Lokalni nehipofizni rastni hormon se sproži s staranjem in olajša poškodbo epitelija

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

POVZETEK

Dejavniki mikrookolja, ki modulirajo s starostjo povezano poškodbo DINA, niso jasni. Nehipofizni rastni hormon (np) se inducira v človeškem debelem črevesu, netransformiranih celicah človeškega debelega črevesa in fibroblastih ter v 3-dimenzionalnih črevesnih organoidih s s starostjo povezano poškodbo DNK. Avtokrini/parakrini npGH zavira p53 in oslabi odziv na poškodbo DNK (DDR) z indukcijo TRIM29 in zmanjšanjem fosforilacije ATM, kar vodi do zmanjšanega popravljanja DNK in kopičenja poškodb DNK. Organoidi, gojeni do 4 mesece, kažejo označevalce staranja, p16 in SA- -galaktozidazo ter zmanjšano dolžino telomer, kot tudi kopičenje poškodb DNK, s povečanim npGH, potlačenim p53 in oslabljenim DDR. Zatiranje GH v starih organoidih poveča p53 in zmanjša poškodbe DNA. Miši WT kažejo od starosti odvisno kopičenje poškodbe DNA debelega črevesa, medtem ko pri starih miših brez signalizacije GH debelega črevesa ostane poškodba DNA majhna, s povišanim p53. Ker indukcija npGH, povezana s starostjo, omogoča proliferativno mikrookolje, bi lahko razveljavitev signalizacije npGH ciljno uporabili kot terapijo proti staranju z oviranjem poškodb DNK in s starostjo povezanih patologij.

UVOD

Biološke funkcije se s staranjem zmanjšujejo, hkrati pa se povečujejo s starostjo povezane bolezni.flavonoidiS starostjo povezane patologije poganjajo nakopičene poškodbe DNK in pomanjkljivosti pri popravljanju DNK, ki povzročajo mutacije in s starostjo povezane kromosomske aberacije. Vztrajna poškodba DNK lahko tudi blokira celično proliferacijo, kar ima za posledico staranje in apoptozo, s čimer še naprej spodbuja proces staranja (Ou in Schumacher, 2018). Poškodba DNK se s starostjo kopiči v divjih (WT), netransformiranih človeških in mišjih celicah, kar dokazuje povečana fosforilirana različica histona 2A (yH2AX), označevalec prekinitev dvoverižne DNK (DSB) (Sedelnikova et al., 2004) in nepopravljene poškodbe DNK (Dolle et al., 1997; Hasty et al., 2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020). Genomska nestabilnost, ki je posledica okvarjenega popravljanja poškodb DNK, lahko daje prednost celični transformaciji (Negrini et al., 2010). Poškodba DNK sproži fosforilacijo genov, mutiranih z ataksijo-telangiektazijo (ATM), odgovornih za popravilo prekinitev enoverižne DNK in DSB. ATM fosforilira in stabilizira tumorski supresor p53, s čimer zagotavlja popravilo poškodbe DNK z olajšanjem več poti popravljanja DNK. Tako ima ATM ključno vlogo pri aktiviranju odziva na poškodbe DNK (DDR) in popravljanja DNK (Ou in Schumacher, 2018).

Za več informacij kliknite tukaj

Izražanje in aktivnost ATM se s starostjo poslabšata (Feng in sod., 2007; Gutierrez-Martinez in sod., 2018), kar verjetno povzroči s starostjo povezano funkcionalno izgubo p53 in vodi do akumulirane poškodbe DNK in kromosomske nestabilnosti (Simon in sod., 2009). Odzivi .p53 na stresorje, kot je sevanje, so nižji pri starejših miših (Feng et al., 2007) in v človeških dermalnih fibroblastih, pridobljenih iz starejših posameznikov (Goukassian et al., 2000). Tako značilni znaki staranja vključujejo zmanjšano aktivnost DDR in supresijo p53 z nakopičeno nepopravljeno poškodbo DNK, kar vse omogoča ugodno okolje za proliferacijo epitelija (Lopez-Otin et al., 2013).

