Polisaharidi žižole ublažili anemijo pri podganah s kronično ledvično boleznijo

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang, et al

Povzetek

Polisaharidi žižule (JP) so eden od aktivnih glikanov iz hrane v prehranskem sadju Ziziphus jujuba, ki velja za zdravljenje pomanjkanja krvi. V tej študiji je akroničnoledvicabolezen(CKD) podganji model je bil uporabljen za oceno učinka JP in njegovega mehanizma na anemijo, povezano s CKD. Pri podganah s kronično ledvično boleznijo se je zdravljenje z JP znatno izboljšaloledvicafunkcijo, ledvicapatološkopoškodbain hematološke parametre, vključno z zvišanjem števila rdečih krvnih celic, hemoglobina, hematokrita in trombocitov. Poleg tega so rezultati ciljne metabolomike LC-MS/MS pokazali, da je JP spodbujal sproščanje kratkoverižnih maščobnih kislin (SCFA) pri podganah s kronično ledvično boleznijo. Poleg tega je JP zamenjal raven serumskega eritropoetina (EPO), ledvično EPO mRNA inledvicaEPO protein preko HIF- signalizacije. Ti rezultati skupaj zagotavljajo dokaze, da je učinek JP na anemijo, povezano s kronično ledvično boleznijo, lahko vključen v regulacijo sproščanja SCFA in proizvodnje eritropoetina, kar podpira nadaljnji razvoj JP kot prehranskih dopolnil pri zdravljenju anemije, povezane s kronično ledvično boleznijo.

Ključne besede: polisaharidi žižolekroničnoledvica bolezenAnemija Eritropoetin Faktor, ki ga povzroči hipoksija - Kratkoverižne maščobne kisline

Kliknite tukaj za več informacij o Cistanche

1. Uvod

kroničnoledvica bolezen(CKD) je opredeljen kot klinični sindrom ledvičnih strukturnih nepravilnosti ali funkcionalnih okvar in postaja vse večje breme javnega zdravja po vsem svetu (Webster, Nagler, Morton in Masson, 2017). Ledvična anemija je med najpogostejšimi zapleti kronične ledvične bolezni, ki prispevajo k povečanemu tveganju smrti (Locatelli et al., 2019). Nezadostna proizvodnja eritropoetina (EPO) je priznan glavni dejavnik anemije pri KLB (Pappa, Dounousi, Duni in Katopodis, 2015). EPO nastaja v jetrih inledvica, ki je bistvenega pomena za proizvodnjo eritrocitov (Lappin & Lee, 2019). V hipoksičnih pogojih lahko faktor, inducibilen s hipoksijo (HIF), aktivira izražanje EPO (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019). Ciljanje na HIF za induciranje proizvodnje EPO je tako veljalo za novo terapevtsko strategijo za zdravljenje anemije, povezane s KLB.

Žižola je plod rastline Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), znan tudi kot kitajski datelj. Žižola se že tisoče let tradicionalno uporablja kot zdravilna rastlina in prehransko dopolnilo. Žižola se uporablja kot dodatek k zdravju ljudi, ki imajo hematogeno ali kronično podhranjenost. Polisaharidi žižole (JP), vodotopna komponenta, sestavljena iz različnih razmerij monosaharida in uronske kisline (Ji, Hou, Yan, Shi in Liu, 2020), so ena od aktivnih sestavin v žižoli (Ji et al., 2017). ), za katerega je bilo dobro sprejeto, da kaže hepatoprotektivni učinek in imunomodulatorno aktivnost ter krepi delovanje črevesne pregrade (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). Pravzaprav se za JP pogosto šteje, da ima potencialne učinke na anemijo. Vendar pa je molekularni mehanizem JP pri zdravljenju anemije še vedno manj znan.

V zadnjih letih se metabolomika pogosto uporablja za razumevanje potencialnih dejavnikov, ki prispevajo k napredovanju bolezni. Ciljna metabolomika se pogosto uporablja pri identifikaciji molekularnih označevalcev kompleksnih človeških bolezni, kot je kronična ledvična bolezen. Preverjeno je bilo, da sta indoksil sulfat (IS) in p-krezil sulfat (PCS) biomarkerja napredovanja kronične ledvične bolezni (Meijers & Evenepoel, 2011), povečana stopnja trimetilamin-N-oksida (TMAO) pa lahko neposredno vodi v ledvično tubulointersticijsko fibrozo in disfunkcijo. (Tang et al., 2015). Kratkoverižne maščobne kisline (SCFA), presnovki, odvisni od črevesnih mikrobov, so energijski substrati, ki lahko vplivajo na različne fiziološke procese (LeBlanc et al., 2017), in poročali so, da zmanjšanje SCFA prispeva k napredovanju kronične ledvične bolezni. (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary in B¨ ackhed, 2016, Wang et al., 2019). Poleg tega so SCFA lahko zaščitile strukturo ledvic pred poškodbami z zaviranjem oksidativnega stresa (Li, Ma in Fu, 2017). Sočasno je bilo ugotovljeno, da imajo SCFA ugoden učinek na absorpcijo železa in povečajo ekspresijo embrionalnih/fetalnih globinskih genov, kar inducira eritropoezo in popravi anemijo (Tako, Glahn, Knez in Stangoulis, 2014). Mehanizem delovanja SCFA pri ledvični anemiji pa je treba še pojasniti.

V tej študiji domnevamo, da bi JP lahko reguliral sproščanje SCFA in stimuliral proizvodnjo EPO, ki jo posreduje HIF, katerega rezultat je popraviti ledvično anemijo. Tukaj bomo raziskali učinek JP pri izboljšanju ledvične anemije pri 5/6 podganah s kronično ledvično boleznijo, povzročenih z nefrektomijo, vključno z ledvičnimi funkcijami in hematološkimi parametri. Ciljni metabolomični pristop z uporabo LC-MS/MS je razvit za določanje osmih SCFA, vključno z ocetno kislino, propanojsko kislino, izomasleno kislino, masleno kislino, 2-metil masleno kislino, izovalerijsko kislino, valerijansko kislino in heksanojsko kislino v fekalnih in vzorcev ledvic, ravni ciljnih SCFA pa so ocenjene pri zdravih podganah in podganah s kronično ledvično boleznijo. Poleg tega je razkrita tudi vpletenost signalizacije HIF pri podganah, zdravljenih z JP.

Slika 1. Tipična GC-MS kromatografija JP. (A) Strukturne formule monosaharidov po derivatizaciji aldononitril acetata; (B) Reprezentativni profili GC-MS mešane ionske kromatografije (MIC) mešanice standardnih monosaharidov in hidroliziranih monosaharidov JP. Vrhovi v kromatografskih profilih so ustrezali kemijskemu markerju, prikazanemu v (A): 1. ramnoza, 2. arabinoza, 3. fukoza, 4. ksiloza, 5. manoza, 6. glukoza, 7. galaktoza, 8. inozitol (ISTD ).

2. Materiali in metode

2.1. Priprava polisaharida žižole

Plodovi Z. jujuba so bili kupljeni pri Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Materiale je potrdil dr. Jianping Chen v skladu s farmakopejo Ljudske republike Kitajske izdaja 2015. Vzorce bonov so hranili v bolnišnici tradicionalne kitajske medicine Shenzhen pod številko 18100601.

Surovi JP je bil ekstrahiran iz žižole, kot je opisano prej, z manjšimi spremembami (Ji et al., 2020). Na kratko, žižole smo 3 ure inkubirali z 10 volumskimi volumni vode (v/w) v vodni kopeli pri 80 ◦C in 3-krat ekstrahirali. Po filtraciji združite filtrate in to kombinacijo kondenzirajte v rotacijskem uparjalniku pod nadzorovanim vakuumom. Raztopino koncentrata smo nadalje oborili z dodajanjem štirikratnega etanola (v/v) pri 4 ◦C 12 ur. Oborino smo zbrali s centrifugiranjem in posušili pod znižanim tlakom do suhega, da smo dobili surovi JP. Čistost JP je bila s kalorimetrijo določena na 80 odstotkov.

