Avtoradiografsko slikanje [ 18F]-natrijevega fluorida nefrokalcinoze v ledvicah darovalca in presajenih ledvičnih alograftih

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nefrokalcinozaje prisoten v do 43 odstotkihledvicabiopsije alotransplantata eno leto po presaditvi in ​​je povezana s slabšim delovanjem presadka in slabim preživetjem presadka. Študirali smo [18F]-natrijev fluorid ([18F]-NaF) slikanje mikrokalcifikatov v donorskih ledvicah (n= 7) in eksplantiraliledvicaalografti (n= 13). Za histološko vrednotenje kalcifikacije (alizarin rdeče; barvanje po Von Kossa) in ex-vivo [18F]-NaF avtoradiografijo so uporabili tri serijske reze v parafinu. Slike so bile združene, da se oceni, ali območja mikrokalcifikacije ustrezajo območjem privzema [18F]-NaF. Na podlagi histoloških analiz so bile tubulointersticijske in glomerularne mikrokalcifikacije prisotne v 19/20 oziroma 7/20 vzorcih. Z uporabo avtoradiografije je bil privzem [18F]-NaF ugotovljen v 19/20 vzorcih, z bistveno večjo aktivnostjo sledilca vledvicaalotransplantata v primerjavi z vzorci ledvic umrlih darovalcev (p {{0}}.019). Barvanje aktivnih mikrokalcifikatov z alizarin rdečim je pokazalo dobro korelacijo (Spearmanov rho od 0.81, p < 0,001),="" barvanje="" konsolidiranih="" kalcifikatov="" von="" kossa="" pa="" je="" pokazalo="" pomembno,="" a="" šibko="" korelacijo="" (0,62,="" p="0.003)" z="" aktivnostjo="" [18f]-naf.="" ta="" korelacija="" med="" absorpcijo="" [18f]-naf="" ex="" vivo="" in="" histološko="" dokazanimi="" mikrokalcifikacijami="" je="" prvi="" korak="" k="" slikovni="" metodi="" za="" prepoznavanje="" mikrokalcinacij="" v="">nefrokalcinoza. To lahko privede do boljšega razumevanja etiologije mikrokalcinacij in njihovega vpliva na delovanje presajenih ledvic.

Kliknite za koristi ekstrakta cistanche pri bolezni ledvic

Nefrokalcinoza, opredeljen kot odlaganje kalcijevega oksalata (CaOx) ali kalcijevega fosfata (CaPhos) v parenhimu in tubulu, je pomemben dejavnik pri upadu delovanja presadka poledvicapresaditev1–3. Odlaganje CaOx in CaPhos pripisujejo visokim ravnem serumskega oksalata, serumskega kalcija in serumskega fosfata pri bolnikih s kroničnoledvicabolezen in/ali hiperparatiroidizem4,5. Pojavnostnefrokalcinoza, ki temelji na biopsijah ledvičnega alogenskega presadka, je 6 odstotkov po 6 mesecih, 25–43 odstotkov po enem letu in do 79 odstotkov po 10-letihledvicapresaditev5–7. Študije, ki so se osredotočale na biopsije ledvičnega alogenskega presadka v enem letu po presaditvi, so pokazale povezavo med zgodnjo prisotnostjo usedlin kalcija ter slabšo funkcijo presadka in slabim preživetjem presadka 4,8,9. Vendar pa ostaja nejasno, ali imajo te mikrokalcifikacije aktivno vlogo pri disfunkciji alogenskega presadka ali so zgolj pokazatelji dereguliranega metabolizma mineralov.

do danes,ledvicabiopsije alogenskega presadka so edina diagnostična metoda za oceno mikrokalcinacij po presaditvi. Neinvaziven in zanesljiv diagnostični pristop bi omogočil ponavljajoče se meritve, kar bi olajšalo sledenje kalcinacij skozi čas in intervencijske študije s potencialnim izboljšanjem rezultatov za delovanje presadka in preživetje presadka po presaditvi ledvice10.

Slikanje s pozitronsko emisijsko tomografijo/računalniško tomografijo (PET/CT) z [18F]-natrijevim fluoridom ([18F]-NaF) se uporablja v klinični praksi in eksperimentalnih študijah kot način slikanja skeleta in ožilja11–15. Medtem ko je zanesljiva vizualizacija vaskularnih mikrokalcifikacij ovirana s CT slikanjem, so rezultati ex-vivo [18F]-NaF mikroPET slikanja dobro korelirali s histološko dokazanimi mikrokalcifikacijami v človeških in živalskih žilnih vzorcih16,17. Poleg tega so rezultati več prospektivnih kliničnih študij pokazali, da je zgodnja vaskularna aktivnost [18F]-NaF dobro povezana tako z mikrokalcifikacijami, ki jih odkrije CT slikanje, kot še bolj zanimivo, s povečanjem velikosti teh kalcifikacij 18–20.

