Pomanjkanje APOL1 v proksimalnih tubulih normalnih človeških ledvic in proteinuričnih APOL1 transgenih mišjih ledvic
Mar 15, 2022
za več informacij:ali.ma@wecistanche.com
Natalija A. Blagoslov1, Zhenzhen Wu2, Sethu M. Madhavan3, Jonathan W. Choy4, Michelle Chen4, Myung K. Shin4, Maarten HoekID5, John R. Sedor2,6,7, John F. O'Toole2,6,Leslie A. BruggemanID2,6*
1 Rammelkamp Center za izobraževanje in raziskave, MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Združene države Amerike, 2 Department of Inflammation & Immunity, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Združene države Amerike of America, 3 Department of Medicine, Ohio State University, Columbus, OH, Združene države Amerike, 4 Merck & Company, Inc., Kenilworth, NJ, Združene države Amerike, 5 Maze Therapeutics, SouthSan Francisco, CA, Združene države Amerike , 6 Oddelek za nefrologijo, Klinika Cleveland, Medicinska fakulteta Univerze Case WesternReserve, Cleveland, OH, Združene države Amerike, 7 Oddelek za fiziologijo in biofiziko, Medicinska fakulteta Univerze Case Western Reserve, Cleveland, OH, Združene države Amerike.
Povzetek
Mehanizem patogeneze, povezan s polimorfizmi APOL1 in tveganjem za nediabetično kronično ledvično bolezen (CKD), ni popolnoma razumljen. Predhodne študije so minimizirale vzročno vlogo krožečega proteina APOL1, zato so prizadevanja za razumevanjeledvicaPatogeneza se je osredotočila na APOL1, izražen v ledvičnih celicah. Odledvicacelice poročali expressAPOL1, theproksimalni tubulvzorci izražanja so v objavljenih poročilih nedosledni in ali APOL1 sintetiziraproksimalni tubulali se morda protein APOL1 v krvi filtrira in ponovno absorbira v proksimalnem tubulu, ostaja nejasno. Z uporabo obeh metod proteina in mRNA in situ je bil vzorec ledvične ekspresije APOL1 pregledan pri normalnih človeških in transgenih miših z umetnim kromosomom APOL1 bakterij z in brez proteinurije. Protein APOL1 in mRNA sta bila odkrita v podocitih in endotelijskih celicah, ne pa tudi v tubularnem epiteliju. V primeru proteinurije se zdi, da se plazemski protein APOL1 ne filtrira ali ponovno absorbiraproksimalni tubul. Vzporedni pregled komercialnih protiteles, uporabljenih v predhodnih študijah, kaže, da prvotna poročila o APOL1 v proksimalnih tubulih verjetno odražajo nespecifičnost protiteles. Kot taka bi morala ekspresija APOL1 v podocitih in endoteliju ostati v središču mehaničnih študij pri APOL1-posredovanihledvicabolezni.
Uvod
Polimorfizmi v genu APOL1 prispevajo k znatnemu tveganju za več oblik kronične nediabetične bolezniledvicabolezen (CKD) [1–3]. To tveganje izhaja iz kombinacije recesivnega dedovanja variant alelov APOL1 in izpostavljenosti okoljskemu stresorju. Patogena funkcija različic APOL1 in kako medsebojno delujejo z okoljskim stresorjem, da povzročijo kronično ledvično bolezen, nista povsem razumljena. Čeprav je APOL1 konstitutivno prisoten v obtoku, so predhodne študije zmanjšale vzročno vlogo krožečega proteina APOL1 [4–7] in prizadevanja za razumevanjeledvicaPatogeneza se je osredotočila na APOL1, izražen v ledvičnih celicah. Vzorec izražanja APOL1 v ledvicah ostaja nejasen z objavljenimi neskladji med imunohistokemijo in rezultati hibridizacije mRNA in situ, predvsem obilnega proteina APOL1, opaženega v epiteliju proksimalnega tubula [8–10]. Ker je APOL1 v krvi veliko, ni jasno, ali se APOL1 filtrira, zlasti v primeru proteinurije, kar bi lahko povzročilo reabsorpcijo proteina APOL1proksimalni tubul. Pojav APOL1 v proksimalnem tubulu, bodisi z gensko ekspresijo ali reabsorpcijo iz filtrata, bi kazal na potencialno pomembno vlogoproksimalni tubulv patogenezi kronične ledvične bolezni1-, povezane z APOL.
APOL1 v obtoku je vezan na 500 kDa delec HDL3, znan kot tripanolitični faktor 1, 1000 kDa lipidno reven kompleks IgM, znan kot tripanolitični faktor 2, in morda druge lipidno revne visoko molekularne komplekse, povezane s komplementom dejavniki [7, 11–13]. Proteini, ki jih proizvajata dva s CKD povezana variantna alela APOL1, G1 in G2, vežeta tripanolitične faktorje z visoko molekulsko maso, podobno skupnemu alelu G0 [14]. Čeprav je protein APOL1 (42,5 kDa) dovolj majhen, da preide mejo omejitve velikosti pregrade glomerularne filtracije, ni znano, da kroži neodvisno od teh kompleksov z visoko molekulsko maso [15]. Vendar pa je mogoče lipoproteine in druge sestavine HDL filtrirati [16] in v primeru proteinurije se lahko zdi, da infiltrirajo beljakovine z večjo molekulsko maso, ki jih običajno omejuje filtracijska pregrada. Ni jasno, ali je mogoče komplekse, ki vsebujejo APOL1 ali APOL1-, filtrirati v okolju proteinurije.