2.2. Karakterizacija monosaharidne sestave polisaharida žižole

Sistem Shimadzu GC–MS (Shimadzu GC–MS TQ8040 povezan s Shimadzu GC 2010 plus), opremljen z virom EI, kapilarno kolono SH-Rxi-5Sil MS (30 m × 0,25 mm ID, 0,25 µm debelina filma, Shimadzu) smo uporabili za določanje derivatiziranih hidroliziranih monosaharidov z razmerjem delitve 10:1. Temperatura vbrizgavanja, izvora ionov in vmesnika je bila 250 ◦C, 200 ◦C in 250 ◦C. Začetno temperaturo kolone smo 1 minuto vzdrževali pri 120 ◦C, nato jo povečali pri 15 ◦C/min na 160 ◦C in vzdrževali 4 minute, 2 ◦C/min do 165 ◦C in vzdrževali 2 minuti, 20 ◦C /

min do 195 ◦C, 5 ◦C/min do 250 ◦C in vzdržujemo 3 minute. Hitrost pretoka nosilnega plina helija je bila vzdrževana pri 46 cm/s in v instrument je bilo vbrizgano 2 μL vsakega vzorca. Analiti so bili kvantificirani v načinu izbranega spremljanja ionov (SIM), ciljni ion: ramnoza (m/z 129.00), arabinoza (m/z 115.00), fukoza (m/ z 103.00), ksiloza (m/z 115.00), manoza (m/z 115.00), glukoza (m/z 115.00 ), galaktoza (m/z 115.00), inozitol (m/z 126.00). Standardi monosaharidov so bili navedeni na naslednji način: L (plus)-arabinoza (1506–200202), fukoza (112014–201902), D-ksiloza (111508–201605), D-glukoza (110833–201908), ramnoza (111683–201502). ), galaktoza (100226–201807), D-manoza (140651–201805) so bile kupljene pri Nacionalnih inštitutih za nadzor hrane in zdravil. Inozitol je bil pridobljen iz Sigme (I7508-50 g).

Ekstrahiran JP (10 mg) smo hidrolizirali v monosaharide z 10 ml 2 mol/L trifluoroocetne kisline (TFA) pri 105 ◦C 3 ure, hidrolizirane monosaharide iz JP pa smo koncentrirali in sprali pod znižanim tlakom pri 60 ◦C do odstranimo TFA in ostanke rekonstituiramo z 2 ml vode. Dodali smo 250 µL raztopine 20 mg/ml hidroksilamin hidroklorida/piridina v 100 µL raztopine hidroliziranih monosaharidov in hranili v vodni kopeli pri 90 °C 45 minut. Nato smo dodali 250 µL anhidrida ocetne kisline in ga držali v vodni kopeli pri 90 °C še 45 minut. Na koncu reakcije zmes 5-krat ekstrahiramo z 1 ml cikloheksana in plast cikloheksana koncentriramo na 1 ml. Vbrizgal 1 µL supernatanta v GC-MS za analizo (Li & Shi, 2013).

2.3. Živali

Vsi poskusi so bili izvedeni s protokoli, ki jih je odobril Odbor za institucionalno oskrbo živali Univerze kitajske medicine Guangzhou. Podgane Sprague–Dawley, samci in samice, težke 180–220 g, so bile pridobljene iz Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Foshan, Kitajska, dovoljenje št. SCXK (Yue) 2008–0002) in vzdrževane v posebnem okolju brez patogenov (SPF). ) objekt za živali pod 12-urnim ciklom svetlo-temno, s prosto hrano in vodo.

Za inducirano odpoved ledvic je bila izvedena 5/6 nefrektomija v skladu s prejšnjim opisom (Chen et al., 2019). Vsi kirurški posegi so bili izvedeni pod anestezijo z 10-odstotnim kloralhidratom. Skupina za navidezno operacijo (n=6) je storila enake korake, da je odprla trebušno votlino in razkrila ledvico. Podgane z nefrektomijo 5/6 so bile naključno razdeljene v dve skupini. Podgane brez zdravljenja (skupina CKD, n=6) in podgane, ki so prejemale JP (skupina CKD plus JP, n=6) ​​peroralno z gavažo v odmerku 1,2 g/kg/dan. Po 90 dneh delovanja se je začelo 90 dnevno upravljanje. 90. dan je bil zadnji čas dajanja JP podganam in po 24 urah so bile živali žrtvovane z odvzemom krvi iz trebušne aorte in od vsake podgane so bili zbrani vzorci urina, blata, seruma in ledvic. Vse vzorce smo pred nadaljnjo analizo shranili pri – 80 ◦C.

2.4. Biokemična analiza

Po navodilih proizvajalca sta bila dušik sečnine v krvi (BUN) in serumski kreatinin (Scr) izmerjena s kompletom za odkrivanje kreatinina v serumu in kompletom za odkrivanje BUN (WAKO, Ginza, Japonska), beljakovine v urinu pa so bile izmerjene s kompletom Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanjing, Kitajska). Rdeče krvne celice (RBC), hemoglobin (Hb), hematokrit (HCT) in število trombocitov (PLT) so analizirali Hematološki sistemi (Siemens 2021i, Erlangen, Nemčija) v skladu z navodili proizvajalca.

2.5. Histološki pregled

Barvanje s periodično kislino po Schiffu (PAS) in Massonu je bilo uporabljeno za oceno ledvične patološke poškodbe, med njimi je bilo barvanje s PAS uporabljeno za odkrivanje ledvične tubularne atrofije in glomerularnega območja, barvanje po Massonu pa je bilo za ledvično intersticijsko fibrozo (Xie et al. , 2020). Metoda kvantitativne analize je bila izvedena v skladu s prejšnjimi študijami (Chen et al., 2019). Na kratko, ocena tubularne atrofije pri barvanju s PAS je bila opredeljena takole: 1. redki enojni atrofični tubul; 2. več skupkov atrofičnih tubulov; 3. masivna atrofija. Glomerularno območje je bilo izmerjeno s programsko opremo ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Nemčija). Fibrotično območje pri obarvanju po Massonu je bilo izmerjeno s programsko opremo Image J (NIH, Bethesda, MD, ZDA). Vsaj deset mikroskopskih polj (200 ×) po 6 podgan na skupino je bilo naključno zajetih za merjenje ocene atrofije, glomerularnega območja in fibrotičnega območja, z vsaj enim glomerulom v vsakem mikroskopskem polju.

2.6. Imunohistokemijska analiza

Ledvični parafinski odsek (4 μm) iz vsakega vzorca je bil dvakrat postopno dehidriran s ksilenom in gradientnim etanolom (100–95–90–80–70 odstotkov), antigen je bil pridobljen s pufrom citronske kisline (pH 6,0). ) 30 minut, blokiran s 3-odstotnim vodikovim peroksidom 10 minut in kozjim serumom 30 minut pri sobni temperaturi. Odseke tkiva smo inkubirali ločeno s primarnim protitelesom HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, serija: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1: 500, serija: BJ2044786) pri 4 °C 10 h in HRP konjugirano kozje anti-kunčje sekundarno protitelo (Abcam, ab6712, 1:1000) pri sobni temperaturi 30 minut, DAB (diaminobezid in) smo uporabili za Za odkrivanje aktivnosti HRP je bilo jedro kontrastno obarvano s hematoksilinom. the. Imunohistokemijo smo analizirali pod mikroskopskimi polji 400× iz vsake skupine in fiksirali lestvico=20 μm z Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Nemčija. Jedro je bilo modro obarvano s hematoksilinom in imunopozitivnost DAB je bila rjava, globlje obarvanje z DAB pomeni močnejšo imunohistokemijsko pozitivno.

2.7. Odkrivanje EPO

Vsebnost EPO v serumu je bila odkrita s kompletom ELISA (Abcam, ab274398), poskus pa se je nanašal na protokol kompleta ELISA. Kot povzeto, smo v vzorec dodali koktajl protiteles EPO in inkubirali 1 uro. po inkubaciji vsako vdolbino 3-krat sprali s pufrom za izpiranje, v drugo inkubirali 15 minut dodali TMB in zaustavili reakcijo.

