siJezik
Dom / znanje / Vsebine

znanje

Kuwanon T in Sanggenon A, izolirana iz Morus Alba, imata protivnetne učinke z uravnavanjem signalnih poti NF-κB in HO-1/Nrf2 v celicah BV2 in RAW264.7

Mar 30, 2022

Za več informacij. stiktina.xiang@wecistanche.com

Povzetek: Pred tem smo raziskali metanolni izvleček lubja Morus alba in označili 11 spojin iz izvlečka: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7),mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) in norartokarpanon (11). Tu smo raziskaliprotivnetnoučinke teh spojin na mikroglialne celice (BV2) in makrofage (RAW264.7). Med njimi sta 3 in 4 izrazito zavirala z lipopolisaharidom (LPS) inducirano proizvodnjo dušikovega oksida v teh celicah, kar kaže na protivnetne lastnosti teh dveh spojin. Te spojine so zavirale nastajanje prostaglandinov E2, interlevkina-6 in faktorja tumorske nekroze-c ter izražanje inducibilne sintaze dušikovega oksida in ciklooksigenaze-2 po stimulaciji LPS. Predhodna obdelava s 3 in 4 je zavirala aktivacijo signalne poti jedrskega faktorja kapa B v obeh tipih celic. Spojine so prav tako inducirale ekspresijo heme oksigenaze (HO)-1 z aktivacijo jedrskega faktorja eritroidnega 2-sorodnega faktorja 2. Zatiranje aktivnosti HO-1 je odpravilo povzročene protivnetne učinke s predhodnim zdravljenjem s 3 in 4, kar kaže, da je protivnetne učinke uravnaval HO -1. Skupaj sta 3 in 4 možna kandidata za razvoj terapevtskih in preventivnih sredstev zavnetne bolezni.

Ključne besede: Morus alba; kuwanon T; sangenon A; BV2; celice RAW264.7; protivnetni učinki

flavonoids anti-inflammatory

Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o izdelkih

1. Uvod

Morus alba, zdravilna rastlina iz družine Moraceae, se v tradicionalni medicini uporablja za zdravljenje pljučnih vnetnih stanj [1]. Lubje njegove korenine vsebuje različne aktivne sestavine, kot so umbeliferon, skopoletin, mucini, tanini,flavonoidi(morusin, mulberrin, mulberrikromen, ciklomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, kuwana E in kuwanon H)[2], 2-arilbenzofurani (moracenin D, moracin P, moracin O in mulberrofuran O), in prenilirani flavonoidi (likoflavon C, ciklomulberrin, neociklomoruzin, sanggenon I, morusin in Kuwana U)[3,4]. Izvlečki M. alba in aktivne spojine lahko lajšajo pljučne bolezni, kot so pokazale nedavne študije [5-7]. Poleg farmakološkega učinka M. alba na pljuča imajo izoprenilirani flavonoidi (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G in mulberrofuran C) hepatoprotektivne učinke v celicah HepG2, ki jih povzroča t-BHP [8]. Prenil-flavonoidi (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T in morusin) in triterpenoidi (betulinska kislina, avail in -sitosterol) bistveno zavirajo diferenciacijo 3T3-L1 adipocitov [9]. Morin hidrat, glavna flavonoidna sestavina M. alba, ublaži kronično nepredvidljivo okvaro spomina, ki jo povzroči stres, kar kaže, da bi ta spojina lahko okrepila antioksidativni obrambni sistem in zavirala nevroinflamatorne poti [10]. Te študije kažejo, da so sestavine, ki jih vsebuje M. alba, potencialni kandidati za zdravljenje različnih bolezni.