Da bi rešili ta vprašanja, smo pregledali ekspresijo gena APOL1 in beljakovin pri ljudehledvicatkivo in ledvice iz humaniziranih transgenih mišjih modelov, ki poustvarijo izvorno človeško izražanje APOL1. Za te študije smo potrdili komercialna protitelesa proti APOL1 za specifičnost, ki je morda prispevala k predhodnim neskladjem v vzorcih izražanja ledvic. Poleg tega so bili narejeni modeli transgenih miši APOL1proteinuričenz medsebojnim križanjem z modelom s HIV povezane nefropatije (HIVAN), kronične ledvične bolezni, močno povezane s prenašanjem rizičnih alelov APOL1, da bi ugotovili, ali bi proteinurija spremenila videz beljakovine APOL1 v tubulnem epiteliju.
Kliknite za organskoCistanche za kronično ledvično bolezen
Materiali in metode
Človeško tkivo in modeli miši
Človeški, fiksiran s formalinom in v parafinledvica(n {{0}}) in jetrno (n=3) tkivo iz normalnih robov resekcij raka je bilo pridobljeno iz Biorepository Lerner Research Institute Cleveland Clinic. Tri transgene mišje linije, ki izražajo 47 kb človeški genomski fragment v bakterijskem umetnem kromosomu (BAC), ki zajema promotorske in kodirne regije človeškega gena APOL1 za vsak alel G0, G1 ali G2, so bile predhodno opisane [17, 18]. Vsaka od transgenih linij BAC-APOL1 je bila �10 generacij povratno križana s FVB/Nj, genetskim ozadjem, dovzetnim za HIVAN. Mišji model HIVAN, uporabljen za induciranje proteinurije, je bil Tg26 HIVAN4 congenic [19], ki razvije proteinurijo in progresivno žariščno segmentno glomerulosklerozo kot starševski model Tg26 (JacksonLaboratory #22354), vendar je napredovanje bolezni počasnejše. V vseh študijah so ledvično bolezen spremljali tedensko po odstavitvi z merjenjem proteinurije (tj. količine beljakovin v spontano izločenem urinu) z analizo urina z uporabo diagnostičnih merilnih paličic (Uristix, Siemens Healthcare). Humana končna točka za ledvično bolezen v tem modelu, ki jo je odobril IACUC, je bila proteinurija, ki je na merilni paličici dosegla 4 plus. Nobena žival ni dosegla te humane končne točke pred vnaprej določeno končno točko študije, saj je ta študija zahtevala zgodnjo stopnjo ledvične disfunkcije (proteinurija na merilni paličici od 2 plus do 3 plus) za delovanje.ledviceše sposobni filtracije in reabsorpcije. Vse živali so ohranile normalno težo in pokazale tipično nego in raven aktivnosti ter med študijo niso imele bolečin ali stiske. Vse živali so dvakrat tedensko spremljali veterinarski tehniki, ki niso bili povezani s to študijo, za splošno zdravje in dobro počutje in nobena žival ni potrebovala analgetikov ali druge podporne oskrbe. Vsaka linija transgene miši BAC-APOL1 je bila križana z mišjim modelom HIVAN4 in žrtvovana pri 8– 10 tedna starosti, ko je njihova ledvična bolezen napredovala do ravni proteinurije 2 plus glede na urinsko merilno paličico (G0 n=15, G1 n=11, G2 n=9). Končni odvzem urina, krvi in tkiva je bil izveden pod globoko anestezijo z izofluranom, ki ji je takoj (medtem ko je še pod anestezijo) sledila evtanazija z dislokacijo materničnega vratu. Albuminurijo so ocenili z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu 1 ul urina, čemur je sledilo barvanje s kumasom. Uporabo človeškega tkiva je pregledala in odobrila klinika Cleveland IRB(IRB-06-050). Informirano soglasje je bilo opuščeno, ker se je tkivo štelo za zavrženo in so bili zbrani podatki, ki jih ni bilo mogoče identificirati. Vse študije na živalih so pregledali in odobrili institucionalni odbori za oskrbo in uporabo živali na kliniki Cleveland in univerzi Case Western Reserve (IACUC-2430).
Tkivna imunofluorescenca
Fiksirana s formalinom, vdelana v parafinledvicaodseki tkiva so bili izpostavljeni antigenretrieval, kot je opisano prej [8]. Protitelesa, uporabljena za preučevanje ekspresije APOL1 v tem prispevku, so bila kunčja protičloveška APOL1 (Sigma, HPA018885, lot E105260, razredčitev 1:400). Poleg drugih komercialnih monoklonskih protiteles so bili ovrednoteni tudi številni loti tega kunčjega poliklonskega protitelesa Sigma in rezultati so povzeti. v dodatni tabeli 1A 1C in dodatni sliki 1 v podatkih S1. Opozoriti je treba, da je veliko teh serij poliklonskih protiteles izčrpanih in pri Sigmi niso več na voljo. Druga primarna protitelesa vključujejo zajčja protitelesa proti mišjim APOA1 (ThermoFisher, razredčitev 1:500), kozja protitelesa proti mišjim CD31 (R&D Systems, razredčitev 1:200), anti-nefrin morskih prašičkov (USB, 1:200) in mišje protitelesa proti GLEPP1 ( darilo Rogerja Wigginsa, 1:50). Za označevanje smo uporabili lektin Lotus tetragonolobus, označen s FITC (VectorLabs).proksimalni tubulcelice, kot je opisano prej [8]. Za testiranje komercialnih protiteles proti človeškemu APOL1 so bila ledvična tkiva fiksirana z različnimi metodami in v parafin vdelana za imunohistokemijo z uporabo različnih metod pridobivanja antigena. Podrobnosti za vsako od teh metod obdelave so navedene v Dodatnih podrobnih metodah v podatkih S1.