Celotno ledvično mRNA smo ekstrahirali iz zamrznjenega ledvičnega tkiva z uporabo Trizola in prevedli mRNA v cDNA. PCR v realnem času je bil izveden z Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ZDA, K0223) v skladu s protokolom proizvajalca. Zeleni signal SYBR je bil pridobljen in izmerjen s sistemom za zaznavanje zaporedja ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primerja sta bila: 5'-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3' in 5'-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3' za EPO podgan (214 bps, NM_017001). 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ in 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ za GAPDH (181 bps, NM_017008.3), housekeeping gens kot notranji nadzor v vseh primerih. Relativno kvantifikacijo genske ekspresije smo izračunali z metodo normalizirane genske ekspresije (2− ΔΔCT).

Enako količino beljakovin iz lizatov ledvične skorje smo naložili in ločili z 10-odstotnim SDS gelom in nato prenesli na nitrocelulozne membrane. Potem ko so bile membrane 2 uri blokirane v 5-odstotnem nemastnem mleku pri sobni temperaturi, so bile membrane inkubirane s primarnim protitelesom pri 4 ◦C čez noč. Nato so bile membrane inkubirane s HRP (hrenovo peroksidazo) proti mišjim IgG (Life Technologies) pri sobni temperaturi 45 minut. Aktivnost HRP je bila vizualizirana s substratom Clarity Western ECL in analizirana s sistemom za slikanje Tanon. V tej študiji so bila uporabljena naslednja primarna protitelesa: monoklonski EPO (B- 4) iz miši (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, razredčitev 1/500), monoklonski -aktin iz miši (tehnologija celične signalizacije, 8H10D10, razredčitev 1/1000).

2.8. Analiza kratkoverižnih maščobnih kislin

Sistem Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045, povezan s Shimadzu LC-20AD), opremljen z virom ESI.

Kromatografsko ločevanje smo izvedli na koloni Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm) z uporabo {{10}}.1 % mravljinčne kisline v vodi ( topilo A) in acetonitril (topilo B) pri hitrosti pretoka 0,3 ml/min z gradientno elucijo: 0–9 min, 25–30 odstotkov B; 9–11 min, 30–40 odstotkov B; 11–20 min, 40–50 odstotkov B; 20–20,1 min, 50–100 odstotkov B; 20,1–23 min, 100 odstotkov B; 23,1 min–25 odstotkov B za ponovno uravnoteženje. Temperatura kolone je bila 35 ◦C, avtovzorčevalnik pa je bil med analizo vzdrževan pri 4 ◦C, v instrument smo vbrizgali 1 μL vsakega vzorca. Detekcija analita je bila izvedena v načinu spremljanja več reakcij (MRM), ki je deloval v načinu pozitivnih ionov. Parametri MS: pretok nebulizirajočega plina: 3,0 L/min; Pretok sušilnega plina: 10 L/min; Ogrevanje Pretok plina: 10 L/min; DL temperatura: 250 ◦C; temperatura vmesnika: 300 ◦C; Grelni blok: 400 ◦C. Prehodi MRM in energija trkov (CE) so bili izbrani in optimizirani z neposredno infuzijo vsakega standardnega derivata. Prehodi MRM za količine analitov so bili povzeti v tabeli S1.

Fekalne SCFA: 100 μl 50-odstotnega acetonitrila dodamo v 3 mg liofiliziranega blata in vrtinčimo 2 minuti. Nato zmes centrifugiramo pri 12000 obratih na minuto 10 minut pri 4 ◦C in odpipetiramo supernatant.

SCFA za ledvice: 100 mg ledvičnega tkiva stehtamo in vrtinčimo na ledu s 4-kratno fiziološko raztopino (100 mg/400 μl), da pripravimo tkivni homogenat. Dodali smo 3-krat hladen metanol v 300 μL tkivnega homogenata in vrtinčili 2 minuti, nato smo mešanico centrifugirali pri 12000 obratih na minuto 10 minut pri 4 ◦C in odpipetirali supernatant. Supernatant je bil posušen z N2 in rekonstituiran s 100 μL 50-odstotnega acetonitrila.

Dodanih 500 mmol/L N-(3-dimetil aminopropil)-Ń -etil karbodiimid hidroklorida (EDC, Aladdin, Šanghaj, Kitajska), 50 mmol/L 3H-[1,2,3]-Triazolo[4, 5-b] piridin-3-ol (HOAT, Aladdin, Šanghaj, Kitajska) in 50 mg/mL 12C-dansilhidrazina (12C-DnsHz, J&K, Peking, Kitajska) v 20 μL ekstrakcije vzorca v zaporedje z enako glasnostjo. EDC in HOAT sta bila pripravljena s svežo 500 mmol/L 2-(N-morfolino) etansulfonsko kislino (MES, Macklin, Šanghaj, Kitajska). Po 90-minutni inkubaciji pri 20 °C smo zmesi dodali 20 μL 50 mmol/L CuCl2 (Macklin, Šanghaj, Kitajska), da smo dušili reakcijo derivatizacije pri 40 °C 30 minut (Zhao & Li, 2018). Ob koncu derivatizacije zmes 10-krat razredčimo s 25 odstotnim acetonitrilom. Pred analizo smo 100 μL supernatanta zmešali s 100 μL raztopine internega standarda. Oznaka 13C-DnsHz je bila uporabljena kot notranji standard (ISTD1-8) v skladu z isto reakcijo derivatizacije. Standard SCFA: ocetna kislina (AA, A116173), propanojska kislina (PA, P110446), izomaslena kislina (IBA, I103524), maslena kislina (BA, B110438), 2-metil maslena kislina (2- BA, M107377), izovalerijanska kislina (IVA, I108280), valerijanska kislina (VA, V108271), heksanojska kislina (HA, H103632) so bile dobavljene iz Aladdina (Šanghaj, Kitajska).

2.9. Statistična analiza

Podatki vsake skupine so bili izraženi kot povprečje ± standardni odklon (SD). Statistična značilnost med skupinami je bila izvedena z enosmerno ANOVA in post hoc analizo s Student-Newman-Keuls (SNK) testom ali Dunnettovim T3 testom. Vrednost P < 0.05="" je="" veljala="" za="" statistično="" pomembno.="" vsi="" podatki="" so="" bili="" izvedeni="" s="" programsko="" opremo="" za="" statistiko="" spss="" (različica="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

3. Rezultati

3.1. JP je izboljšal delovanje ledvic podgan s kronično ledvično boleznijo

Monosaharid JP je bil karakteriziran pred zdravljenjem na živalih. JP, uporabljen v tej študiji, je bil sestavljen iz sedmih monosaharidov, to je ramnoze (1,62 odstotka), arabinoze (15,79 odstotka), fukoze (0.21 odstotka), ksiloze (4,56 odstotka), manoze (3. 00 odstotkov), glukoza (73,44 odstotka) in galaktoza (4,99 odstotka) (slika 1). Naša analizna metoda je bila potrjena z linearnostjo, natančnostjo, ponovljivostjo, stabilnostjo in obnovitvijo (tabele S2–S3). Potrjeno je bilo, da so analiti stabilni pri sobni temperaturi 24 ur. Izkoristek JP mora biti višji od 8,63 odstotka, čistost pa najmanj 77,16 odstotka. Zgoraj omenjena kemična analiza JP je služila kot pristop k nadzoru kakovosti za zagotovitev ponovljivosti spodnjih študij na živalih.