Tukaj predstavljamo rezultate dokazne študije o konceptu avtoradiografije za ex vivo uporabo [18F]-NaF slikanjanefrokalcinozapri darovalcihledvicein presajene ledvične alografte kot diagnostični pristop za vizualizacijo mikrokalcinacij.

Tabela 1.Ledvicaznačilnosti prejemnika presadka. V tej kohorti ni primerov hiperkalciemije; *razvrstitev Banfove klasifikacije alograftske patologije—201828; FSGS=žariščna segmentna glomeruloskleroza; IFTA=Intersticijska fbroza in tubularna atrofija; ustrezni rezultati avtoradiografije in histologije so predstavljeni v Dodatku S1.

Tabela 2. Pokojniledvicaznačilnosti darovalca. *Kardiovaskularna bolezen, opredeljena kot cerebrovaskularni dogodek, miokardni infarkt, žilna bolezen, ki zahteva invazivno intervencijo; **kot ugotavlja skupina za nabavo; Ustrezni rezultati avtoradiografije in histologije so predstavljeni v dodatnem S2; brez darovalcev s sladkorno boleznijo.

Rezultati

Vzorčna kohorta.

trinajstledvicavzorci so bili pridobljeni po transplantektomiji, mediano 33 [IQR 9–66] mesecev po presaditvi, od prejemnikov presadka s srednjo starostjo 51 [IQR 30–64] let. Transplantektomija je bila opravljena zaradi zavrnitve alogenskega presadka (Banf IIA in IIB) pri sedmih bolnikih, kronične arteriopatije alotransplantata pri dveh bolnikih, okužbe alogenskega presadka pri dveh bolnikih, primarne nefunkcionalnosti pri enem bolniku ter intersticijske fbroze in tubularne atrofije stopnje III pri enem bolniku. Osem od 13 (61,5 odstotka) bolnikov je imelo hiperparatiroidizem, sedem (53,8 odstotka) hiperfosfatemijo, pet (38,5 odstotka) sladkorno bolezen in nobeden od teh bolnikov ni imel znakovnefrokalcinozana kliničnem ultrazvoku ali anamnezi ledvičnih kamnov (tabela 1). Pridobljenih je bilo sedem vzorcev ledvic umrlih darovalcev od darovalcev s srednjo starostjo 65 let [IQR 64–71]. Štirje od sedmih (57,1 odstotka) darovalcev so imeli v preteklosti srčno-žilne bolezni, nobeden ni imel sladkorne bolezni in šest od sedmih (85,7 odstotka) je imelo aterosklerozo ledvičnega ožilja ob vizualnem pregledu, kar so potencialni dejavniki za zavrnitev teh darovalcev.ledvice(tabela 2).

Slika 1. Avtoradiografska slika privzema [18F]-natrijevega fluorida ([18F]-NaF) (A), s prekrivno sliko privzema [18F]-NaF z obarvanjem mikrokalcifikatov z rdečim alizarinom (B) in obarvanjem kalcifikatov von Kossa (C).

Avtoradiografija in histologija.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 odstotkov v 5 (25 odstotkov) od 20 vzorcev (slika 1 in slika 2A) (dodatni S1 in dopolnilni S2, ki prikazujeta avtoradiografijo in prekrivne slike za vse vzorce). Število območij [18F]-NaF je bilo znatno večje vledvicavzorcev alogenskega presadka v primerjavi s preminulim darovalcemledvicavzorcev z mediano 7.0 [IQR 4.0–15,5] in 2.0 [IQR 1.0–6.0 ] oziroma (p=0.019) (dopolnilni S3).

Tubulointersticijske mikrokalcifikacije, vizualizirane z obarvanjem z alizarin rdečim, so bile prisotne v 19 od 20 vzorcev, z mediano 5,5 [IQR 2–10,3] na vzorec, glomerularne mikrokalcifikacije pa so bile opažene v sedmih iz 20 vzorcev, z mediano 1 [IQR 1–3] na vzorec (slika 2B). V vzorcih ledvičnega alogenskega presadka so opazili znatno večje število mikrokalcifikacij v primerjavi z vzorci ledvic umrlih darovalcev, z mediano 9.0 [IQR 5.0–20.5] in 4,0 [IQR 1,0–4,0] oziroma (p=0.046) (dopolnilni S3). Pri barvanju po Von Kossi so tubulointersticijske kalcifikacije opazili v 18 od 20 vzorcev z mediano 2,5 [IQR 1–5] na vzorec, glomerularne kalcifikacije pa v sedmih od 20 vzorcev z mediano 1 [IQR 0–3 ] na vzorec (slika 2C). Število kalcinacij se ni bistveno razlikovalo medledvicavzorcev alograftov in vzorcev ledvic umrlih darovalcev, z mediano 4.0 [IQR 2.0–6.0] in 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0] oziroma (p=0.311) (dopolnilni S3). Ponovljivost med opazovalci je bila ugotovljena med vizualnim in polavtomatskim odkrivanjem kalcinacij, z ICC 0.94 (95-odstotni IZ 0.85–0.98) za obarvanje z rdečim alizarinom in 0.77 (95-odstotni IZ 0.42–0.91) za barvanje po Von Kossi.