Ekspresija gena APOL1 in beljakovin
Koncentracija proteina APOL1 v plazmi je bila določena z uporabo elektrokemiluminescenčnega imunskega testa Meso Scale Discovery, kot je opisano prej [5]. Koncentracija je bila določena glede na znano raztopino človeškega lipoproteina visoke gostote, kalibrirano s tekočinsko kromatografijo in masno spektrometrijo. Serumske ravni beljakovin APOL1 in APOA1 so primerjali z uporabo Westernblottinga, kot je opisano prej [20].
mRNA in situ hibridizacija
Ekspresijo gena APOL1 so pregledali pri miših in človekuledvicain jetrno tkivo z uporabo hibridizacije mRNA in situ. Ročni komplet za hibridizacijo RNAScope in situ (ACDBio) je bil uporabljen za tkivo, fiksirano s formalinom in parafinom, po navodilih kompleta za detekcijo z enojno ali dvojno sondo. Sonde so vključevale človeški APOL1 (kataloška številka 439871), mišji nefrin (Nphs1, kataloška številka 433571) in mišji CD31 (Pecam1, kataloška številka 316721). Predhodne obdelave so bile 15-minutno vrenje in 30-minutna razgradnja s proteazo. In situhibridizacijski signal se pojavi kot pike; ena pika na deset celic je pričakovano ozadje.
Rezultati
Več komercialnih protiteles proti človeški APOL1 (dodatna tabela 1A v podatkih S1) je bilo pregledanih glede specifičnosti za človeški APOL1 z uporabo izvlečkov tkiva ali beljakovin iz človeka in mišiledvicein celice. Ker miši nimajo ortologa človeškega APOL1, mišje celice in tkiva ne smejo biti imunoreaktivni na protitelesa proti človeškemu APOL1. Pri Western blotingu je večina komercialnih monoklonskih in poliklonskih protiteles lahko odkrila APOL1, čeprav jih je več šibko odkrilo z močnejšim odkrivanjem nespecifičnih proteinov (želi pasovi, ki niso sovpadali z molekulsko maso APOL1, dodatna tabela 1B v podatkih S1). Večina protiteles je zaznala dodatne nespecifične beljakovine, ki so se razlikovale glede na vir beljakovinskih izvlečkov (dodatna tabela 1B v podatkih S1). Nekatere od teh nespecifičnih gelskih pasov je bilo mogoče odstraniti s predhodno obdelavo beljakovinskih ekstraktov z deglikozilacijskimi encimi (ni prikazano), kar kaže, da je bilo prepoznavanje epitopa odvisno od glikanov. Pri imunohistokemijskem testiranju so mišjo ledvico divjega tipa, ki je bila uporabljena kot negativna kontrola, primerjali s transgeno mišjo ledvico APOL1 (dodatna tabela 1C v podatkih S1). Številna protitelesa proti APOL1 so pomotoma zaznala beljakovine pri miši divjega tipaledvice, vključno z zelo močnim imunskim obarvanjem v tubulih (dodatna slika 1 v podatkih S1). Na podlagi teh validacijskih študij smo izbrali serijo poliklonskih protiteles Sigma z omejenim odkrivanjem izven cilja, da bi preučili vzorce izražanja APOL1.
V človeškemledvice, je bil protein APOL1 odkrit z imunofluorescenco v glomerulih, ne pa tudi v tubulih (slika 1A). Podobne vzorce izražanja v človeških ledvicah so opazili z uporabo hibridizacije mRNA in situ. MRNA APOL1 je bila prisotna v glomerulih, peritubularnih kapilarah in večjih žilah ledvic, vendar ne v nobenem segmentu tubulov (slika 1B). Predhodna študija prejemnikov človeških jeter je pokazala, da krožeči protein APOL1 večinoma proizvajajo jetra [21]. V človeških jetrih so bili vzorci izražanja proteina APOL1 in mRNA podobni, z izražanjem, odkritim v hepatocitih in vaskularnem endoteliju. Pri miših je bila ekspresija APOL1 kvalitativno nižja v hepatocitih cone 1 in 2 v primerjavi s hepatociti cone 3, medtem ko so bili pri ljudeh hepatociti v vseh treh conah podobni v ravni ekspresije (dodatna slika 2 v podatkih S1). Mišja jetrna tkiva so bila od zdravih odraslih, medtem ko so bila človeška jetrna tkiva normalni robovi iz resekcij raka, ki so imeli tudi histopatološke dokaze o steatozi, kar bi lahko prispevalo k tej razliki.