Scr, BUN in beljakovine v urinu so bile najbolj reprezentativne za delovanje ledvic. Raven scr, BUN in beljakovin v urinu pri podganah s kronično ledvično boleznijo je bila znatno višja kot pri lažni skupini (P < {{0}}.01).="" po="" 90="" dneh="" zdravljenja="" z="" jp="" so="" se="" ravni="" scr,="" bun="" in="" beljakovin="" v="" urinu="" znižale="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo="" (p=""><0,01) (sl.="">

3.2. JP je izboljšal ledvično patološko poškodbo pri podganah s kronično ledvično boleznijo

Teža celotne desne ledvice za lažno skupino in ostanka desne ledvice za CKD in CKD plus JP skupini sta bili uporabljeni za oceno morfologije ledvic glede na težo ledvic (KW) in težo ledvic/telesno težo (KW/TM). Na koncu poskusov sta bila KW in KW/TT skupine s kronično ledvično boleznijo povečana v primerjavi z navidezno skupino (vsi P < {{0}}.05).="" v="" modelu="" kronične="" ledvične="" bolezni,="" povzročene="" z="" nefrektomijo="" 5/6,="" je="" zmanjšanje="" aktivnosti="" ledvične="" proteinaze="" povzročilo="" kompenzacijsko="" rast="" ledvic,="" družbe="" z="" ledvično="" hipertrofijo="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" in="" to="" izjavo="" smo="" potrdili.="" po="" zdravljenju="" z="" jp="" se="" je="" kw="" znatno="" zmanjšal="" (p="">< 0.05)="" in="" zaprl="" za="" lažno="" skupino="" (p="" ˃="" 0.05);="" medtem="" ko="" se="" je="" kw/bw="" rahlo="" zmanjšal="" (p="" ˃="" 0,05).="" (slika="">

Slika 2. JP je zaščitil delovanje ledvic pri podganah s kronično ledvično boleznijo. Raven Scr (A), BUN (B) in beljakovin v urinu (C) v različnih skupinah. (D) teža ledvic, (E) KW/TT. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD, n=6 na skupino (**P < 0.01="" v="" primerjavi="" z="" lažno="" skupino;="" #p="">< 0).05="" ,="" ##p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="">

V skupini s kronično ledvično boleznijo je bila ledvična tubula v primerjavi z navidezno skupino pokazala veliko atrofijo (P < {{0}}.01),="" območje="" glomerulov="" in="" ledvična="" intersticijska="" fibroza="" pa="" sta="" bili="" skoraj="" dvakrat="" večji="" kot="" tisti="" za="" navidezno="" skupino="" v="" kvantitativni="" analizi="" (p="">< 0.01).="" po="" zdravljenju="" z="" jp="" se="" je="" rezultat="" tubularne="" atrofije="" zmanjšal="" za="" skoraj="" dvakrat="" (p=""><0,01), območje="" glomerulov="" se="" je="" skoraj="" vrnilo="" v="" lažno="" skupino="" (p=""><0,01), ledvična="" intersticijska="" fibroza="" pa="" se="" je="" zmanjšala="" za="" eno="" tretjino="" (p=""><0,01) kot="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo="" (slika="">

Slika 3. JP je zaščitil strukturo ledvic pri podganah s kronično ledvično boleznijo. (A) PAS barvanje. (B) Barvanje po Massonu. (C) Ocena tubularne atrofije. (D) Glomerularno območje (E) Fibrotično območje. Vse slike so predstavljene z enako povečavo, 200×, lestvica=100 μm. Podatki so bili predstavljeni kot povprečja ± SD, n=6 na skupino (**P < 0.01="" v="" primerjavi="" z="" navidezno="" skupino;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo="">

3.3. JP je moduliral hematološke parametre pri podganah s kronično ledvično boleznijo

Za hematološke parametre smo izmerili biokemično analizo RBC, Hb, HCT in PLT. Pri podganah s kronično ledvično boleznijo se je raven eritrocitov znižala z 9.06 na 7,20 × 1012 /L, Hb s 15,28 na 13,22 g/dL, HCT s 47,1 na 40,4 odstotka, PLT pa se je zvišal od 1012 do 1526 × 109 /L v primerjavi z lažno skupino (P <0,01), kar="" je="" pokazalo,="" da="" so="" znake="" anemije="" opazili="" pri="" podganah="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo.="" znižane="" ravni="" rbc,="" hb,="" hct="" in="" plt="" pri="" podganah="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo,="" zdravljenih="" z="" jp,="" so="" bile="" obnovljene="" (p=""><0,01) (slika="">

Slika 4. JP je rehabilitiral hematološke parametre pri podganah s kronično ledvično boleznijo. Raven PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD, n=6 na skupino (**P < 0.01="" v="" primerjavi="" z="" lažno="" skupino;="" #p="">< 0).05="" ,="" ##p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="">

3.4. JP je stimuliral izražanje EPO

V primerjavi z lažno skupino sta se raven EPO v serumu in količina mRNA EPO v ledvicah znatno zmanjšali pri podganah s kronično ledvično boleznijo in anemijo (P < 0.01).="" western="" blotting="" analiza="" je="" pokazala,="" da="" se="" je="" raven="" proteina="" epo="" rahlo="" zmanjšala="" v="" skupini="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo="" brez="" pomembne="" razlike.="" po="" zdravljenju="" z="" jp="" so="" se="" raven="" epo="" v="" serumu,="" mrna="" ledvične="" epo="" in="" beljakovine="" znatno="" povečale="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo="" (p="">< 0.01="" ali="" p="">< 0,05)="" (sl.="">

V ledvični skorji so HIF-1 v glavnem proizvajale epitelne celice ledvičnih tubulov, HIF-2 pa se je izražal predvsem v endotelijskih celicah in ledvičnih intersticijskih fibroblastih (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019). Imunohistokemijska analiza je pokazala, da so bili tubulari pri podganah s kronično ledvično boleznijo močneje obarvani kot pri lažni skupini. Po zdravljenju z JP je imel ledvični tubular močnejše in večje območje obarvanja v primerjavi s skupino s kronično ledvično boleznijo, kot je prikazano z rdečo puščico na sliki 5E. HIF-2 je pokazal razmeroma šibek imunohistokemijski pozitiven ledvični intersticij v skupini Sham. V skupini s kronično ledvično boleznijo je bil HIF-2 imunohistokemično pozitiven. Po zdravljenju z JP je HIF-2 pokazal močnejšo imunohistokemijo v primerjavi s skupino s kronično ledvično boleznijo (slika 5F).

Slika 5. JP je stimuliral izražanje EPO. (A) Vsebnost EPO v serumu. (B)LedvicaEPO relativna mRNA. GAPDH je veljal za gospodinjski gen. (C) Reprezentativne Western blot slike ekspresije proteina EPO. (D) Denzitometrična analiza EPO. (E) Imunohistokemija HIF{{0}}. (F) Imunohistokemija HIF- 2, normalizirana na vsebnost -aktina. Imunohistokemijske slike so predstavljene pri enaki povečavi, 400×, lestvica=20 μm. Jedro je bilo modro obarvano s hematoksilinom in imunopozitivnost DAB je bila rjava, globlje obarvanje z DAB pomeni močnejšo imunohistokemijsko pozitivno. Rdeča puščica kaže na pozitivno imunohistokemijo. Podatki so bili predstavljeni kot povprečja ± SD, n=6 na skupino (*P < 0,05="" v="" primerjavi="" z="" navidezno="" skupino;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="">

3.5. JP je sprožil sproščanje SCFA

Za kvantificiranje sproščanja osmih SCFA v fekalnih vzorcih je bil razvit pristop ciljne metabolomike, ki temelji na LC-MS. Uveljavljeno metodo smo validirali z oceno linearnosti, občutljivosti, natančnosti, matričnega učinka, točnosti in stabilnosti. Vzorci za nadzor kakovosti z nizko, srednjo in visoko koncentracijo (LQC, QMC, HQC) za validacijo občutljivosti, natančnosti, točnosti in stabilnosti so bili izbrani glede na najnižjo, srednjo in najvišjo koncentracijsko točko matrične standardne krivulje, rezultati pa so bili prikazani v tabelah S4–S6. Potrjeno je bilo, da so analiti stabilni pri 4 ◦C 48 ur. LC-MS/MS kromatogram SCFA je prikazan na sliki 6.