Ker izločanje hipofiznega rastnega hormona (GH) s starostjo upada, je spremenjeno signaliziranje GH vpleteno v proces staranja (Ho in Hoffman, 1993). Kljub temu številni dokazi podpirajo koristne učinke oslabitve GH na staranje. in modeli bolezni pri ljudeh (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013), koristi pomanjkanja GH izhajajo predvsem iz opazovanj, ki dajejo prednost sekundarnim dejavnikom, ki podaljšujejo življenjsko dobo, vključno z večjo občutljivostjo za inzulin, zmanjšano oksidacijo beljakovin v jetrih. , zmanjšana incidenca raka in zmanjšano vnetje, povezano s starostjo (Aguiar-Oliveira in Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). Potomci družin Leiden preučujejo družinsko dolgoživost in nižjo umrljivost. kot okoljsko usklajene kontrole imajo nižje integrirane ravni GH v obtoku (van der Spoeletal., 2016), medtem ko presežek GH skrajša življenjsko dobo, kot je razvidno pri bolnikih z akromegalijo (Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters in Barclay, 200). 7) in v transgenih mišjih modelih s prekomerno ekspresijo GH (Bartke, 2003).uporaba hesperidinaNekateri so predlagali negativno korelacijo med višino in dolgo življenjsko dobo pri ljudeh (He et al., 2014; Samaras in Storms, 1992) in pri psih (Greer et al., 2007). Domnevali smo, da lahko škodljivi učinki GH na staranje vsaj deloma pripisati akumulirani poškodbi DNK (Ches-nokova in Melmed, 2020). V podporo tej predpostavki limfociti, pridobljeni iz bolnikov z akromegalijo, kažejo poškodbe DNK s povečanimi kromosomskimi aberacijami (Bayram et al., 2014), medtem ko se nepopravljene poškodbe DNK kopičijo v jetrih modela akromegalije rib cebrice (Elbialy et al., 2018). Visoke ravni GH v obtoku oslabijo popravilo DNK mišjega črevesa, kar sproži kopičenje poškodb DNK, medtem ko je poškodba DNK oslabljena po blokiranju receptorja GH (GHR) v celicah človeškega debelega črevesa in pri miših z preklicanim signaliziranjem GHR (Chesnokova et al., 2019a).

Nehipofizni GH (np), ki se sintetizira lokalno v perifernih tkivih, je identičen endokrinemu GH1, ki ga proizvaja hipofiza, in deluje preko avtokrinih/parakrinih mehanizmov prek široko izraženega GHR (Ballesteros et al., 2000), ki prepozna hipofizni GH in npGH ligande ( Waters in Barclay, 2007; Waters in drugi, 2006).izgubljeno cesarstvo cistancheKer aktivacija DDR inducira npGH (Chesnokova et al., 2013), smo domnevali, da nakopičena poškodba DNK debelega črevesa, povezana s starostjo, povzroči ekspresijo npGH, kar bi posledično dodatno omejilo popravilo poškodb DNK.

Cistanche lahko upočasni staranje

Z uporabo in vitro in ex vivo človeških modelov, ki odražajo staranje, tukaj prikazujemo, da se npGH inducira in da se poškodbe DNK kopičijo v starih človeških tkivih, kar dokazuje povečana fosforilacija H2AX (yH2AX). Poleg tega je poškodba DNK debelega črevesa znatno povečana pri starih miših WT, medtem ko poškodba epitelijske DNK ostaja majhna pri miših GHR--, ki se ujemajo s starostjo in so brez signalizacije GH, in pri GHR specifičnih izločenih miših za debelo črevo (GHRcolKO).