Prekrivne slike avtoradiografskih in histoloških rezultatov so pokazale so-lokalizacijo privzema [18F]-NaF z rdečim obarvanjem alizarina za mikrokalcifikacijo (slika 1B). Za primerjavo so prekrivne slike privzema [18F]-NaF in obarvanje kalcifikatov po Von Kossi pokazale privzem na območjih brez histološko dokazanih kalcinacij (slika 1C). Lažno negativni privzem [18F]-NaF kot odstotek histološko dokazanih (mikro)kalcifikacijskih območij zunaj prekrivnega sloja je znašal mediano 0 odstotkov [IQR 0–25 odstotkov] za alizarin rdeča območja in mediana 100 odstotkov [65–100 odstotkov ] za območja Von Kossa. Barvanje mikrokalcinacij z alizarin rdečim je pokazalo dobro korelacijo z privzemom [18F]-NaF (Spearmanov rho 0,81 (95-odstotni IZ 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5-odstotni privzem [18F]-NaF (slika 4).

Slika 2. Prekrivna slika privzema [18F]-natrijevega fluorida ([18F]-NaF) in (alizarin rdeče) mikrokalcifikacije (A), z alizarinsko rdečim obarvanjem za mikrokalcifikacije (B) in von Kossa barvanjem za kalcifikacije (C).

Značilnosti prejemnika v času transplantektomije.

Medledvicaalografski vzorci bolnikov z (n{{0}}) ali brez hiperfosfatemije (n=6), za število območij [18F]-NaF (mediana 5.0 [IQR) 2.0–11,8] proti 7.0 [7.0–23.0], p=0.170) , alizarinsko rdeče (mediana 7,5 [IQR 5.0–14.0] v primerjavi z 12.0 [3.0–34.0], p{{30}}.390) in Von Kossa (mediana 5.0 [IQR 3,5–6,3] v primerjavi s 3.0 [2.{ {59}}–5.0], str=0.247). Primerjava vzorcev alografa ledvic pri bolnikih z (n=8) ali brez (n=5) hiperparatiroidizma ni pokazala razlik glede števila območij [18F]-NaF (mediana 7.0 [IQR 4.0–7,5] v primerjavi s 7,5 [4.0–23.0], p=0.459), alizarin rdeče (mediana 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] proti 1{{103}}.0 [3,5–32,8], p{{76 }}.769) in Von Kossa (mediana 4.0 [IQR 1,5–5.0] v primerjavi s 4,5 [2.0–6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). Med vzorci alografa ledvic pri bolnikih z (n=5) ali brez (n=8) sladkorne bolezni niso ugotovili pomembnih razlik za število območij [18F]-NaF (mediana 5,5 [IQR 2,5– 19,3] v primerjavi s 7,0 [6,5–15,5], p=0,524), alizarin rdeče (mediana 10,0 [IQR 5,5–24,8] v primerjavi z 9,0 [4,0–8,5], p=0,833) in Von Kossa (mediana 3,0 [IQR 2,0–5,8] v primerjavi s 4,0 [3,5–8,5], p=0.284). V času med presaditvijo in transplantektomijo (meseci) niso opazili pomembnih korelacije s številom območij [18F]-NaF (p=0.586), alizarin rdečim (p=0.667) in Von Kossa (str=0.459). Za starost v času presaditve niso opazili pomembnih korelacij s številom območij [18F]-NaF (p=0.902), alizarin rdečim (p=0.798) in Von Kossa (p =0.334). Podobno niso opazili nobenih pomembnih korelacij med trajanjem dializacije (v mesecih) poledvicaokvara alografa in število območij [18F]-NaF (p=0.481), alizarin rdeče (p=0.565) in Von Kossa (p=0.174).