Cistanche - simptomi odpovedi ledvic
Opaženi vzorec izražanja v človeškem tkivu je bil potrjen v treh transgenih mišjih linijah, ki izražajo človeški BAC, ki zajema celotno genomsko regijo APOL1 bodisi za alele G0, G1 ali G2 [17, 18]. Proteina APOL1 je bilo veliko v podocitih in je bil prisoten tudi v endotelijskih celicah glomerularnih kapilar, peritubularnih kapilarah in endoteliju večjih žil (slika 2A). Vproksimalni tubulali kateri koli drug tubularni segment (slika 2B). Podobno kot pri ljudeh so imele transgene miši BAC-APOL1 obilo APOL1 v krvi (slika 3) in izražale protein APOL1 in mRNA v jetrnih hepatocitih (dodatna slika 2 v podatkih S1). Vledvica, bi lahko ta krožeči protein APOL1 odkrili tudi v krvi, ujetem v vaskularnih prostorih (slika 2B). V vzorcih izražanja APOL1 med mišmi z izražanjem APOL1-G0, -G1 ali -G2 ni bilo nobene razlike (slika 2B) in je v skladu s prejšnjimi študijami človeških biopsij bolnikov z različnimi APOL1 genotipi [8, 10, 22]. Vzorci izražanja proteina APOL1 so bili prav tako potrjeni z uporabo hibridizacije mRNA in situ (slika 4). Pregledani so bili vsi trije genotipi APOL1, vendar ni bilo razlik glede na genotip APOL1. Skladno s človeškimledvica(Slika 1) je bil APOL1 izražen v podocitih (celični tip potrjen z okoljskim označevanjem z Nphs1) in vaskularnem endoteliju (celični tip potrjen z okoljskim označevanjem s Pecam1), vključno z glomerularnimi kapilarami, peritubularnimi kapilarami in večjimi žilami. Ekspresija APOL1 ni bila zaznana vproksimalne tubuleali kateri koli drug cevast segment.
Slika 1. Ekspresija proteina APOL1 in mRNA pri človekuledvica. A. Ekspresija proteina APOL1 z imunofluorescenčno mikroskopijo z uporabo validiranih protiteles proti APOL1, s sočasnim imunskim barvanjem z GLEPP1 za identifikacijo podocitov in DAPI kot jedrnega madeža. B. Ekspresija mRNA APOL1 s hibridizacijo in situ. Ekspresija je bila očitna v podocitih ("P") in vaskularnem endoteliju glomerulnih kapilar ("E"), peritubularnih kapilarah ("1", puščice) in epiteliju večjih žil ("2"), vendar ne v tubularnem epiteliju. Lestvica=40 μm
Cistanche-ledvica
Nobena od miši BAC-APOL1 ni spontano razvila proteinurije, kar je skladno s prvotnim opisom teh mišjih modelov [17, 18], vendar je razvila veliko proteinurija pri križanju z modelom nefropatije, povezane s HIV (slika 5). Z uporabo imunofluorescence so pri mišji divjega tipa in HIVAN opazili imunsko obarvanje z nespecifičnimi protitelesi proti APOL1ledvice, večinoma v kapsuli Bowman (slika 6A). Pri križanih miših s proteinurijo je bil protein APOL1 očiten v glomerulih, vendar protein APOL1 ni bil zaznan v infiltratu ali znotrajproksimalne tubule(Slika 6B). Z Western blotom APOL1 ni bilo mogoče odkriti v izločenem urinu proteinuričnih miši (podatki niso prikazani). Prav tako ni bilo nobene razlike v vzorcu izražanja APOL1 medproteinuričenAPOL{{0}}G0, -G1 ali -G2 ekspresirane miši. Te iste mišje ledvice so bile imunsko obarvane na APOA1 in apolipoprotein, ki je filtriran, kot pozitivna kontrola za vaskularno porazdelitev inproksimalni tubulvzorci reabsorpcije. Podobno kot APOL1 je bil APOA1 v plazmi zlahka odkrit v glomerularnih kapilarnih lumnih. Ker pa je APOA1 filtriran, je bil prisoten tudi v kapljicah reabsorpcije proteina na meji krtače proksimalnega tubula (slika 6C). Ob prisotnosti proteinurije se je število in velikost reabsorpcijskih kapljic APOA1-, ki vsebujejoproksimalni tubulmeja čopiča. Pri APOL1 niso opazili podobnega vzorca v proksimalnem tubulu.