Lokalni npGH je bil induciran tudi v starih 3-dimenzionalnih (3D) intestinalnih organoidih, ustvarjenih iz induciranih človeških pluripotentnih izvornih celic (iPSC) (Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). Organoid npGH pa je zaviral p53 in oslabil popravilo poškodb DNA.mikronizirana prečiščena flavonoidna frakcija 1000 mg uporabljaUčinki npGH so bili verjetno parakrini, saj je sočasno gojenje fibroblastov, ki izražajo GH, z mikrofluidnimi napravami Colon Intestine-Chip, vgrajenimi s človeškimi kolonoidi, povzročilo zatiranje p53/p21 in povečano poškodbo DNA. Nasprotno pa je zatiranje GH v starih organoidih preprečilo poškodbe DNK.

Tako smo pokazali, da je epitelijski npGH močno induciran med staranjem in da npGH zmanjša popravilo DNK in olajša kopičenje poškodbe DNK, povezane s starostjo. Na splošno rezultati kažejo, da lokalni npGH epitelija debelega črevesa sproži spremembo polja sluznice, kar ustvarja okolje kromosomske nestabilnosti, ki je ugodno za neoplastični razvoj v starajočem se tkivu.

Pomembno je, da čeprav obstaja razširjena neustrezna uporaba GH kot "proti staranju" hormona kljub pomanjkanju prepričljivega vpliva na proces staranja (Blackman et al., 2002; Clemmons et al.. 2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), naši rezultati kažejo, da lokalno signaliziranje rastnega hormona prispeva k tkivnemu mikrookolju, kar daje prednost razvoju s starostjo povezanih patologij. Zatiranje lokalnega signaliziranja npGH za omejitev neugodne poškodbe epitelijske DNA lahko zato ponudi terapevtski cilj anovulantnega staranja. Rezultati teh študij so osnova za inovativen pristop k podaljšanju življenjske dobe (tj. zatiranje in ne indukcija lokalnega signaliziranja GH). REZULTATI

Poškodba DNK debelega črevesa in npGH se kopičita s staranjem

Poškodba DNK, povezana s starostjo, je bila ocenjena v netumorskih vzorcih parafinskega tkiva človeškega debelega črevesa, pridobljenih iz kohort bolnikov, ki so zajemale 3 starostne skupine: mladi (18-39 let), srednjih let (40-60 let) in stari ( 61-88 let). Ko so ocenili za yH2AX, so 3 od 11 vzorcev (27 odstotkov) v mladi kohorti pokazali poškodbo DNK, 8 od 16 (50 odstotkov) je imelo poškodbo DNK v srednjih letih in 8 od 18 (45 odstotkov) starih vzorcev je imelo poškodbo DNK (slike 1A-1C in 1J).

Kot smo že pokazali, da poškodba DNK povzroči npGH (Chesnokova et al, 2013), smo poskušali ugotoviti, ali je starostno odvisno kopičenje poškodbe DNK povezano z izražanjem GH v netumorskem tkivu debelega črevesa. Ker se ne izraža v nevroendokrinih celicah kolona (Chesnokova et al, 2016), smo te celice izključili iz analize.

Ekspresija epitelijskega GH je bila odkrita v 16 odstotkih -17 odstotkov normalnih vzorcev debelega črevesa, pridobljenih iz kohort srednjih let in starejših (38 oziroma 42 vzorcev), vendar le v 2 odstotkih mladih kohort (37 vzorcev), medtem ko je Ocena izražanja GH se je povečala v kohorti srednjih let in dodatno povečala v vzorcih stare kohorte (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoidČe povzamemo, ti rezultati kažejo na kopičenje poškodb DNK brez indukcije v starajočem se debelem črevesu.