Slika 3. Korelacija števila območij [18F]-natrijevega fluorida ([18F]-NaF) z mikrokalcifikacijami, obarvanimi z alizarinom rdeče (A) in kalcifikacijami, obarvanimi po von Kossi (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5-odstotna površina sledilnika [18F]-natrijevega fluorida ([18F]-NaF) za število mikrokalcinacij, obarvanih z alizarinom rdeče (A) in von Kossa, obarvanih kalcinacij (B) (mediana, interkvartilni razpon).

Diskusija

V tej študiji dokaza koncepta absorpcija [18F]-NaF pri človeku ex-vivoledvicavzorci parenhima so pokazali dobro korelacijo s histološko dokazanimi mikrokalcifikacijami. Vnos [18F]-NaF je bil močneje koreliran z obarvanjem z alizarin rdečim za aktivne mikrokalcifikacije v primerjavi z barvanjem po Von Kossi konsolidiranih kalcinacij, kar kaže na vlogo slikanja [18F]-NaF pri prepoznavanju področij nefrokalcinoze v zgodnji fazi.

Predstavljeni vzorci predstavljajo kombinacijo ledvic darovalcev in eksplantiranih alograftov ledvic. Ti dve vrsti vzorcev sta se razlikovali glede na vezavo sledilca, pri čemer so opazili večji privzem [18F]-NaF v vzorcih eksplantiranega ledvičnega alogenskega presadka. To je v skladu s prejšnjimi publikacijami, ki poročajo o povečanju mikrokalcinacij po presaditvi ledvice 5–7. Združenje zanefrokalcinozas slabšim delovanjem presadka v času biopsije in eno leto po presaditvi so poročali v dveh študijah biopsije ledvičnega alogenskega presadka, s 258 in 149ledvicaprejemniki presadka8,9. Poleg tega je v longitudinalni kohorti s 97 prejemniki presajenih ledvic bistveno slabše 1--letno in 12--letno preživetje presadka pri bolnikih z usedlinami kalcijevega oksalata (tj. preživetje presadka 98,6 odstotka proti 72,5 odstotka in 79,3 odstotka proti 49,7 odstotka). V multivariatni logistični regresijski analizi je bila prisotnost usedlin kalcijevega oksalata neodvisno povezana z izgubo presadka, v modelu, ki je med drugim vključeval kreatinin v času biopsije in tip darovalca4. Posebna vloga mikrokalcinacij v tej kaskadiledvicaupad funkcije alografta ostaja nejasen. V kliničnem okolju pred presaditvijo se usedline CaOx pripisujejo visokim ravnem serumskega oksalata, molekule, ki se med dializo ne odstrani učinkovito4. Medtem ko so usedline CaPhos najpogosteje opažene pri bolnikih s hiperparatiroidizmom in visokimi ravnmi kalcija v serumu zaradi motene presnove mineralov pred in po presaditvi5. Nismo našli razlik v rezultatih histologije in avtoradiografije za hiperfosfatemijo, hiperparatiroidizem, diabetes mellitus, čas med presaditvijo in transplantektomijo ter trajanje dialize po odpovedi ledvičnega alogenskega presadka.

Za razvoj novih strategij zdravljenja aktivnih mikrokalcinacij vnefrokalcinoza, je treba njegov klinični pomen v zvezi s (kronično) neuspehom presaditve razumeti bolj celovito. Z identifikacijo ciljne populacije z visokim tveganjemledvicaprejemnike presadkov, je mogoče oblikovati klinične študije za raziskovanje strategij zdravljenja21. Možen poudarek bi lahko našli v povečani regulaciji endogenih zaviralcev kalcifikacije, s posebnim poudarkom na osteopontinu3.

Glede na visoko incidenconefrokalcinozain njegove povezave s funkcijo ledvičnega alogenskega presadka, je boljše razumevanje etiologije mikrokalcinacij upravičeno. Neinvaziven in zanesljiv diagnostični pristop za identifikacijo in kvantificiranje mikrokalcinacij pri zgodnji nefrokalcinozi bi lahko omogočil študije o vplivu nefrokalcinoze na delovanje ledvičnega presadka. Slikanje [18F]-NaF je zanimivo, saj je privzem [18F]-NaF v vzorcih žil ljudi in živali povečan na biološko aktivnih območjih kalcifikacije, preden je ta področja mogoče prikazati z mikroračunalniško tomografijo 16,17,22. V nedavnih kliničnih študijah PET/CT je bilo dokazano, da je privzem [18F]-NaF povezan z napredovanjem vaskularne kalcifikacije, kar zagotavlja klinične dokaze za uporabo [18F]-NaF za odkrivanje območij z biološko aktivno kalcifikacijo 18–20. Opazovanja v tej študiji so v skladu s temi prejšnjimi ugotovitvami na področju vaskularnega slikanja. Dokazana je bila dobra korelacija med privzemom [18F]-NaF in histološko dokazanimi mikrokalcifikacijami, medtem ko je bila korelacija s konsolidiranimi kalcifikacijami očitno šibkejša.