Vnetje, kompleksen samoobrambni odziv na škodljive dražljaje, igra pomembno vlogo pri imunski obrambi z aktivacijo več imunskih celic, vključno z makrofagi, monociti, levkociti, mastociti in drugimi tipi celic [11]. Makrofagi so najpogostejše in najbolj razširjene imunske celice v telesu, mikroglija pa so rezidenčni makrofagi v centralnem živčnem sistemu (CNS)[12]. Makrofagi in mikroglialne celice so ključni akterji vnetnega odziva. Aktivirajo se lahko kot odgovor na dražljaje, kot so lipopolisaharid (LPS), citokini in kemokini, in povzročijo vnetna stanja [13]. V vnetnih stanjih prekomerno aktivirani makrofagi in mikroglialne celice povzročijo nenormalno regulacijo vnetnih mediatorjev (dušikov oksid (NO), prostaglandin E2 (PGE), inducibilna sintaza dušikovega oksida (iNOS) in ciklooksigenaza (COX)-2 ) in provnetnih citokinov (interlevkin (IL)-6 in faktor tumorske nekroze (TNF)-a) z aktivacijo signalne poti jedrskega faktorja kapa B (NF-B)[14,15]. Povišane ravni pro-vnetnih mediatorjev še poslabšajo napredovanje vnetnih bolezni, kar dodatno poveča aktivacijo vnetnih dejavnikov, kar povzroči začaran krog[16]. Zato je uravnavanje vnetnih mediatorjev bistveno za zdravljenje in preprečevanje vnetnih bolezni.

Hem oksigenaza (HO)-1 je encim, ki omejuje hitrost in katalizira razgradnjo hema v biliverdin, železov ion (Fe2 plus) in ogljikov monoksid (CO)[17]. Indukcijo HO-1 uravnava aktivacija jedrskega faktorja eritroidnega 2-sorodnega faktorja 2 (Nrf2). HO-1 se lahko inducira kot odziv na oksidativni stres in vnetje za zaščito tkiv in vzdrževanje homeostaze v telesu[18]. Zato je ciljanje na indukcijo HO-1 ena od možnih strategij za zdravljenje vnetnih bolezni.

V našem nenehnem prizadevanju za raziskovanje kandidatov iz naravnih izdelkov za zdravljenje vnetnih bolezni, tukaj predstavljamoprotivnetni učinki111 spojin, izoliranih iz M. alba v celicah BV2 in RAW264.7, induciranih z LPS.

4flavonoids anti-inflammatory

2. Rezultati

2.1. Učinki 11 spojin, izoliranih iz M. alba, na sposobnost preživetja celic BV2 in RAW264.7

V prejšnji študiji smo lubje korenine M. alba ekstrahirali v vodnem metanolu in dobljene ekstrakte zaporedno porazdelili v EtOAc, n-BuOH in H2O2. Ponovljena kolonska kromatografija s SiO2, ODS in Sephadex LH-20 frakcije EtOAc je dala 11 spojin, kot so kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) in norartokarpanon (11)[6,19,20]. Kemične strukture 11 spojin, izoliranih iz M. alba, so prikazane na sliki 1. Za določitev citotoksičnih učinkov teh spojin je 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){{ 26}}.5-Opravljen je bil test z difeniltetrazolijevim bromidom (MTT), celice BV2 in RAW264.7 so bile 48 ur obdelane z navedenimi koncentracijami spojin v koncentracijah do 80 μM. （Slika 2）. Spojine 2, 3 in 4 so imele toksične učinke pri 80 μM, spojina 5 je imela toksične učinke pri 40 μM. Na podlagi rezultata vrednotenja toksičnosti je bilo za nadaljnje študije protivnetnih učinkov izbrano netoksično območje koncentracije (spojina 2, 3,4 pri 40 uM, spojina 5 pri 200 μM in druge spojine pri 80 μM） .

Chemical structures of compounds 1–11 isolated from M. alba

Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were incubated for 48 h with various concentrations of the compounds, and their viability was determined using MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 ,*** p < 0.001 compared with the control group. Figure 2. Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW

2.2. Učinki 11 spojin, izoliranih iz M. alba, na izražanje vnetnih dejavnikov in proteina iNOS v celicah BV2 in RAW264.7

NO je prosti radikal v kardiovaskularnem, živčnem inimunski sistem. Ohranja znotrajcelično homeostazo, prenaša nevrotransmiterje ter uravnava protivnetno delovanje in citotoksičnost. Ko pa se proizvede velika količina NO, ima to škodljive učinke na telo, vključno z vazodilatacijo, citotoksičnostjo in poškodbo tkiva [21, 22]. Nato smo preučili učinke teh spojin na proizvodnjo nitritov v celicah BV2 in RAW264.7, ki jih povzroči LPS. Celice smo 2 uri obdelali z različnimi koncentracijami spojin pred stimulacijo z LPS （1 ug/mL） 24 ur. Med spojinami sta samo spojina 3 (kuwanonT) in 4 (sanggenon A) pomembno inhibirali nastajanje nitritov tako v celičnih linijah BV2 kot RAW264.7 (slika 3). Poleg tega smo izvedli dodaten poskus za primerjavo inhibitornega učinka proizvodnje nitritov med skupino, zdravljeno z LPS, po predobdelavi spojine in skupino, obdelano s spojino, po predobdelavi LPS. Posledično ni bilo razlike v zaviralnem učinku proizvodnje nitritov med obema poskusnima skupinama (dodatna slika S1). Zato so bili v tej študiji naslednji poskusi izvedeni z uporabo predhodne obdelave s spojinami v 2 ~ 3 urah pred obdelavo LPS.

. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Produkcijo NO poveča sintaza dušikovega oksida (iNOS), inducibilna proti vnetnim proteinom. Vendar prekomerna ekspresija iNOS resno poslabša patofiziologijo bolezni [23]. Spojini 3 in 4 sta zavirali izražanje iNOS na način, ki je odvisen od koncentracije (slika 4). Preučili smo učinke spojin 3 in 4 na LPS-inducirano izražanje vnetnih faktorjev v celicah BV2 in RAW264.7. Celice smo 2 uri obdelali z različnimi koncentracijami spojin 3 in 4 pred stimulacijo z LPS (1 ug/mL) 24 ur. Obe spojini sta pomembno zavirali z LPS inducirano izražanje PGE2, TNF in IL-6 v celicah BV2 in RAW264.7 (slika 5). Zdi se, da rezultati kažejo, da je predhodno zdravljenje s spojino 3 in 4 zavrlo vnetje, ki ga povzroči LPS, v celicah BV2 in RAW264.7.

Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Molecules 2021, 26, x FOR PEER REVIEW 5 of 16 Figure 3. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A,D), IL-6 (B,E), and TNF-α (C,F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

effects of cistanche improve immunity (33)

2.3. Učinki spojin 3 in 4 na translokacijo NF-xB v celicah BV2 in RAW264.7

NF-kB je transkripcijski faktor, ki uravnava izražanje iNOS [24]. Normalni NF-kB ostane v svoji neaktivni obliki tako, da tvori komplekse z regulativnimi proteini, kot je IKB. Ko pa ga aktivira LPS, se IkBa razgradi s fosforilacijo in NF-kB (kot je p65) se prenese v jedro [25], ki spodbuja vnetni mediatorski gen in inducira izražanje vnetnih dejavnikov [26]. Za nadaljnji pregled inhibitornega učinka spojin 3 in 4 na produkcijo provnetnih faktorjev v celicah BV2 in RAW264.7, aktiviranih z LPS, smo raziskali ekspresijsko jedrsko translokacijo p65 v celicah, zdravljenih s spojinama 3 in 4, LPS oz. oba z uporabo protitelesa proti p65 FITC. DAPI je bil uporabljen za jedrsko barvanje. V kontrolni skupini so zaznali izražanje p65 v citosolu. Vendar pa je bilo v celicah, induciranih z LPS, odkrito kopičenje p65 v jedru, kot je prikazano v združenih slikah obarvanja DAPI in p65. Poleg tega sta spojini 3 in 4 v primerjavi s celicami, induciranimi z LPS, izrazito zmanjšali z LPS posredovano povečanje aktivnosti vezave NF-KB (p65) DNA (slika 6A, B) in translokacijo jedra (slika 6C-F). Te ugotovitve kažejo, da sta spojini 3 in 4 negativni regulatorji LPS-stimulirane jedrske translokacije NF-kB.