Slika 6. UHPLC-MS/MS kromatografija SCFA. (A) Zgornja je bila kemijska enačba derivatizacije SCFA; pod je bila strukturna formula SCFA po derivatizaciji dansilhidrazina; (B) Kromatogram UHPLC/MRM-MS mešanih standardov in fekalnega vzorca, kromatografski vrhovi v (B) so ustrezali kemijskemu markerju, prikazanemu v (A):1. 12C-ocetna kislina; 2. 13C-ocetna kislina (ISTD1); 3. 12C-propanojska kislina; 4. 13C-propanojska kislina (ISTD2); 5. 12C-izomaslena kislina; 6. 12C-maslena kislina; 7. 13C-izomaslena kislina (ISTD3); 8. 13C-maslena kislina (ISTD4); 9. 12C-2-metilmaslena kislina; 10. 12C-izovalerijanska kislina; 11. 12C valerijanska kislina; 12. 13C-2-metilmaslena kislina (ISTD5); 13. 13C-izovalerijanska kislina (ISTD6); 14. 13C-valerijanska kislina (ISTD7); 15. 12C-heksanojska kislina; 16. 13C-heksanojska kislina (ISTD8).

Kar se tiče fekalnega vzorca, so bile v skupini s kronično ledvično boleznijo ravni AA in PA opazno znižane skoraj 4-krat in 5-krat v primerjavi z navidezno skupino (P < 0.01);="" medtem="" ko="" so="" bile="" po="" zdravljenju="" z="" jp="" količine="" aa="" in="" pa="" obnovljene="" nazaj="" na="" 4/5="" lažne="" skupine="" (p="">< {{10}}.01).="" podobno="" sta="" se="" ravni="" ba="" in="" va="" močno="" znižali="" skoraj="" 3{19}}-krat="" in="" 4-krat="" v="" skupini="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo="" v="" primerjavi="" z="" lažno="" skupino="" (p="">< 0.01).="" zdravljenje="" jp="" je="" pokazalo="" trend="" naraščanja,="" vendar="" ne="" bistvenega="" izboljšanja.="" vsebina="" iba,="" iva="" in="" 2-ba="" ni="" pokazala="" opazne="" spremembe="" med="" ckd="" in="" lažno="" skupino.="" po="" zdravljenju="" z="" jp="" se="" je="" raven="" iba,="" iva="" in="" 2-ba="" povečala="" (p=""><0,01). vendar="" ha="" ni="" pokazal="" očitne="" spremembe="" med="" tremi="" skupinami="" (slika="" 7a).="" še="" več,="" kar="" zadeva="" ledvično="" tkivo,="" so="" bile="" v="" skupini="" s="" kronično="" ledvično="" boleznijo="" vse="" količine="" osmih="" scfa="" pomembno="" zmanjšane="" (p=""><0,01), medtem="" ko="" so="" se="" po="" zdravljenju="" z="" jp="" ravni="" scfa="" zvišale,="" razen="" za="" ba="" in="" ha="" (p=""><0,01 ali="" p="">< 0,5).="" ba="" je="" bil="" nekoliko="" povečan,="" ne="" da="" bi="" se="" znatno="" povečal,="" ha="" pa="" ni="" pokazal="" sprememb="" po="" zdravljenju="" z="" jp="" (slika="">

Slika 7. Vsebnost SCFA v različnih skupinah. (A) Fekalne SCFA. (B) ledvične SCFA. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD, n=6 na skupino (**P < 0.01="" v="" primerjavi="" z="" lažno="" skupino;="" ##p="">< 0).="" 01,="" #p="">< 0,05="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" kronično="" ledvično="">

4. Razprava

V sedanjem modelu podgan s 5/6 nefrektomijo CKD jeledvicafunkcijokazalci (Scr, BUN in beljakovine v urinu) so se znatno povečali, pojavila se je preostala ledvična hipertrofija in patološka poškodba ledvic, ki so jo spremljali spremenjeni hematološki parametri. Ti podatki so bili v skladu s prejšnjimi študijami (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Zgornji kazalniki so pokazali, da je bila pri podganah s kronično ledvično boleznijo anemija, povzročena z nefrektomijo 5/6, uspešno ugotovljena in da je bilo mogoče preveriti ugoden učinek JP pri zdravljenju podgan s kronično ledvično boleznijo. zledvicafunkcijododatno poslabšala, je bila anemija prepoznana kot znan oportunistični zaplet KLB, ki je negativno vplival na kakovost življenja bolnikov (Locatelli, Fishbane, Block in Macdougall, 2017). Razumevanje dejavnikov tveganja, povezanih z napredovanjem ledvične anemije, bo pomagalo razviti terapevtske pristope. Dandanes je povezava med boleznijo in presnovo črevesne mikrobiote pritegnila vse več pozornosti, medtem ko je razmerje med SCFA in ledvično anemijo še vedno manj znano. SCFA, ki jih večinoma presnavljajo Clostridium, Coprococcus in Bacteroides (Koh et al., 2016), ciljajo na specifične membranske receptorje, ki igrajo pomembno vlogo pri ohranjanju ravnovesja črevesnega okolja in zdravja celotnega telesa. Dokazano je že, da so SCFA neločljivo povezani s kronično ledvično boleznijo, ravni ocetne kisline, propionske kisline in maslene kisline pa so bile znižane pri kronični ledvični bolezni (Wang et al., 2019). Pri podganah s kronično ledvično boleznijo, povzročeno z adeninom, sta se številčnost in raznolikost črevesne mikrobiote znatno spremenili, podjetja so zmanjšala raven propanojske kisline, maslene kisline in valerianske kisline (Lakshmanan, Al, Ali in Terranegra, 2021). Na podlagi naše prejšnje študije je sekvenciranje 16S rDNA pokazalo, da je bila disbioza črevesne mikrobiote prikazana pri 5/6 podganah s kronično ledvično boleznijo, povzročeno z nefrektomijo, v primerjavi z lažno skupino. Nekateri SCFA, ki proizvajajo rodove, zlasti masleno kislino iz Clostridium, Coprococcus, so pokazali razlike pri podganah s kronično ledvično boleznijo (Zheng et al., 2020). V skladu s tem so naši rezultati pokazali, da so se količine ocetne kisline, propionske kisline, maslene kisline in valerijanske kisline zmanjšale za približno 60 odstotkov, 80 odstotkov, 85 odstotkov in 60 odstotkov pri podganah s kronično ledvično boleznijo, kar kaže, da je zmanjšanje SCFA ustrezalo z neravnovesjem okolja v črevesju. Opozoriti je treba, da je motnja črevesnega okolja, ki jo povzroči kronična ledvična bolezen, sprožila nenormalen metabolizem črevesne mikrobiote (Feng et al., 2019). Poleg tega smo ugotovili, da se je pri podganah s kronično ledvično boleznijo in anemijo zmanjšalo osem vrst SCFA. Na primer, nenormalnost presnovnih končnih produktov, tj. SCFA, je lahko posledica napredovanja kronične ledvične bolezni.