Aktivacija DDR inducira lokalno npGH v mišjem in človeškem debelem črevesu

Nato smo preučili, ali aktivirani DDR sproži lokalno ekspresijo npGH debelega črevesa, in miši, zdravljene z nutlinom3, stabilizirali p53 (Vassilev et al, 2004) in opazili induciran p53 debelega črevesa in več (slika 2A). Poleg tega v vzorcih adenokarcinoma debelega črevesa, pridobljenih od istih bolnikov pred in po terapijah, ki poškodujejo DNK (tabela S1), smo opazili skromno izhodiščno epitelno izražanje npGH pred zdravljenjem in povečano izražanje npGH po terapiji pri vseh 6 proučevanih vzorcih bolnikov (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR aktivira izražanje GH in vitro

Uporabili smo zaviralec topoizomeraze II etopozid za izdelavo prekinitev enoverižne DNA in DSB (Walles et al, 1996) in za določitev, ali DDR aktivira GH in vitro. npGH, ki ga povzroči poškodba DNA, v celicah adenokarcinoma debelega črevesa NCC, hNCF in HCT116 (sliki 3A in S1A-S1C); v organoidih, z etopozidom povzročena GH in mRNA GH (sliki 3B in S1D), medtem ko sta bili ravni mRNA IGF1 in prolaktina nespremenjeni (slika S1E). Fosforilacija STAT5, nizvodni signal GH (Waters, 2016), je bila inducirana v vseh tipih celic (sliki 3A-3C in S1A-S1C). Nasprotno pa je razveljavitev npGH z GH majhno motečo RNA (siRNA) preprečila etopozidu, da inducira pSTAT5 (sliki 3C in S1F), kar dokazuje, da je npGH debelega črevesa, ki ga povzroči poškodba DNA, funkcionalno aktiven. Slikanje NCC, zdravljenega z etopozidom 24 ur, je pokazalo sočasno izražanje GH in yH2AX v več celicah (slika 3D).

Epitelijske celice, ki so podvržene poškodbi DNK, izločajo GH. Da bi ugotovili, ali ima induciran intracelularni npGH avtokrine/parakrine učinke, smo ocenili ravni GH, izločene v NCC in organoidno gojišče po zdravljenju z etopozidom. Medij, zbran iz ANCC po 8 in 24 urah po zdravljenju in iz organoidov po 4-48 urah po zdravljenju, je pokazal časovno odvisno povečanje GH po aktivaciji DDR (slika 3E). Ker NCC in organoidi izražajo receptorje GH kot tkivo človeškega debelega črevesa (Chesnokova et al., 2016), ti rezultati kažejo, da lahko lokalni GH, induciran kot odziv na poškodbo DNA, izpostavi starajoče se tkivo avtokrinim/parakrinim delovanjem.

Avtokrini/parakrini GH zavira celice človeškega debelega črevesa p53

Ker endokrini GH zavira p53 mišjega debelega črevesa (Chesnokova et al, 2016), smo ugotovili, ali ima lokalni GH podobne au-avtokrine/parakrine učinke v človeških epitelnih celicah debelega črevesa. Analiza dveh ločenih linij NCC, pridobljenih iz dveh različnih bolnikov po nukleofekciji s hGH ali okužbi z GH, ki izraža lentivirus (lenti-GH) (slike 4A, 4B in S2), kot tudi organoidov, ki stabilno izražajo hGH (slika 4C), je pokazala potlačeno p53 in sočasno prekomerno izražanje. Celice, pridobljene iz organoidov, okuženih z lenti-GH ali praznim vektorjem (lenti-V), impulziranim z bromodeoksiuridinom (BrdU), so pokazale supresijo p53, ki ji je sledila skromna, a znatno povečana vključitev BrdU, kot je bilo ocenjeno s fluorescenčno aktiviranim razvrščanjem celic (FACS) (slika S3A). Nasprotno pa je supresija GH z lentivirusom, ki izraža majhen lasni GH (GH), povzročila zmanjšano tvorbo kolonij in velikost kolonij v NCC (sliki S3B in S3C), kar kaže na pro-pro-literaturno delovanje npGH.

