvajajo skoraj enake molekule v bakterijskih simbiontih mravelj, ki rastejo glive. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Nizka, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Racionalna zasnova inhibitorjev kalpaina na osnovi peptidomimetikov kalpastatina. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Ciklični tripeptidi iz halotolerantne glive Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Mošnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Novi pH-občutljivi ciklični peptidi. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosinteza psihrofilnega cikličnega tripeptida, ki vsebuje -nitro. J. Antibiot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Ciklična peptidna terapevtika: preteklost, sedanjost in prihodnost. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycin iz Streptomyces sp., povezanih s termiti. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavoni A–C, izoflavonoidni glikozidi iz Streptomyces sp., povezanih s termiti. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Makrotermicini A–D, glikozilirani makrolaktami iz Amycolatopsis sp., povezanega s termiti. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Izolacija, biosinteza in kemijske modifikacije rubterolonov A–F: redki tropolonski alkaloidi iz Actinomadura sp. 5–2. Chem. EUR. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, novi inhibitorji aminopeptidaze B. II. Razjasnitev strukture. J. Antibiot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramid, ciklični tripeptid iz vanuatujske gobe Reniera n. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Sredstva za hipopigmentacijo: posodobljen pregled bioloških, kemičnih in kliničnih vidikov. Pigm. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Raziskovanje potenciala za aktinobakterije kot obrambne simbionte v termitih, ki gojijo glive. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: uporabniku prijazen urejevalnik in program za analizo bioloških zaporedij za Windows 95/98/NT. Nukleinske kisline Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Natančna visokozmogljiva poravnava več zaporedij genov ribosomske RNA. Bioinformatika 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Metoda sosednjega združevanja: nova metoda za rekonstrukcijo filogenetskih dreves. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Evolucijska drevesa iz zaporedij DNK: pristop največje verjetnosti. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Analiza molekularne evolucijske genetike, različica 7.0 za večje nabore podatkov. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Ocena števila nukleotidnih substitucij v kontrolni regiji mitohondrijske DNA pri ljudeh in šimpanzih. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Meje zaupanja v filogeniji: pristop z uporabo zagonskega sistema. Evolucija 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Razpoložljivost vzorcev:

Vzorci spojin niso na voljo pri avtorjih.

For more information:1950477648nn@gmail.com