Polisaharide, eno od aktivnih sestavin, so našli v različnih zeliščih, kot so Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix in Jujubae Fructus. Črevesna mikrobiota lahko fermentira in razgradi polisaharide. Posledično so polisaharidi predstavljeni kot substrat za črevesno mikrobioto, ki se presnavlja v SCFA ali pa se šteje, da imajo učinek, podoben prebiotikom, za izboljšanje sestave črevesne mikrobiote za lažjo proizvodnjo SCFA (Cai et al., 2019). V tej študiji so naše ugotovitve pokazale, da so polisaharidi iz žižole spodbudili sproščanje SCFA v črevesni mikrobioti, kot so ocetna kislina, propanojska kislina, izomaslena kislina, 2-metilmaslena kislina pri podganah s kronično ledvično boleznijo. Poleg tega se je po zdravljenju z JP izboljšala raven SCFA v ledvicah podgan s kronično ledvično boleznijo in anemijo, težnja sprememb pa je bila skladna s fekalnim vzorcem. Na podlagi obstoječih raziskav je razmerje med SCFA in kronično ledvično boleznijo postopoma postalo jasno. Poročali so na primer, da ocetna kislina modulira imunski sistem in blaži akutnoledvicapoškodbaz zaviranjem signalizacije NADPH oksidaze v celicah T (Al-Harbi et al., 2018). Dokazano je, da propanojska kislina preprečuje napredovanje kronične ledvične bolezni, ki jo povzroča adenin, prek receptorja 2 za proste maščobne kisline (FFA2) in FFA3 (Mikami et al., 2020). Zato smo sklepali, da je ponovno vzpostavljena raven SCFA v ledvicah koristna za obolele ledvice. Poročali so, da je JP povečal raznolikost črevesne mikrobiote in povečal relativno številčnost aktivne mikrobiote SCFA (Bacteroides) pri miših s kolorektalnim rakom (Ji et al., 2020). Poleg tega je JP povečal koncentracijo skupnih SCFA v fekalnih vzorcih (Ji et al., 2019). Zato smo sklepali, da bi JP lahko spodbudil proizvodnjo SCFA, da bi dosegel namen zaviranja napredovanja kronične ledvične bolezni. JP je lahko tudi presnovni substrat za prevladujočo mikrobioto SCFA za spodbujanje proizvodnje SCFA pri kronični bolezni bolezni ali prebiotikom podobna komponenta za obnovo črevesnega okolja, zlasti raznolikosti prevladujoče mikrobiote SCFA, in dodatno spodbuja sproščanje SCFA, tako da preprečiti napredovanje kronične ledvične bolezni.

Na splošno je SCFA (brez ogljika od 6) z majhno molekulsko maso in visoko kemijsko polarnostjo težko neposredno analizirati s kromatografskimi pristopi. Strategija kemične derivatizacije SCFA, označene z izotopi, bi lahko izboljšala občutljivost instrumenta in zmanjšala napake pri analizi, kar je zagotovilo uporabno strategijo za določanje SCFA v analizi LC-MS/MS (Higashi & Ogawa, 2016). Nedavno so bili pristopi, označeni z dansyl hidrazinom, zadovoljivo uporabljeni pri odkrivanju ciljnih presnovkov v človeški plazmi, ki vsebujejo karboksilno kislino (Chen & Zhang, 2020). V podporo temu smo v tej študiji nadalje razvili kemijsko derivatizacijo na podlagi pristopa LC-MS/MS za določanje 8 SCFA v iztrebkih podgan. SCFA proizvaja črevesna mikrobiota in skoraj 10 odstotkov SCFA se izloči z blatom (Boets et al., 2015). Zato lahko analiza fekalnega vzorca SCFA neposredno odraža spremembe v črevesnem okolju in je bolj referenčna v skupni analizi multiomike med SCFA in črevesno mikrobioto. Predvsem pri validaciji nestabilnosti smo ugotovili, da so bile SCFA, označene z dansil hidrazinom, nestabilne pri sobni temperaturi, njihova intenzivnost v masnem spektru pa je s časom kazala padajočo tendenco, vendar je lahko ostala stabilna 48 ur pri 4 ◦C. Zato je treba po derivatizaciji SCFA analite pred analizo hraniti pri 4 ◦C.

V stopnjah 4–5 napredovale KLB pomanjkanje proizvodnje EPO omejuje eritropoezo, kar prispeva k najbolj kritičnemu dejavniku pri razvoju ledvične anemije (Sakashita, Tanaka in Nangaku, 2019). Smernice klinične prakse predlagajo rutinsko zdravljenje anemije z zdravili, ki spodbujajo eritropoezo (ESA). Vendar je treba skrbeti za varnost ESA, ki je povezana s povečanim tveganjem smrti in srčno-žilnimi dogodki (Thavarajah & Choi, 2019). Pri bolnikih z ledvično anemijo naj bi bila ekspresija EPO dosledna ali vidno povišana v primerjavi z zdravimi telesi (Babitt & Lin, 2012). V zgodnji fazi je raven EPO predstavljala trend nadgradnje, medtem ko je v pozni fazi raven EPO pokazala padajoči trend v primerjavi z zgodnjo fazo, celo nižjo od običajne (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´ Cori's, & Derviˇsevi ´c, 2017). V skladu s prejšnjimi poskusi (Chen et al., 2019; Wang et al., 2020) so naši rezultati pokazali, da je bila raven EPO v serumu pri podganah s kronično ledvično boleznijo in anemijo znižana. Odkrili smo ledvično EPO mRNA in raven beljakovin pri podganah s kronično ledvično boleznijo in raven ledvičnih EPO beljakovin se je nekoliko zmanjšala v primerjavi z lažno skupino, medtem ko je bila količina ledvične EPO mRNA razgrajena in je bila njena stopnja večja od serumske ravni EPO. Ledvice so glavni vir sinteze EPO pri odraslih in bolnikih z ERSD.ledviceše vedno ohranja sposobnost tvorbe eritropoetina (Bernhardt et al., 2010). Za korekcijo endogenih ravni EPO v serumu in prilagoditev ledvični anemiji je bila aktivirana proizvodnja EPO v ledvicah, čepravledvicapoškodbazmanjšano izražanje mRNA EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Po zdravljenju z JP se je raven EPO v serumu povečala, prav tako pa sta bili nadgrajeni ravni mRNA in beljakovin EPO v ledvicah. V naši prejšnji študiji bi lahko JP stimuliral transkripcijsko aktivnost HRE in izboljšal gen EPO (Chen et al., 2014). Zato smo špekulirali, da bi JP lahko obnovil raven EPO v serumu CKD podgan na regulirano ledvično anemijo, k čemur lahko prispeva stimulirana ekspresija gena EPO v ledvicah na ravni mRNA.

V skorji so HIF-1 našli predvsem v tubularnem, HIF-2 pa v ledvičnem intersticiju. Ker EPO večinoma proizvajajo fibroblasti, v katerih je HIF-2 skupaj, to potrjuje, da je lahko HIF-2 odgovoren za uravnavanje proizvodnje EPO (Maxwell, 2003). V naši študiji smo ugotovili, da bi HIF-1 in HIF-2 lahko aktivirala CKD, zdravljenje z JP pa bi lahko spodbudilo aktivnost HIF-1 in HIF-2 v primerjavi s podganami s CKD . Dokazano je bilo, da ima HIF-2 pomembno vlogo pri uravnavanju proizvodnje EPO (Kapitsinou et al., 2010), medtem ko ima uravnavanje HIF-1 lahko zaščitni učinek na ledvice (Jiang et al. al., 2020), kar posredno izboljša proizvodnjo EPO. Ledvična proizvodnja EPO je bila najprej regulirana na ravni mRNA, pri anemiji ali hipoksiji se lahko ekspresija mRNA EPO poveča s stimulacijo proteina HIF. Prej so farmakološke raziskave pokazale, da je žižola stimulirala ekspresijo EPO z uravnavanjem ravni HIF-proteina v celičnem modelu (Chen et al., 2014, Lam et al., 2016). Zato smo sklepali, da lahko JP poveča ekspresijo mRNA EPO preko HIF-proteina, da doseže namen ublažitve ledvične anemije.

Poleg tega na podlagi trenutnih rezultatov špekuliramo, da ima lahko zmanjšanje SCFA ključno vlogo pri izražanju EPO, ki ga posreduje HIF, kar prispeva k anemiji kronične ledvične bolezni. V nasprotju s tem je bilo ponazorjeno, da je bila povečana raven ocetne kisline koristna za acetilacijo HIF-2 in generiranje kompleksa CREB-vezavni protein-HIF 2 ter dodatno inducira ekspresijo EPO (Xu et al., 2014). Propionska kislina je zmanjšala mitohondrijske motnje, hipokampalno apoptozo in nevrološke izpade prek poti HIF-1 /ERK (Cheng et al., 2019). Poleg tega je bilo ugotovljeno, da maslena kislina stabilizira HIF-1, aktivne ciljne gene HIF na celicah debelega črevesa in blaži vnetni odziv debelega črevesa (Kelly et al., 2015). V naši študiji smo ugotovili, da so se ravni ocetne kisline, propanojske kisline in maslene kisline znatno znižale skupaj z nenormalno ekspresijo HIF-proteina pri podganah s kronično ledvično boleznijo, kar je pokazalo, da je stabilnost HIF- lahko povezana z zmanjšanjem SCFA in SCFA lahko učinek stabilizacije HIF za uravnavanje izražanja EPO.