Slika 2. Ekspresija proteina APOL1 v transgeni mišji BAC-APOL1ledvice. A. Imunofluorescentno barvanje za APOL1, nefrin (za identifikacijo podocitov) in CD31 (za identifikacijo endotelijskih celic) v BAC-APOL1 transgeni mišji ledvici (prikazana je miš G1). B. Primerjava vzorcev izražanja APOL1 v vseh treh transgenih linijah APOL1.Proksimalni tubuliidentificirali z označevanjem s fluorescentnim lektinom Lotus tetragonolobus (LT). APOL1 je bil prisoten v vaskularnem endoteliju (konice puščic), v podocitih (puščice) in ujet v vaskularnih prostorih (�), ne pa tudi v tubularnem epiteliju. Merilna vrstica=40 μm
Slika 3. Protein APOL1 v obtoku v modelih transgenih miši BAC-APOL1. Ravni beljakovine APOL1 v plazmi so bile izmerjene z imunskim testom pri transgenih miših v primerjavi s starostno ujemajočimi se divjimi (WT) sorodniki iz legla (WT,n=10; G0, n=6; G1, n { {11}}; G2, n=10; vse živali so bile samci, stare približno 21 tednov). Ravni izražanja APOL1 v vsaki transgeni liniji so bile bistveno drugačne od WT (P<0.0001). data="" are="" mean±sd,="" one="" measurement="" per="" animal,="" with="" significance="" determined="" by="" one-way="">
Diskusija
Specifičnost protiteles je bila priznana kot eden najpomembnejših izzivov, ki vplivajo na ponovljive raziskave [23]. Mi in drugi smo prvotno poročali, da je prisoten protein APOL1proksimalne tubulenormalnih in bolnih oseb [8, 9]. Vendar pa je naše nadaljnje delo z drugimi protitelesi proti APOL1 in uporaba hibridizacije mRNA in situ pokazala, da APOL1 ni bil izražen v proksimalnih tubulih [10]. Preostala možnost je, da se kri proteinina APOL1 filtrira in ponovno absorbira, kar povzroči pojav beljakovine APOL1 vproksimalne tubule. Z uporabo in situ metod, ki se ne zanašajo na protitelesa, skupaj z novo dostopnimi človeškimi transgenimi mišmi BAC-APOL1, niti proteina APOL1 niti mRNA APOL1 ni bilo mogoče odkriti v tubulnem epiteliju. Pri nastavitvi proteinurije tudi APOL1 ni bil filtriran. V naših rokah kunčje poliklonsko protitelo Sigma dosledno prepozna človeški APOL1, vendar ima medsebojne razlike pri prepoznavanju drugih proteinov. Sigma kunčji poliklonski lot, uporabljen v tukajšnjih študijah, ne posnema močnegaproksimalni tubulobarvanje, opaženo v prejšnjih serijah, prodanih pod isto kataloško številko. Čeprav bi monoklonska protitelesa odpravila variacije, ki so značilne za serije proizvodnje poliklonskih protiteles, so imela testirana komercialna monoklonska protitelesa znatno nespecifičnost ali slabo občutljivost za APOL1. Nedavno poročilo, ki opisuje razvoj in validacijo velikega števila monoklonskih protiteles proti človeškemu APOL1, tudi ni identificiralo obarvanja proksimalnih tubulov pri človekuledvice[24].
Dokazi protiproksimalni tubulekspresija APOL1 ali vloga proksimalnega tubula pri kroničnih boleznih ledvic, povezanih z APOL1-, se kopiči iz več drugih skupin. Študija, ki je uporabljala podobne humanizirane modele transgene miši APOL1, ustvarjene s fosmidi, prav tako ni našla ekspresije APOL1 v proksimalnem tubulu z uporabo metod za odkrivanje beljakovin in mRNA [25]. Uporaba transgenih modelov z inducibilno ekspresijo APOL1, ki omejujejo ekspresijo na podocite ali tubule, je ugotovila, da se proteinurija in ledvična patologija pojavita le, če se APOL1 izraža v podocitih in ne v tubulih [6]. Kot potrjujoč dokaz pri ljudeh več študij, ki so preučevale proteom človeškega urina [26–30], ni identificiralo proteina APOL1 v urinu, kar tudi kaže, da APOL1 ni filtriran v nobeni zaznavni količini.
Naše študije ne izključujejo možnega sproščanja majhnih količin APOL1 v primarni filtrat iz podocitov bodisi z izločanjem ali pasivnim sproščanjem, ko podocit umre in se lizira. Za razliko od APOL1, ki ga izražajo in izločajo hepatociti, glavni podociti s transkriptinom APOL1 nimajo popolnega signalnega peptida [15] in ni prepričljivih dokazov, da podociti izločajo APOL1. Druga možnost je, da so nekatere študije opazile, da lahko z boleznijo povzročene visoke ravni APOL1 proizvajajo tudi redke alternativno spojene izooblike z različnimi signalnimi peptidnimi sekvencami, ki morda omogočajo izločanje [24, 31–33]. Ti možni alternativni viri infiltrata APOL1 bi bili pod mejami zaznavnosti v testih, ki smo jih mi in drugi raziskovalci uporabili priledvicatkiva in urina in bi bila malo verjetna razlaga za robustno izražanje APOL1, o katerem so prej poročali v proksimalnih tubulih. Poleg tega ni jasno, ali bi bila ta morebitna nizka raven infiltrata APOL1, pridobljenega iz podocitov, fiziološkega pomena, glede na to, da pri ljudeh bazalne ravni izražanja APOL1 niso povezane s kronično ledvično boleznijo. Naše študije tudi ne morejo izključiti možnih razlik v izražanju APOL1 med ljudmi in transgenimi mišmi BAC-APOL1. Delovanje podocitov inproksimalne tubulepri filtraciji in reabsorpciji krvi sta pri ljudeh in miših v osnovi podobni, vendar pa obstajajo priznane omejitve uporabe miši v zvezi s podvajanjem človeških glomerularnih ledvičnih bolezni [34].
Slika 4. Ekspresija mRNA APOL1 v modelih transgenih miši BAC-APOL1. Hibridizacija dupleksne mRNA in situ za ekspresijo genov (AD)APOL1 in nefrina (Nphs1) ter ekspresijo (EK) APOL1 in CD31 (Pecam1) za identificirane podocite oziroma endotelijske celice. Ekspresija APOL1 je bila odkrita v peritubularnih kapilarah (puščice "1"), arteriolah (puščice "2"), glomerularnih kapilarah (puščice "3"), podocitih (puščice "4") in večjih (interlobularnih) arterijah ("5") in žile ("6"), vendar neproksimalne tubule("PT") ali katerega koli drugega cevastega segmenta. Prikazane slike so iz miši BAC-APOL1-G0 in BAC-APOL1-G1.