Kot rečeno, je bila ugotovljena so-lokalizacija med privzemom [18F]-NaF in pozitivnimi mikrokalcifikacijami Alizarin rdeče, medtem ko območja privzema [18F]-NaF niso bila so-lokalizirana z obarvanjem konsolidiranih kalcifikacijah po Von Kossi. Ta kalcificirana območja s konsolidiranimi kalcifikacijami in brez ustreznega privzema [18F]-NaF se lahko štejejo za območja neaktivne kalcifikacije, kjer ni potekajočega procesa mineralizacije, kot so prej opisali Irkle et al. v ex-vivo študiji kalcifikacije karotidne arterije16. Čeprav potrjeno samo za vaskularne kalcifikacije in ne zaledvicakalcifikacijah parenhima, je podprta z vezavnimi lastnostmi [18F]-NaF na zunanjo površino kalcifikacijah in omejenim prodorom v trdne kalcifikacije. Zato bo privzem [18F]-NaF večji pri mikrokalcifikacijah z veliko površino v primerjavi z mikrokalcifikacijami z veliko prostornino, a relativno majhno površino13,16.

Ta študija dokaza koncepta ima tudi nekatere omejitve. Prvič, neločljivo povezani z zasnovo študije, rezultati predstavljajo eno samo časovno točko, brez kliničnega spremljanja napredovanja kalcifikacije. Drugič, ta dokazna študija koncepta je sestavljena iz razmeroma majhnega števila vzorcev ledvic, saj se transplantektomija po pozni neuspešni transplantaciji izvaja le ob kliničnih indikacijah in razpoložljivosti zavrnjenega darovalcaledviceza raziskovalno uporabo je omejena23. Zato je treba celovito analizo etiologije odlaganja kalcija obravnavati zunaj obsega tega projekta. Tretjič, klinično prevajanje rezultatov ovira pomanjkanje znanja o in vivo porazdelitvi [18F]-NaF v ledvicah in učinku očistka ledvičnega sledilca, tj. nizka aktivnost tarče proti ozadju bi lahko omejila vizualizacijo kalcinacij. Da bi rešili to težavo, je treba oceniti optimalen trenutek [18F]-NaF PET slikanja, tj. v katerem se [18F]-NaF resnično izloči in preostala aktivnost izhaja iz vezave na kalcificirana področja. Morda je to mogoče doseči z odloženim slikanjem, ki presega tri ure, kot se izvaja za oceno koronarnih kalcifikacij24. Zmanjšana stopnja glomerulne filtracije, ki jo najdemo pri prejemnikih presadkov, bi lahko povzročila podaljšano fazo izločanja, ki zahteva daljše obdobje med injiciranjem sledilca in PET slikanjem, vendar trenutne smernice ne kažejo na potencialno nefrotoksičnost sledilnika [18F]-NaF11,25. Potencialni korak med tukaj predstavljeno študijo dokaza koncepta in in-vivo slikanjem je lahko ex-vivo [18F]-NaF PET slikanje normotermičnih perfundiranih ledvic ali in-vivo [18F]-NaF mikroPET študije na živalih 26,27. Četrtič, klinično uporabo te tehnike bi lahko ovirali stroški za izvedbo postopka [18F]-NaF PET/CT in inherentna izpostavljenost sevanju. Vendar pa lahko novi sistemi digitalnih PET kamer z višjo občutljivostjo zmanjšajo oboje zaradi krajšega časa skeniranja in nižje vbrizgane doze aktivnosti.

Moč te študije dokaza koncepta je v podrobni primerjavi ena proti ena mikrokalcinacij, identificiranih z [18F]-NaF avtoradiografijo in histologijo. Absorpcijo [18F]-NaF v različnih vzorcih je bilo mogoče primerjati brez potrebe po nadaljnjih prilagoditvah, saj so bili vsi vzorci inkubirani v isti raztopini [18F]-NaF. Poleg tega ta študija zagotavlja prve podatke, ki kažejo vizualno in statistično ujemanje med privzemom [18F]-NaF in histološko dokazanimi mikrokalcifikacijami v vzorcih ledvic.

Cistanche-delovanje ledvic

Za zaključek podajamo prve podatke za uporabo [18F]-NaF v avtoradiografski študiji za identifikacijo mikrokalcinacij v aktivnihnefrokalcinozapoledvicapresaditev. Ta študija dokaza koncepta [18F]-NaF ex-vivo je prvi korak k potencialni uporabi klinične [18F]-NaF PET/CT pri prejemnikih presajene ledvice.