5. Sklepi

Na koncu smo dokazali, da je JP izboljšal CKD in z njo povezano anemijo, katere mehanizem je bil vključen v regulacijo sproščanja SCFA in proizvodnje EPO. In JP je lahko bioaktivna sestavina žižole za zdravljenje anemije. Te ugotovitve so lahko dokaz za nadaljnji razvoj JP kot prehranskih dopolnil za zdravljenje anemije, povezane s KLB.

Etična izjava

Vsi poskusi na živalih v naši raziskavi so bili izvedeni s protokoli, ki jih je odobril Odbor za etiko kitajske medicinske univerze Guangzhou, in v skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje za nego in uporabo laboratorijskih živali (Publikacije NIH št. 80-23, revidirano 1996). V naši raziskavi ni kršitev zgornjih smernic.

Zahvala

To delo podpirajo Naravoslovna fundacija province Guangdong (2018A030313305), Naravoslovna fundacija Kitajske (81804052, 81973577 in 82004248), Projekt načrta za znanost in tehnologijo Shenzhen (JSGG20191129102216637 in ZDSYS201606081515458), Provinca tradicionalne kitajske medicine Burdonang 20201320).

Reference

Al-Harbi, NO, Nadeem, A., Ahmad, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA, … Ibrahim, KE (2018). Kratkoverižna maščobna kislina, acetat, ublaži akutno sepsoledvicapoškodbaz zaviranjem signalizacije NADPH oksidaze v celicah T. Mednarodna imunofarmakologija, 58, 24–31.
Babitt, JL in Lin, HY (2012). Mehanizmi anemije pri kronični ledvični bolezni. Journal of the American Society of Nephrology, 23 (10), 1631–1634.
Bernhardt, WM, Wiesener, MS, Scigalla, P., Chou, J., Schmieder, RE, Günzler, V., … Eckardt, KU (2010). Inhibicija prolil hidroksilaz poveča proizvodnjo eritropoetina pri ESRD. Journal of the American Society of Nephrology, 21(12),
2151–2156.
Boets, E., Deroover, L., Houben, E., Vermeulen, K., Gomand, SV, Delcour, JA, … Verbeke, K. (2015). Kvantifikacija in vivo proizvodnje črevesne kratkoverižne maščobne kisline iz inulina. Hranila, 7 (11), 8916–8929.

Cai, Y., Liu, W., Lin, Y., Zhang, S., Zou, B., Xiao, D., … Xie, Z. (2019). Sestavljeni polisaharidi izboljšajo eksperimentalni kolitis z modulacijo sestave in delovanja črevesne mikrobiote. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 34(9),1554–1562.

Chen, G. in Zhang, Q. (2020). Hkratna kvantifikacija prostih maščobnih kislin in acilkarnitinov v vzorcih plazme z uporabo dansilhidrazinskega označevanja in tekočinske kromatografije – trojne kvadrupolne masne spektrometrije. Analitično in bioanalitičnoKemija, 412 (12), 2841–2849.

Chen, J., Lam, CT, Kong, AY, Zhang, WL, Zhan, JY, Bi, CW, … Tsim, KW (2014). Izvleček ploda Ziziphus jujuba (žižola) inducira ekspresijo eritropoetina prek faktorja, ki ga inducira hipoksija-1 v gojenih celicah Hep3B. PlantaMedica, 80 (17), 1622–1627.

Chen, J., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Li, Z., Qi, A., … Li, S. (2019). Odvarek Jian-Pi-Yi-Shen lajša ledvično anemijo pri 5/6 nefrektomiranih podganah: proizvodnja eritropoetina s signaliziranjem dejavnika, ki ga povzroči hipoksija. Na dokazih podprta komplementarna in alternativna medicina, 2019, 1–8.
Cheng, Y., Mai, Q., Zeng, X., Wang, H., Xiao, Y., Tang, L., … Ding, H. (2019). Propionat lajša epileptične napade, ki jih povzroča pentilentetrazol, posledično mitohondrijsko motnjo, nekrozo nevronov in nevrološke izpade pri miših. Biokemijska farmakologija, 169, člen 113607.
Feng, YL, Cao, G., Chen, DQ, Vaziri, ND, Chen, L., Zhang, J., … Zhao, YY (2019). Metabolomika mikrobioma razkriva mikrobioto črevesja, povezano z presnovki, konjugiranimi z glicinom, in presnovo poliamina pri kronični bolezni ledvic. Celične in molekularne znanosti o življenju, 76 (24), 4961–4978.
Garrido, P., Ribeiro, S., Fernandes, J., Vala, H., Bronze-da-Rocha, E., Rocha-Pereira, P., … Reis, F. (2015). Dismetabolizem železa in hepcidina, anemija in ledvična hipoksija, vnetje in fibroza v modelu ostankov ledvic podgane. PLoS ONE, 10(4), člen e124048.
Higashi, T. in Ogawa, S. (2016). Izotopsko kodirani derivatizacijski reagenti za izboljšanje ESI za diferencialno analizo, kvantifikacijo in profiliranje metabolitov v bioloških vzorcih s LC/MS: pregled. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 130, 181–193.
Ji, X., Hou, C., Gao, Y., Xue, Y., Yan, Y., in Guo, X. (2020). Metagenomska analiza modulacijskih učinkov črevesne mikrobiote polisaharidov žižole (Ziziphus jujuba Mill.) v mišjem modelu kolorektalnega raka. Hrana in funkcija, 11 (1), 163–173.
Ji, X., Hou, C., Yan, Y., Shi, M. in Liu, Y. (2020). Primerjava strukturne karakterizacije in antioksidativne aktivnosti polisaharidov iz plodov žižole (Ziziphus jujuba Mill.). Mednarodni časopis za biološke makromolekule, 149, 1008–1018.

Ji, X., Hou, C., Zhang, X., Han, L., Yin, S., Peng, Q., … Wang, M. (2019). Mikrobiomemetabolomska analiza vpliva Zizyphus jujuba cv. Poraba polisaharidov Muzao na fekalni mikrobioti in metabolitih pri miših kolorektalnega raka.Mednarodni časopis za biološke makromolekule, 131, 1067–1076.