Slika 5. Modeli transgenih miši BAC-APOL1 so razvili podobno proteinurijo, ko so jih križali z modelom miši HIVAN. A. Primer proteinurije pri enojnih in dvojnih transgenih miših, ocenjenih z gelsko elektroforezo urina (obarvanje Coomassie). Konica puščice označuje albumin in dodatne beljakovine v urinu z nizko molekulsko maso (zvezdica) so normalna najdba pri miših. B. Western blot mišjega seruma pri istih enojnih in dvojnih transgenih miših, ki kaže vzdrževanje visokih ravni serumskega proteina APOL1 v okolju proteinurije. APOA1 Western blot kot kontrola skupnega serumskega proteina, ki je prosto filtriran. Prikazan je reprezentativni madež; število pregledanih živali v vsaki skupini genotipa je bilo: divji tip, n=3; HIVAN4, n=6; G0 x HIVAN4, n=6; G1 x HIVAN4, n=3; G2 x HIVAN4,n=4
Tukaj predstavljeno delo in druge objavljene študije so pokazale pomembne podobnosti med vzorci izražanja APOL1 pri ljudeh [8–10, 24] in transgenih miših [17, 18, 24]. Poustvarljivo in dosledno opažanje iz teh kombiniranih študij je izražanje APOL1 v podocitih in v endotelijskih celicah glomerularnih kapilar, peritubularnih kapilar in večjih krvnih žil. Poleg tega opažanja tukaj posredno podpirajo zaključke iz predhodnih študij [4, 5], da krožeči protein APOL1 verjetno ne bo prispeval kledvicapatogenezo bolezni, saj ni vir v ledvicah lokaliziranega APOL1. Vrednotenje prispevka APOL1, izraženega s podociti in endotelijem, je logičen poudarek za prihodnje študije, ki preučujejo mehanizem prispevkov variant tveganja APOL1 k patogenezi KLB.
Slika 6. APOL1 se ne pojavi v proksimalnih tubulih vproteinuričenTransgene miši BAC-APOL1. A. Nadzor imunskega barvanja pri netransgenih (divjih) in proteinuričnih miših HIVAN4 za APOL1 skupaj s fluorescentno vezavo lektina Lotustetragonolobus ("LT") za razmejitevproksimalni tubulmeja čopiča. Ker miši divjega tipa in HIVAN4 nimajo APOL1, je obarvanje, opaženo v parietalnih celicah (puščice), artefakt. B. Imunsko barvanje za APOL1 vproteinuričenBACtransgene miši vsakega genotipa APOL1 (prikazane so reprezentativne slike, število pregledanih živali v vsaki skupini genotipa je bilo enako kot za sliko 5). Slike kažejoproksimalne tubulena prehodu s kapsulo Bowman. Okvirno območje je povečano pod vsako ploščo skupaj z izoliranimi fluorescentnimi kanali, prikazanimi črno-belo. C. Pozitivno kontrolno imunsko barvanje za filtriran lipoprotein, APOA1 in fluorescentno označen Lotus tetragonolobus ("LT") lektin. Prikazani sta APOL1-G0miš in APOL1-G0 x HIVAN4 dvojna transgena miš s proteinurijo; pod vsako zadevno barvno ploščo so posamezni fluorescentni kanali (črno-beli) okvirjanega območja bodisi za LT lektin ali APOA1. Bele puščice označujejo glomerularne kapilare, ki vsebujejo krožeči protein APOA1 v kapilarnih lumnih, rdeče puščice označujejo APOA1 v kapljicah reabsorpcije proteina na krtačnem robu proksimalnih tubulov. Lestvica=40 μm.
Podporne informacije
Podatki S1. Dodatne slike in tabele. (PDF)
S1 Surove slike. Izvirne, neobrezane gel slike. (PDF)
Zahvala
Zahvaljujemo se Williamu Baldwinu in Nini Dvorina za pomoč pri študijah validacije protiteles
Avtorski prispevki
Konceptualizacija: Sethu M. Madhavan, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, JohnF. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Kuriranje podatkov: Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin, Leslie A. Bruggeman. Formalna analiza: Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin ,Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Pridobitev sredstev: John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Preiskava: Natalya A. Blessing, Zhenzhen Wu , Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Leslie A. Bruggeman. Metodologija: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, LeslieA. Bruggeman. Administracija projekta: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Viri: Myung K. Shin. Nadzor: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Preverjanje: Myung K. Shin. Pisanje – izvirni osnutek: Natalya A. Blessing, Leslie A. Bruggeman. Pisanje – pregled in urejanje: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, MichelleChen, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A.Bruggeman.