Effects of compounds 3 and 4 on and NF-κB DNA-binding activity (A,B) and NF-κB (p65) localization (C–F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated with compounds 3 or 4 for 2 h and stimulated with liposaccharide (LPS; 1 µg/mL) for 1 h. Experiments were performed using a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kit, as described in the Materials and Methods section. ** p and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

2.4. Učinki spojin 3 in 4 na pot Nrf2/HO-1 v BV2 in RAW264.7

Celice Heme oksigenaza-1(HO-1) je tarča faktorja 2 (Nrf2), povezanega z jedrskim faktorjem E2-, pot Nrf2/HO-1 je močan antioksidativni signalni sistem za spodbujanje prostega železa v ogljikovem monoksidu (CO), biliverdinu in hemu [27]. Ogljikov monoksid, plinasti presnovek katabolizma hema, kaže regulativne učinke vazodilatacije in vnetnih odzivov [28]. Poleg tega je znano, da ima HO -1 pomembno vlogo pri zaščiti celic pred vnetjem in oksidativnim stresom ter da uravnava proizvodnjo nitritov v aktiviranih makrofagih [29]. Izvedli smo Western blot, da bi raziskali, ali spojini 3 in 4 povečata raven ekspresije HO-1, pri čemer je bil dobro znani induktor HO-1 kobaltov protoporfirin (CoPP) uporabljen kot pozitivna kontrola, ki povečuje HO{{ 16}} izražanje beljakovin. [30]. Rezultati so pokazali, da sta spojini 3 in 4 povečali tudi izražanje HO -1 (slika 7). Nadalje smo raziskali, ali spojini 3 in 4 regulirata aktivacijo Nrf2. Translokacija Nrf2 v jedro se je povečala na časovno odvisen način, kar kaže, da sta spojini 3 in 4 občutno regulirali pot Nrf2/HO-1 v celicah BV2 in RAW264.7 (slika 8).

ffects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 μM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B and D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group. Figure 7. Effects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 µM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B,D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group.

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Da bi dodatno preučili, ali so protinevroinflamatorni in protivnetni učinki spojin 3 in 4 povezani z ekspresijo HO -1 v celicah BV2 in RAW264.7, smo izvedli niz poskusov s kositrovim protoporfirinom-IX (SNPP) ki je selektivni zaviralec aktivnosti HO -1. Z uporabo SNPP, ki lahko zniža ekspresijo HO-1, smo poskušali ugotoviti, ali HO-1 posreduje zaviralni učinek zgornjih spojin na vnetni odziv, ki ga povzroča LPS 【31】. Po obdelavi celic z 20 µM spojin 3 in 4 2 uri z ali brez 50 uM SNPP so bile 24 ur obdelane z LPS. Čeprav sta spojini 3 in 4 zmanjšali proizvodnjo nitritov v celicah BV2 in RAW264.7, induciranih z LPS, so bili njihovi protivnetni učinki obrnjeni z zdravljenjem s SNPP (slika 9). Samo SNPP ni vplival na proizvodnjo dušikovega oksida (NO) po stimulaciji LPS, kar kaže, da so protivnetni učinki spojin 3 in 4 regulirani z ekspresijo HO-1.

image

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on nitrite production through the regulation of HO-1 activity in BV2 (A,C,E) and RAW264.7 (B,D,F) cells. The cells were treated with 50 µM of tin protoporphyrin-IX (SnPP) or compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Data are presented as mean ± standard deviation of three independent experiments. ** p < 0.01 and *** p < 0.001