Metode

Človekledvicavzorcev.

Ledvično tkivo je bilo pridobljeno po transplantektomiji (n=13) in iz zavrženih ledvic umrlih darovalcev (n=7) v primeru zavrnitve ledvice darovalca v povezanih transplantacijskih centrih. Klinični podatki o prejemnikih in darovalcih ledvičnih presadkov so bili pridobljeni iz zdravstvenih kartotek pacientov, vključno s prisotnostjo hiperparatiroidizma, hiperfosfatemije in diabetesa mellitusa pred transplantektomijo, ter oceno klinične patologije vzorcev ledvičnih alograftov, o katerih so poročali z uporabo Banfove klasifikacije patologije ledvičnih alograftov28. Raziskovalne dejavnosti so bile izvedene v skladu z deklaracijo Helsinških etičnih načel za medicinske raziskave, ki vključujejo ljudi, in institucionalni revizijski odbor je odobril to študijo (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Pridobljena je bila informirana privolitev vseh prejemnikov presadka in dana je bila odobritev pred darovanjem za uporabo zavrženih ledvic umrlih darovalcev v raziskovalne namene. Klinične in raziskovalne dejavnosti so bile skladne z načeli Istanbulske deklaracije, kot je opisano v Istanbulski deklaraciji o trgovini z organi in transplantacijskem turizmu.

Standardni operativni postopek (SOP) za vzorčenje tkiva je bil naslednji: vzorci so bili pridobljeni v kirurški dvorani, takoj po ekstrakciji ledvice (za transplantektomijo) ali ob prihodu zavrženega darovalca.ledvicav našem transplantacijskem centru. Vzorci, uporabljeni za ta poskus, so bili vzeti v prečni ravnini zgornjega pola, vključno s kortikalnim in medularnim ledvičnim tkivom, z velikostjo med 25 mm × 15 mm in 20 mm × 40 mm. Ti vzorci so bili fiksirani s formalinom in vgrajeni v parafin. Z mikrotomskim natančnim rezalnim instrumentom so bili izdelani trije µm v parafin vdelani odseki. Ti odseki so bili nameščeni na adhezijskem steklu mikroskopa (TOMO, Matsunami Glass, ZDA). Serijski odseki, tj. sosednji odseki, ki razkrivajo zaporedne plastiledvicavzorci tkiva so bili uporabljeni za avtoradiografijo in histološko analizo. Pred inkubacijo s sledilnikom in histološkim barvanjem so bili rezi deparafnizirani, rehidrirani v demineralizirani vodi in začasno shranjeni v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS).

[18F]-NaF inkubacija in avtoradiografija.

Ex-vivo poskus je temeljil na protokolu, ki so ga v prejšnjih študijah uporabili Hop et al. in Reijrink et al.22,29. Prva študija je avtoradiografska študija o privzemu [18F]-NaF v karotidnih plakih pri pacientih z možgansko kapjo, ki so bili operirani, s CT indikacijo kalcifikacije kot primerjavo. Druga študija je avtoradiografska študija privzema [18F]-FDG v vzorcih maščobnega tkiva z imunohistokemijo serijskih rezov kot primerjavo. Enega od vsakih treh serijskih odsekov smo 30 minut kopali v raztopini [18F]-NaF pri koncentraciji 618 milibekerelov (MBq) v 300 ml PBS pri sobni temperaturi. Pranje smo izvedli s trikratnim izpiranjem s hladnim PBS in dvakrat s hladno vodo. Vzorci so bili posušeni na prostem in nanje postavljeni slepi fosforni zaslon. Izpostavljenost smo izvajali čez noč, 24 ur in 30 minut. Ugotavljanje porazdelitve in intenzivnosti tkivne aktivnosti je bilo izvedeno na fosfornem zaslonu z uporabo Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, ZDA).

Alizarin rdeče in barvanje po von Kossa.

Za vizualizacijo kopičenja kalcija v zgodnji fazi kalcifikacije smo izvedli obarvanje z alizarinsko rdečo. Vzorci so bili 5 minut inkubirani v 2-odstotni m/v raztopini alizarin rdečega (raztopljenega v demineralizirani vodi), pH 4,230. Pranje smo izvedli z 20-kratnim izpiranjem v 1:1 aceton/ksilen in 20-kratnim izpiranjem v 100-odstotnem ksilenu. Von Kossa barvanje je bilo izvedeno za vizualizacijo prisotnosti anorganskih fosfatnih molekul v konsolidiranih kalcifikacijah. Na kratko, vzorce smo inkubirali v 1-odstotni raztopini srebrovega nitrata (AgNO3) 1 uro, medtem ko smo bili izpostavljeni sončni svetlobi30. Izmenično s trikratnim izpiranjem v demineralizirani vodi je bila izvedena inkubacija z natrijevim tiosulfatom 5 minut, čemur je sledila inkubacija v jedrsko hitrem rdečem 3 minute.