Reference
1. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, et al. Povezava tripanolitičnih različic ApoL1 zledvicabolezni pri Afroameričanih. Znanost. 2010; 329(5993):841–5.https://doi.org/10.1126/science.1193032 PMID: 20647424
2. Genovese G, Tonna SJ, Knob AU, Appel GB, Katz A, Bernhardy AJ, et al. Alel tveganja za fokalno segmentno glomerulosklerozo pri Afroameričanih se nahaja v regiji, ki vsebuje APOL1 in MYH9. Kidney Int. 2010; 78 (7): 698–704. https://doi.org/10.1038/ki.2010.251 PMID: 20668430
3. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et al. Missense mutacije v genu APOL1 so močno povezane s tveganjem za končno ledvično bolezen, ki so jo prej pripisovali genu MYH9. Hum Genet. 2010; 128 (3): 345–50. https://doi.org/10.1007/s00439-010-0861-0 PMID:20635188
4. Bruggeman LA, O'Toole JF, Ross MD, Madhavan SM, Smurzynski M, Wu K, et al. Raven apolipoproteina L1 v plazmi ni v korelaciji s kronično ledvično boleznijo. J. Am. Soc. Nefrol. 2014; 25 (3): 634–44. https://doi.org/10.1681/ASN.2013070700 PMID: 24231663
5. Kozlitina J, Zhou H, Brown PN, Rohm RJ, Pan Y, Ayanoglu G, et al. Plazemske ravni Risk-VariantAPOL1 niso povezane z ledvično boleznijo v kohorti, ki temelji na populaciji. J. Am. Soc. Nefrol.2016; 27(10):3204–19. https://doi.org/10.1681/ASN.2015101121 PMID: 27005919
6. Beckerman P, Bi-Karchin J, Park AS, Qiu C, Dummer PD, Soomro I, et al. Inducira transgeno izražanje različic tveganja človeškega APOL1 v podocitihledvicabolezen pri miših. Nat. Med. 2017; 23 (4): 429–38. https://doi.org/10.1038/nm.4287 PMID: 28218918
7. Weckerle A, Snipes JA, Cheng D, Gebre AK, Reisz JA, Mura M, et al. Karakterizacija krožečih proteinskih kompleksov APOL1 pri Afroameričanih. J Lipid Res. 2016; 57 (1): 120–30. https://doi.org/10.1194/jlr.M063453 PMID: 26586272
8. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Ganesan S, Bruggeman LA, Sedor JR. Lokalizacija APOL1 pri normalni ledvični in nediabetični ledvični bolezni. J. Am. Soc. Nefrol. 2011; 22(11):2119–28.https://doi.org/10.1681/ASN.2011010069 PMID: 21997392
9. Ma L, Shelness GS, Snipes JA, Mura M, Antinozzi PA, Cheng D, et al. Lokalizacija proteina APOL1 in mRNA pri človekuledvica: neobolelo tkivo, primarne celice in ovekovečene celične linije. J. Am.Soc. Nefrol. 2015; 26 (2): 339–48. https://doi.org/10.1681/ASN.2013091017 PMID: 25012173
10. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Barisoni L, Thomas DB, Ganesan S, et al. Različice APOL1 spremenijo konformacijsko dinamiko C-terminala in vezavo na SNARE protein VAMP8. JCI Insight.2017; 2(14):e92581. https://doi.org/10.1172/jci.insight.92581 PMID: 28724794
11. Raper J, Fung R, Ghiso J, Nussenzweig V, Tomlinson S. Karakterizacija novega tripanosomskega litičnega faktorja iz človeškega seruma. Odpornost na okužbe. 1999; 67(4):1910–6. https://doi.org/10.1128/IAI.67.4.1910-1916.1999 PMID: 10085035
12. Smith AB, Esko JD, Hajduk SL. Ubijanje tripanosomov s človeškim haptoglobinom povezanim proteinom. Znanost. 1995; 268(5208):284–6. https://doi.org/10.1126/science.7716520 PMID: 7716520
13. Vanhamme L, Paturiaux-Hanocq F, Poelvoorde P, Nolan DP, Lins L, Van Den Abbeele J, et al. Apolipoprotein LI je tripanosomski litični faktor človeškega seruma. Narava. 2003; 422(6927):83–7. https://doi.org/10.1038/nature01461 PMID: 12621437
14. Gutierrez OM, Judd SE, Irvin MR, Zhi D, Limdi N, Palmer ND, et al. Različice tveganja za nefropatijo APOL1 so povezane s spremenjenimi profili lipoproteinov visoke gostote pri Afroameričanih. Presaditev dialize Nephrol. 2016; 31 (4): 602–8. https://doi.org/10.1093/ndt/gfv229 PMID: 26152403
15. Duchateau PN, Pullinger CR, Cho MH, Eng C, Kane JP. Genska družina apolipoproteina L: tkivno specifična ekspresija, spajanje, promotorske regije; odkritje novega gena. J Lipid Res. 2001; 42 (4): 620–30. PMID: 11290834
16. Yang H, Fogo AB, Kon V. Ledvice: ključni modulatorji ravni in delovanja lipoproteinov visoke gostote. CurrOpin Nephrol Hypertens. 2016; 25 (3): 174–9. https://doi.org/10.1097/MNH.0000000000000217 PMID:27008596
17. Okamoto K, Rausch JW, Wakashin H, Fu Y, Chung JY, Dummer PD, et al. RNK alela tveganja APOL1 prispeva k toksičnosti za ledvice z aktiviranjem protein kinaze R. Comm. Biol. 2018; 1:188. https://doi.org/10.1038/s42003-018-0188-2 PMID: 30417125