3. Razprava

Ta študija je pokazala, da sta Kuwana T in sanggenon A zavirala vnetje, ki ga povzroča LPS, v celicah BV2 in RAW264.7. Te spojine so zavirale z LPS inducirano produkcijo NO, PGE2 in pro-vnetnih citokinov, vključno z IL-6 in TNF-, ter izražanje iNOS in COX-2 v celicah BV2 in RAW264.7. Ti rezultati so pokazali, da sta Kuwana T in sanggenon A pokazala svoje protivnetne učinke z inaktivacijo signalne poti NF-kB. Poleg tega so te spojine inducirale ekspresijo HO-1 z aktivacijo Nrf2. Poleg tega so te spojine inducirale ekspresijo HO-1 z aktivacijo Nrf2, ta učinek pa je bilo tudi potrjeno povezan z protivnetno delovanje.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.) in tromboksan A2(TXA,)[361. V vnetnih stanjih se ravni iNOS in COX-2 povečajo, kar povzroči prekomerno proizvodnjo NO oziroma PGE2 in vodi do poslabšanja vnetnih motenj [37]. V tej študiji smo najprej ovrednotili 11 spojin, izoliranih iz M.alba, da bi ugotovili, ali je proizvodnja NO zavrta v celicah BV2 in RAW264.7, stimuliranih z LPS. Naši rezultati so pokazali, da imata kuwanon T in sanggenon A najmočnejše zaviralne učinke v celicah BV2 in RAW264.7 (slika 3). V naši prejšnji študiji je imel moracin M protivnetni učinek na alveolarne makrofage, vendar so naši rezultati pokazali drugačen vzorec. Ker pa ima vsaka celica drugačne značilnosti, se lahko tudi z istim mehanizmom pojavijo različne aktivnosti J38]. Zato je bilo, tako kot v rezultatih tega dokumenta, potrjeno, da moracin M ni imel protivnetnega delovanja v celicah BV2 in RAW264.7 do koncentracije zdravljenja. Zato sta bila za nadaljnje poskuse izbrana kuwanon T in sanggenon A.

Citokini imajo kompleksen regulatorni vpliv na vnetne in imunske odzive [39]. Aktivacija makrofagov in mikroglijskih celic poveča izločanje vnetnih citokinov J40, to povečano izločanje pa vodi do nadaljnjega sproščanja citokinov [41]. IL-6 je eden glavnih citokinov in je topen mediator, odgovoren za vnetje, imunski odziv in hematopoezo [42]. Signaliziranje IL-6 je regulirano prek dveh različnih mehanizmov, vključno z vezavo na membransko vezan receptor IL-6 (mblL6R) in prepoznavanjem topnega IL-6 receptorja (sIL6R)[43]. Oba mehanizma sta povezana z aktivacijo glikoproteina (GP)130, kar ima za posledico aktivacijo spodnjih signalnih molekul, vključno z Janus kinazo (IAK)/signalnim pretvornikom in aktivatorjem transkripcije (STAT)kinazami, fosfoinozitid 3-kinazo (PI3K ) in z mitogenom aktivirano proteinsko kinazo (MAPK)[44]. IL-6 se uporablja za napovedovanje in ocenjevanje stopenj vnetja pri bolnikih z rakom, okužbami, avtoimunskimi boleznimi, boleznimi trebušne slinavke in srčno-žilnimi boleznimi.

TNF-, še en glavni citokin, prav tako igra pomembno vlogo pri številnih imunskih in vnetnih procesih, kot so proliferacija imunskih celic, apoptoza, nekroza in preživetje. Biološki učinki TNF- so regulirani z vezavo na dva različna receptorja, receptor faktorja tumorske nekroze (TNFR)1 in TNFR2. TNFR1 je glavni mediator aktivnosti TNF- v večini celic, ker ima TNFR2 manjšo vezavno afiniteto za TNF-, zaradi česar se TNF- lažje loči od TNFR2 kot od TNFR1. Nenormalnosti v signalizaciji TNF in prekomerna proizvodnja TNF- vodijo v razvoj številnih bolezni, vključno z revmatoidnim artritisom, psoriazo, Crohnovo boleznijo, aterosklerozo, sepso, sladkorno boleznijo in debelostjo [45,46]. Zato je za zatiranje in preprečevanje vnetnih reakcij in razvoja vnetnih bolezni pomembno zavirati nastajanje provnetnih citokinov. V tej študiji sta kuwanon T in sanggenon A zavirala z LPS inducirano proizvodnjo IL-6 in TNF- v celicah BV2 in RAW264.7.