Obdelava in analiza slik.

Obarvane reze tkiv smo digitalizirali s Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japonska), slike pa smo pregledali s programsko opremo Aperio ImageScope različice 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Nemčija). Avtoradiografija in kvantitativne računalniške analize slik so bile izvedene s programsko opremo ImageJ, različica 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Odštevanje ozadja je bilo uporabljeno za vse histološke slike, pri čemer je bil vstavljen obris na meji histološkega vzorca. Polavtomatsko odkrivanje kalcinacij v alizarin rdečem in barvanju po Von Kossa je bilo izvedeno z ImageJ-BioVoxxel Toolbox31. Pragovi so bili uporabljeni za vse vzorce in zaznana področja kalcifikacije so bila razširjena s 6 iteracijami za optimizacijo vizualizacije. Za avtoradiografske slike sta bila izvedena rotacija in spreminjanje velikosti na podlagi originalnih histoloških vzorcev. Pragovi so bili uporabljeni za vse vzorce, kar je povzročilo območja privzema sledilnika, po pristopu, ki so ga opisali Irkle et al.: slike so bile pragovno razvrščene z metodo Otsu, čemur je sledila Gaussova zameglitev in prag z metodo Li16. Prekrivne slike so bile pridobljene z ujemanjem obrisov iz sosednjih histoloških slik, s kasnejšim ujemanjem rezultatov histologije in avtoradiografije (slika 1). Kvantifikacija kalcifikacije in sledilne površine (kot odstotek površine vzorca) na osnovi slikovnih pik je bila izvedena z orodjem ImageJ—Analyze Particles.

Cistanche - simptomi bolezni ledvic

Statistične analize.

Statistika je bila izvedena s statističnim paketom za družbene vede različice 23 (IBM Corporation, Armonk NY, ZDA), grafi so bili izdelani z GraphPad Prism 7.02 za Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, ZDA) in številke so bile izdelane z Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, ZDA). Rezultati so bili predstavljeni kot mediana in interkvartilni razpon (IQR) za poševne podatke ter kot frekvenca in odstotek, kadar so bili podatki kategorični. Skupine smo primerjali s testi Mann–Whitney U (dvostranska vrednost p<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Razpoložljivost podatkov

Ledvica umrlega darovalca inledvicaAvtoradiografske slike privzema [18F]-natrijevega fluorida ([18F]-NaF) prejemnika presadka s prekrivnimi slikami privzema [18F]-NaF z obarvanjem mikrokalcifikatov z rdečim Alizarinom in obarvanjem kalcifikatov po Von Kossi so na voljo na spletu kot dodatne informacije. Vsi dodatni podatki bodo na voljo na zahtevo v skladu s predpisi IRB Univerzitetnega kliničnega centra Groningen.

Reference

1. Gwinner, W. et al. Zgodnja kalcifikacija ledvičnih alograftov, odkrita s protokolarnimi biopsijami: vzroki in klinične posledice. Am. J. Presaditev. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. in Unwin, RJ Kaj jenefrokalcinoza?. Kidney Int. 88, 35–43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontin ščiti pred visoko vsebnostjo fosfatovnefrokalcinozain vaskularno kalcifikacijo. Kidney Int. 89, 1027–1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Zgodnja prisotnost odlaganja kalcijevega oksalata vledvicabiopsija presadka je povezana s slabim dolgoročnim preživetjem presadka. Am. J. Presaditev. 5, 323–329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. Lokalizacija, etiologija in vpliv depozitov kalcijevega fosfata v ledvičnih alograftih. Am. J. Presaditev. 9, 2470–2478 (2009).