18. Ryu JH, Ge M, Mescher S, Rosenberg AZ, Descente M, Roshanravan H, et al. Različice ledvičnega tveganja APOL1 spodbujajo kopičenje holesterola v tkivih in gojenih makrofagih transgenih miši APOL1. PLoS One. 2019; 14(4):e0211559. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211559 PMID:30998685
19. Prakash S, Papeta N, Sterken R, Zheng Z, Thomas RL, Wu Z, et al. Identifikacija lokusa dovzetnosti za nefropatijo HIVAN4. J. Am. Soc. Nefrol. 2011; 22 (8): 1497–504. https://doi.org/10.1681/ASN.2011020209 PMID: 21784893
20. Bruggeman LA, Wu Z, Luo L, Madhavan SM, Konieczkowski M, Drawz PE, et al. Transgeni modeli APOL1-G0 ali APOL1-G2 razvijejo preeklampsijo, vendar neLedvicaBolezen. J. Am. Soc. Nefrol. 2016; 27(12):3600–10. https://doi.org/10.1681/ASN.2015111220 PMID: 27026370
21. Shukha K, Mueller JL, Chung RT, Curry MP, Friedman DJ, Pollak MR, et al. Večino ApoL1 izločajo jetra. J. Am. Soc. Nefrol. 2017; 28 (4): 1079–83. https://doi.org/10.1681/ASN.2016040441 PMID:27932478
22. Sampson MG, Robertson CC, Martini S, Mariani LH, Lemley KV, Gillies CE, et al. Integrativna genomika identificira nove povezave z genotipi tveganja APOL1 pri temnopoltih subjektih NEPTUNE. J. Am. Soc.Nephrol. marec 2016; 27 (3): 814–23. https://doi.org/10.1681/ASN.2014111131 PMID: 26150607
23. Bradbury A, Pluckthun A. Ponovljivost: Standardizirajte protitelesa, uporabljena v raziskavah. Narava. 2015; 518(7537):27–9. https://doi.org/10.1038/518027a PMID: 25652980
24. Scales SJ, Gupta N, De Mazière AM, Posthuma G, Chiu CP, Pierce AA, et al. Specifična protitelesa za apolipoprotein L1- zaznajo endogeni APOL1 v endoplazmatskem retikulumu in na plazemski membrani podocitov. J. Am. Soc. Nefrol. 2020; 31 (9): 2044–64. https://doi.org/10.1681/ASN.2019080829 PMID: 32764142
25. Aghajan M, Booten SL, Althage M, Hart CE, Ericsson A, Maxvall I, et al. Zdravljenje s protismiselnimi oligonukleotidi izboljša z IFN-gama povzročeno proteinurijo pri transgenih miših APOL1-. JCI Insight. 2019; 4(12).https://doi.org/10.1172/jci.insight.126124 PMID: 31217349
26. Adachi J, Kumar C, Zhang Y, Olsen JV, Mann M. Človeški urinski proteom vsebuje več kot 1500 proteinov, vključno z velikim deležem membranskih proteinov. Genome Biol. 2006; 7(9):R80. HTTPS://doi.org/10.1186/gb-2006-7-9-R80 PMID: 16948836
27. Li QR, Fan XK, Li RX, Dai J, Wu CC, Zhao SL, et al. Celovit pristop brez predfrakcioniranja na ravni beljakovin za človeški urinski proteom: dotikanje fosforilacije v urinu. Rapid CommMas Spectrom. 2010; 24(6):823–32. https://doi.org/10.1002/rcm.4441 PMID: 20187088
28. Marimuthu A, O'Meally RN, Chaerkady R, Subbannayya Y, Nanjappa V, Kumar P, et al. Obsežen zemljevid človeškega urinskega proteoma. J Proteome Res. 2011; 10(6):2734–43. https://doi.org/10.1021/pr2003038 PMID: 21500864
29. Santucci L, Candiano G, Petretto A, Bruschi M, Lavarello C, Inglese E, et al. Od sto do tisoč: razširitev normalnega človeškega urinoma. Kratek podatki. 2014; 1:25–8. https://doi.org/10.1016/j.dib.2014.08.006 PMID: 26217681
30. Zhao M, Li M, Yang Y, Guo Z, Sun Y, Shao C, et al. Celovita analiza in opomba o človeškem normalnem urinskem proteomu. Znanstvena poročila. 2017; 7(1):3024. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03226-6 PMID: 28596590
31. Cheatham AM, Davis SE, Khatua AK, Popik W. Blokiranje 5' mesta spoja eksona 4 z morfolinooligomerom sproži preklop izoforme proteina APOL1. Znanstvena poročila. 2018; 8(1):8739. https://doi.org/10.1038/s41598-018-27104-x PMID: 29880816
32. Khatua AK, Cheatham AM, Kruzel ED, Singhal PC, Skorecki K, Popik W. Eksonsko 4-kodirano zaporedje je glavna determinanta citotoksičnosti apolipoproteina L1. Am J Physiol Cell Physiol. 2015; 309(1):C22–37. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00384.2014 PMID: 25924622
33. Nichols B, Jog P, Lee JH, Blackler D, Wilmot M, D'Agati V, et al. Poti prirojene imunosti uravnavajo gen za nefropatijo Apolipoprotein L1.LedvicaInt. 2015; 87 (2): 332–42. https://doi.org/10.1038/ki.2014.270 PMID: 25100047
34. Pippin JW, Brinkkoetter PT, Cormack-Aboud FC, Durvasula RV, Hauser PV, Kowalewska J, et al. Inducibilni modeli pridobljenih bolezni podocitov pri glodavcih. Am J. Physiol Renal Physiol. 2009; 296(2):F213–29. https://doi.org/10.1152/ajprenal.90421.2008 PMID: 18784259