Ji, X., Peng, Q., Yuan, Y., Shen, J., Xie, X., in Wang, M. (2017). Izolacija, strukture in bioaktivnosti polisaharidov iz sadja žižole (Ziziphus jujuba Mill.): Pregled. Kemija hrane, 227, 349–357.
Jiang, N., Zhao, H., Han, Y., Li, L., Xiong, S., Zeng, L., … Sun, L. (2020). HIF-1 izboljša tubulno poškodbo pri diabetični nefropatiji prek HO-1-posredovanega nadzora mitohondrijske dinamike. Proliferacija celic, 53(11), člen e12909.
Kapitsinou, PP, Liu, Q., Unger, TL, Rha, J., Davidoff, O., Keith, B., … Haase, VH (2010). Jetrni HIF-2 uravnava eritropoetske odzive na hipoksijo pri ledvični anemiji. Blood, 116 (16), 3039–3048.
Kelly, CJ, Zheng, L., Campbell, EL, Saeedi, B., Scholz, CC, Bayless, AJ, … Colgan, SP (2015). Preslušavanje med kratkoverižnimi maščobnimi kislinami, pridobljenimi iz mikrobiote, in črevesnim epitelijem HIF povečuje funkcijo tkivne pregrade. Cell Host & Microbe, 17 (5), 662–671.
Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., & B¨ ackhed, F. (2016). Od prehranskih vlaknin do fiziologije gostitelja: kratkoverižne maščobne kisline kot ključni bakterijski metaboliti. Celica, 165 (6), 1332–1345.
Lakshmanan, AP, Al, ZM, Ali, BH in Terranegra, A. (2021). Vpliv prebiotičnega akacijevega gumija na sestavo črevesnega mikrobioma pri podganah z eksperimentalno kronično ledvično boleznijo. Biomedicina & Pharmacotherapy, 133, članek
110992.
Lam, C., Chan, PH, Lee, P., Lau, KM, Kong, A., Gong, A., … Tsim, K. (2016). Kemijska in biološka ocena zeliščnih decokcij, ki vsebujejo žižolo (Ziziphus jujuba): indukcija izražanja eritropoetina v kulturah. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1026, 254–262.
Lappin, TR in Lee, FS (2019). Posodobitev mutacij v HIF: poti EPO in njihovi vlogi pri eritrocitozi. Pregledi krvi, 37, člen 100590.
LeBlanc, JG, Chain, F., Martín, R., Bermúdez-Humaran, ´ LG, Courau, S., & Langella, P. (2017). Ugodni učinki na energijsko presnovo gostitelja kratkoverižnih maščobnih kislin in vitaminov, ki jih proizvajajo komenzalne in probiotične bakterije. Tovarne mikrobnih celic, 16 (1), 79.
Li, L., Ma, L. in Fu, P. (2017). Kratkoverižne maščobne kisline, pridobljene iz črevesne mikrobiote, in bolezni ledvic. Razvoj in terapija oblikovanja zdravil, 11, 3531–3542.
Li, L. in Shi, JY (2013). Analiza polisaharidnih in lipidnih komponent korteksa cimeta z GC-MS. Zhong Yao Cai, 36(4), 578–580.
Liu, G., Liu, X., Zhang, Y., Zhang, F., Wei, T., Yang, M., … Zhao, Z. (2015). Hepatoprotektivni učinki polisaharidov, ekstrahiranih iz Zizyphus jujube cv. Huanghetanzao. Mednarodni časopis za biološke makromolekule, 76, 169–175.

Locatelli, F., Fishbane, S., Block, GA in Macdougall, IC (2017). Usmerjanje na dejavnike, ki povzročajo hipoksijo, za zdravljenje anemije pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo. American Journal of Nephrology, 45 (3), 187–199.

Locatelli, F., Hannedouche, T., Fishbane, S., Morgan, Z., Oguey, D., & White, WB (2019). Kardiovaskularna varnost in smrtnost zaradi vseh vzrokov metoksi polietilena

Glikol-epoetin beta in druga sredstva za stimulacijo eritropoeze pri anemiji kronične ledvične bolezni: randomizirano preskušanje neinferiornosti. Klinični časopis Ameriškega združenja za nefrologijo: CJASN, 14(12), 1701–1710.
Maxwell, P. (2003). HIF-1: sistem za odziv na kisik, ki je posebej pomemben za ledvice. Journal of American Society of Nephrology, 14 (11), 2712–2722.
Meijers, BK, & Evenepoel, P. (2011). Os črevesje-ledvica: indoksil sulfat, p-krezil sulfat in napredovanje kronične ledvične bolezni. Nefrologija Dializa Presaditev, 26 (3), 759–761.
Mikami, D., Kobayashi, M., Uwada, J., Yazawa, T., Kamiyama, K., Nishimori, K., … Iwano, M. (2020). Kratkoverižna maščobna kislina blaži z adeninom povzročeno kronično ledvično bolezen preko FFA2 in FFA3 poti. Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology Lipids, 1865(6), člen 158666.
Morton, DB in Griffiths, PH (1985). Smernice za prepoznavanje bolečine, stiske in neugodja pri poskusnih živalih in hipoteza za oceno. Veterinarski zapis, 116(16), 431–436.
Panjeta, M., Tahirovi´c, I., Sofi´c, E., Cori´ ´c, J., & Derviˇsevi´c, A. (2017). Interpretacija ravni eritropoetina in hemoglobina pri bolnikih z različnimi stopnjami kronične ledvične bolezni. Journal of Medical Biochemistry, 36 (2), 145–152.
Pappa, M., Dounousi, E., Duni, A. in Katopodis, K. (2015). Manj znani patofiziološki mehanizmi anemije pri bolnikih z diabetično nefropatijo. Mednarodna urologija in nefrologija, 47(8), 1365–1372.
Sakashita, M., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2019). Inhibitorji domene prolil hidroksilaze, ki jih povzroča hipoksija, za zdravljenje anemije pri kronični ledvični bolezni. Prispevki k nefrologiji, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel, ¨ J. in Ratcliffe, PJ (2019). Mehanizmi signalizacije hipoksije: nove posledice za nefrologijo. Nature Reviews Nefrologija, 15 (10), 641–659.
Tako, E., Glahn, RP, Knez, M., & Stangoulis, JC (2014). Učinek pšeničnih prebiotikov na populacijo črevesnih bakterij in stanje železa pri pitovnih piščancih s pomanjkanjem železa. Revija za prehrano, 13, 58.
Tang, WH, Wang, Z., Kennedy, DJ, Wu, Y., Buffa, JA, Agatisa-Boyle, B., … Hazen, SL (2015). Od črevesne mikrobiote odvisna pot trimetilamin N-oksida (TMAO) prispeva k razvoju ledvične insuficience in tveganju smrtnosti pri kronični bolezni ledvic. Circulation Research, 116(3), 448–455.
Thavarajah, S., & Choi, MJ (2019). Uporaba sredstev za stimulacijo eritropoeze pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo in rakom: klinični pristop. American Journal of Kidney Diseases, 74(5), 667–674.
Wang, F., Yu, H., Huang, S., Zheng, L., Zheng, P., Zhang, S., … Chen, J. (2020). Jian-PiYi-Shen uravnava ekspresijo EPO in proteina za recikliranje železa pri anemičnih podganah s kronično ledvično boleznijo: kopičenje faktorja, ki povzroča hipoksijo-2 prek signalizacije ERK. Na dokazih podprta komplementarna in alternativna medicina, 2020, 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F., … Chen, Y. (2019). Kvantitativno zmanjšanje kratkoverižnih maščobnih kislin, zlasti butirata, prispeva k napredovanju kronične ledvične bolezni. Klinična znanost, 133 (17), 1857–1870.
Webster, AC, Nagler, EV, Morton, RL in Masson, P. (2017). Kronična ledvična bolezen. Lancet (London, Anglija), 389(10075), 1238–1252.
Xie, X., Yang, X., Wu, J., Ma, J., Wei, W., Fei, X., … Wang, M. (2020). Trib1 prispeva k okrevanju po akutni ledvični poškodbi, povzročeni z ishemijo/reperfuzijo, z uravnavanjem polarizacije ledvičnih makrofagov. Frontiers in Immunology, 11, 473.
Xu, M., Nagati, JS, Xie, J., Li, J., Walters, H., Moon, YA, … Garcia, JA (2014). Acetatno stikalo uravnava stresno eritropoezo. Nature Medicine, 20 (9), 1018–1026.
Yue, Y., Wu, S., Li, Z., Li, J., Li, X., Xiang, J., … Ding, H. (2015). Polisaharidi divje žižole ščitijo pred eksperimentalno vnetno črevesno boleznijo, saj omogočajo okrepljeno delovanje črevesne pregrade. Hrana in funkcija, 6 (8), 2568–2577.

Zhao, S. in Li, L. (2018). Označevanje izotopov dansilhidrazina LC-MS za celovito profiliranje submetaboloma karboksilne kisline. Analitična kemija, 90 (22), 13514–13522.

Zheng, L., Chen, S., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Yang, X., … Chen, J. (2020). Različni odzivi črevesne mikrobiote na decokcijo Jian-Pi-Yi-Shen so povezani z izboljšanimi kliničnimi rezultati pri 5/6 nefrektomiranih podganah. Frontiers in Pharmacology, 11, 604.