6. Nankivell, BJ et al. Naravna zgodovina kronične alogenske nefropatije. N. angl. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. Dejavniki tveganja za kronično nefropatijo alogenskega presadka po presaditvi ledvice: študija protokolarne biopsije. Kidney Int.67, 341–348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Oksalatne usedline v biopsijah iz domačih in presajenih ledvic in vpliv na delovanje presadka. Nefrol. Dial. Presaditev. 24, 1319–1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Odlaganje oksalata v biopsijah ledvičnega alogenskega presadka v 3 mesecih po presaditvi je povezano z disfunkcijo alotransplantata. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Ali smo pozabili na slikanje pred in po presaditvi ledvice?. EUR. Radiol. 28, 3263–3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: Smernice za postopek EANM za slikanje kosti. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR et al. Koronarni arterijski privzem 18F-natrijevega fluorida. J. Am. Coll. kardiol. 59, 1539–1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. Absorpcija 18F-natrijevega fluorida je označevalec aktivne kalcifikacije in napredovanja bolezni pri bolnikih z aortno stenozo. Circ. Cardiovasc. Imaging 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. et al. Izvedljivost 18F-natrijevega fluorida PET/CT za slikanje aterosklerotičnega plaka. J. Nucl. Med. 51, 862–{865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Ciljna identifikacija za diagnozo in intervencijo ranljivih aterosklerotičnih plakov onkraj 18F-fluorodeoksiglukozne pozitronske emisijske tomografije: obetavni sledilci na obzorju. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Identifikacija aktivne vaskularne mikrokalcifikacije s pozitronsko emisijsko tomografijo z 18F-natrijevim fluoridom. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD et al. 18 Ojačitev signala F-fluorida identificira mikrokalcifikacije, povezane z nestabilnostjo aterosklerotičnih plakov na slikah pozitronske emisijske tomografije/računalniške tomografije. Circ. Cardiovasc. Slikanje 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM et al. Vaskularni privzem pri pozitronski emisijski tomografiji z 18F-natrijevim fluoridom: predhodnik vaskularne kalcifikacije? J. Nucl. kardiol. (2020).

19. Derlin, T. et al. Korelacija vnetja, ocenjena z 18F-FDG PET, aktivnim odlaganjem mineralov, ocenjenim z 18F-fluorid PET, in vaskularno kalcifikacijo v aterosklerotičnem plaku: študija PET/CT z dvojnim sledilcem. J. Nucl. Med. 52, 1020–1027 (2011).

20. Kitagawa, T. et al. Napovedna vrednost pozitronske emisijske tomografije 18F-natrijevega fluorida pri odkrivanju bolezni koronarnih arterij z visokim tveganjem v kombinaciji z računalniško tomografijo. J. Am. Srce izr. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. et al. Endogeni zaviralci kalcifikacije pri preprečevanju vaskularne kalcifikacije: konsenzna izjava COST akcije EuroSofCalcNet. Spredaj. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. Pozitronska emisijska tomografija s 18F-natrijevim fluoridom je ocenila mikrokalcifikacije v krivdnih in nekrivdnih človeških karotidnih plakih. J. Nucl. kardiol. 26, 1064–1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nefrektomija po neuspešnem presaditvi: trenutna praksa in rezultati. Am. J. Presaditev. 7, 1961–1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. Triurno odloženo slikanje izboljša oceno koronarne PET z natrijevim fluoridom 18F. J. Nucl. Med. 60, 530–535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Dokument o stališču Odbora za srce in ožilje Evropskega združenja za nuklearno medicino (EANM) o PET slikanju ateroskleroze. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. Ledvice prašičev DCD analizirane z MRI za oceno ex vivo njihove sposobnosti preživetja. Transplantacija 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. et al. Infuzija mezenhimskih stromalnih celic v prašičeledvicemed normotermično strojno perfuzijo: intaktne MSC je mogoče izslediti in lokalizirati na glomerulih. Int. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. Referenčni vodnik za Banfovo klasifikacijo patologije ledvičnega alogenskega presadka iz leta 2018. Transplantacija 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. [18F] Vnos FDG v maščobno tkivo ni povezan z vnetjem pri sladkorni bolezni tipa 2. Mol. Imaging Biol. 23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. et al. Vaskularna kalcifikacija in aortna fbroza bifunkcionalna vloga osteopontina pri diabetični arteriosklerozi. Arter. TrombVascBiol 31, 1821–1833 (2011).

31. Brocher, J. Kvalitativno in kvantitativno vrednotenje dveh novih algoritmov binarizacije, ki omejujeta histogram. Int. J. Proces slike. 8, 30–48 (2014).

Zahvala

Ta raziskovalni projekt je podprt z donacijo fundacije De Cock-Hadders (koda projekta 2018-03).

Avtorski prispevki

SB je prispeval k oblikovanju, pridobitvi in ​​analizi ter pripravil osnutek rokopisa. IFA, MR in MLCB so prispevali k oblikovanju, pridobitvi in ​​analizi ter vsebinsko revidirali rokopis. SPB, CM in MHdB so prispevali k zasnovi in ​​vsebinsko predelali rokopis. JLH, RHJAS in RAP so prispevali k zasnovi, oblikovanju in analizi ter vsebinsko revidirali rokopis.

Konkurenčni interesi

Avtorji izjavljajo, da ni konkurenčnih interesov.