NF-kB je najbolj vseprisoten transkripcijski faktor[47] in signalizacija NF-kB igra pomembno vlogo pri izražanju genov, povezanih z vnetnimi odzivi, vključno s tistimi, ki kodirajo iNOS, COX-2 in provnetne citokine [ 48]. V inaktiviranem stanju obstajajo podenote NF-kB v citoplazmi, vezane na svoj inhibitorni protein, inhibitor kapa B (kB)-. Številni dražljaji, vključno z LPS in citokini, inducirajo fosforilacijo in razgradnjo IkB-, kar omogoča osvoboditev in translokacijo podenot NF-kB v jedro. Translocirane podenote se vežejo na kB mesta ciljnih genov v DNA, kar povzroči indukcijo transkripcije genov, ki kodirajo vnetne mediatorje [49]. Zato je lahko inaktivacija poti NF-kB terapevtska tarča za vnetne bolezni. V tej študiji je predhodno zdravljenje s kuwanonom T in sanggenonom A zaviralo z LPS inducirano aktivacijo signalizacije NF-kB z zaviranjem aktivnosti vezave DNA in jedrske translokacije podenot NF-kB (slika 6). Ti rezultati kažejo, da se protivnetni učinki kuwanona T in sanggenona A izvajajo z regulacijo signalne poti NF-kB.

V normalnih pogojih se Nrf2 veže na Kelchu podoben ECH-povezan protein 1 (Keap1) v citoplazmi. Vendar pa se disociira od Keapl, premesti v jedro in se veže na mesta antioksidantnega odzivnega elementa (ARE) na DNK, kar vodi do izražanja različnih antioksidativnih genov, vključno s tistimi, ki kodirajo HO-1, NAD(P)H : kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1), peroksiredoksin (Prx) in tioredoksin (Trx)[50]. Zlasti je znano, da je HO-1 povezan s protivnetnimi učinki, njegovo aktivnost pa predstavljajo ravni CO, enega od treh stranskih produktov, ki nastanejo iz hema z encimsko aktivnostjo HO{{12 }} [51]. V tej študiji smo ugotovili, da kuwanon T in sanggenon A povzročata izražanje HO-1 z aktiviranjem Nrf2 (sliki 7 in 8). Poleg tega smo preverili korelacijo med protivnetnim učinkom kuwanona T in sanggenona A ter ekspresijo HO-1 z uporabo SNPP, selektivnega zaviralca aktivnosti HO-1. Inhibitorni učinki kuwanona T in sanggenona A na proizvodnjo NO in TNF ter aktivacijo NF-kB so bili delno obrnjeni s sočasnim zdravljenjem s SNPP (slika 9). Ti rezultati kažejo, da protivnetne učinke kuwanona T in sanggenona A uravnava izražanje HO-1.

effects of cistanche improve immunity (11)

4. Materiali in metode

4.1. Materiali

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) in fetalni goveji serum sta bila kupljena pri Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, ZDA). Vse kemikalije so bile pridobljene od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA). Primarna protitelesa proti iNOS, anti- -aktinu, anti-p65 in anti-HO-1 so bila kupljena pri Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA); in protikunčja in protimišja sekundarna protitelesa podjetja Millipore

(Billerica, MA, ZDA). Kompleti za encimski imunosorbentni test (ELISA) za PGE,, IL-6 in TNF- so bili kupljeni pri R&DSystems Inc. (Minneapolis, MN, ZDA). Izolacija in strukturna določitev 11 spojin iz Morus alba je bila opisana drugje [19-21].

4.2. Celične kulture in testi sposobnosti preživetja

Celice BV2 in RAW264.7 so bile zasejane pri gostoti 5 × 105 celic/ml v RPMI 1640, dopolnjenem z 1 odstotkom antibiotika (penicilin-streptomicin) in 10 odstotki toplotno inaktiviranega FBS. Celice smo gojili pri 37 stopinjah v navlaženem 5-odstotnem CO, s 95-odstotno zračno atmosfero, v skladu s predhodno opisano metodo [52].

4.3. Merjenje proizvodnje NO

Proizvodnja nitrita, stabilnega končnega produkta oksidacije NO, je bila izmerjena kot indikator proizvodnje NO v celicah. Na kratko, koncentracijo nitrita v kondicioniranem mediju smo določili z metodo, ki temelji na Griessovi reakciji [53]. Podrobnosti testa so bile opisane prej [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

Koncentracijo PGEz v vsakem vzorcu smo izmerili s komercialno dostopnim kompletom ELISA v skladu s predhodno opisano metodo [55].

4.5. Merjenje ravni IL-6 in TNF-a

Gojišče smo zbrali za določitev ravni IL-6 in TNF- z uporabo komercialno dostopnega kompleta (BioLegend, San Diego, CA, ZDA). Test smo izvedli po navodilih proizvajalca. Na kratko, celice BV2 in RAW264.7 so bile posejane v 24-plošče za kulture vdolbinic pri gostoti 20 × 10 celic/vdolbinico. Po inkubaciji smo supernatant zbrali in uporabili za merjenje koncentracij IL-6 in TNF- s kompleti ELISA.

4.6. Western blot analiza

Peletirane celice BV2 in RAW264.7 smo sprali s PBS in lizirali v pufru RIPA. Enake količine beljakovin so bile kvantificirane z uporabo koncentrata reagenta barvila za analizo beljakovin, pridobljenega iz Bio-Rad Laboratories (#5000006; Hercules, CA, ZDA), zmešane v pufru za nalaganje vzorca in ločene s pomočjo SDS-PAGE. Ločene proteine ​​smo nato prenesli na nitrocelulozno membrano. Nespecifično vezavo na membrano smo blokirali z inkubacijo v raztopini posnetega mleka. Membrana je bila inkubirana s primarnimi protitelesi (vsa so bila uporabljena pri 1:1000) pri 4 stopinjah čez noč in nato reagirala s sekundarnim protitelesom, konjugiranim s hrenovo peroksidazo (vsa so bila uporabljena pri 1:5000) (Millipore) [ 31].

4.7. Lokalizacija NF-xB in imunofluorescenčna analiza

Za preučevanje lokalizacije NF-kB so bile celice BV2 in RAW264.7 kultivirane na objektnih stekelcih komore Lab-Tek II in obdelane z različnimi koncentracijami spojin 2 uri pred stimulacijo LPS (0.5 ug/mL) 1 h. Celice smo nato fiksirali v formalinu in permeabilizirali s hladnim acetonom ter testirali s protitelesi proti p65 (1:200), čemur je sledila inkubacija s sekundarnim protitelesom, označenim s fluorescein izotiocianatom (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). Za vizualizacijo jeder smo celice 30 minut obdelali z 1 ug/ml 4'6-diamidino-2-fenilindola （DAPI, 5 minut izprali s PBS in obdelali s 50 μL VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ZDA). Obarvane celice smo vizualizirali in slike pridobili s fluorescenčnim mikroskopom Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokio, Japonska). [31].

4.8. Statistična analiza

Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon treh neodvisnih poskusov. Za primerjavo razlik med tremi skupinami je bila uporabljena enosmerna analiza variance, ki ji je sledil Tukeyjev test večkratne primerjave. Statistične analize so bile izvedene s programsko opremo GraphPad Prism (različica 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ZDA),

5. Sklepi

Kuwanon T in sanggenon A sta imela protivnetne učinke v celicah BV2 in RAW264.7, induciranih z LPS, tako da sta zavirala nastajanje NO, PGE2, IL-6 in TNF- ter izražanje iNOS in COX{{8} }. Naši rezultati so pokazali, da so bili ti inhibitorni učinki posredovani z inaktivacijo poti NF-KB z zdravljenjem s kuwanonom T in sanggenonom A. Poleg tega so te spojine inducirale izražanje HO-1 z aktiviranjem translokacije Nrf2 v jedro . Naše ugotovitve so pokazale, da je bila ekspresija HO-1, ki jo povzročata kuwanon T in sanggenon A, povezana s supresivnimi učinki proti vnetju, ki ga povzroča LPS. Naši rezultati skupaj zagotavljajo dokaze, da sta Kuwana T in sanggenon A, izolirana iz M. Albu, lahko kandidata za razvoj terapevtskih in preventivnih sredstev za nevrovnetne bolezni, kot sta Alzheimerjeva bolezen in Parkinsonova bolezen.


Morda vam bo všeč tudi