Učinki parakrinega GH v človeškem črevesnem čipu debelega črevesa Da bi ocenili parakrine učinke npGH na epitelne celice črevesne sluznice, smo so-gojili UNCF, okužen z lenti-GH in mikrofluidnimi napravami črevesnega čipa debelega črevesa (Kasendra et al, 2020), posejane z zdravim debelim črevesjem epitelijskih celic, pridobljenih iz organoidov, 8 dni. Lokalno izločanje GH iz hNCF v medij je bilo potrjeno z ELISA (338 ng/mL/1×10 stopinjskih celic).5-Etinil-2'-deoksiuridin （EdU） （20 μM） je bil dodan 7. dan , so bili čipi fiksirani 24 ur kasneje in obarvani za EdU in H2AX, EdU plus jedra pa so bila prešteta v epitelijskih celicah. Posajen je ločen niz žetonov

z epitelnimi celicami smo uporabili za oceno p53/p21 z western blotom. Povečala se je proliferacija epitelijskih celic čipov (str<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Avtokrini/parakrini GH zavira DDR

Aktivacija ATM ob poškodbi DNK fosforilira H2AX, ki označuje poškodovana mesta DNK za aktiviranje DDR in pospeševanje popravljanja (Turinetto in Giachino, 2015). ATM tudi fosforilira p53, kar dodatno izboljša popravljanje DNK (Blackford in Jackson 2017). V hNCC kot tudi v organoidih, okuženih s pIRES2-ZsGreen1hGH ali z lentil-GH, je prekomerna ekspresija GH zavirala fosforilacijo ATM in DNA-protein kinaze (PK)cs, oba vključena v popravljanje DNK (Blackford in Jackson. 2017) in zmanjšano fosforilacijo ciljnega proteina p53 (sliki 5A-5C).

Tip60 histon acetilaza aktivira ATM (Jackson in Bartek, 2009) in jo negativno regulira TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al, 2005). Opazili smo, da je čezmerna ekspresija GH v NCC in organoidih povzročila tudi indukcijo TRIM29, ki je nato zatrla Tip60 (slike 5A-5C). Podobne rezultate so opazili v drugi liniji NCC 48 ur po nukleofekciji s plazmidom, ki izraža GH, in 6 dni po okužbi z lenti-GH (sliki S4A in S4B).

Avtokrini/parakrini GH oslabi popravilo DNK

Nato smo izmerili učinke na mehanizme popravljanja DSB, zlasti k napakam nagnjeno nehomologno spajanje koncev (NHEJ) (Jackson in Bartek, 2009) in homologno rekombinacijo (HR), odporno na napake (Beucher et al., 2009). ; Blackford in Jackson, 2017; Chapman et al., 2012). NCC, ki stabilno izražajo reporterske kasete NHEJ in HR, smo nukleofektirali s pcDNA3.1-človeškimi plazmidi GH1 (hGH1), inducirali DSB s sotransfekcijo s plazmidom, ki kodira endonukleazo I-Excel, in izmerili ponovno združevanje reporterjev popravljanja DSB. Učinkovitost transfekcije je bila nadzorovana s sotransfekcijo s plazmidom, ki kodira DsRed (Seluanov et al, 2010). Učinkovitost NHEJ po pcDNA3.1-nukleofekcija hGH1 je bila 0.77-0.83in zmanjšana pri 48h(p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

Avtokrini/parakrini GH poveča nepopravljeno poškodbo DNK

Pri preučevanju, ali npGH poveča poškodbo DNK, smo opazili, da so NCC in organoidi, stabilno transficirani z lenti-GH, pokazali povečano endogeno nepopravljeno poškodbo DNK, kot je bilo izmerjeno s testom Comet (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH se inducira v starih 3D človeških črevesnih organoidih in oslabi DDR

Po opaženi povečani ekspresiji GH in poškodbi DNK v vzorcih starega človeškega debelega črevesa smo "starali" organoide, ustvarjene iz treh neodvisnih linij iPSC, da bi povzeli model staranja človeškega tkiva. Ti organoidi so sestavljeni iz enterocitov, vrčastih celic, Panethovih celic in enteroendokrinih celic ter izražajo homeobox 2 (CDX2) kavdalnega tipa (Barrett et al., 2014; Gao et al., 2009; Workman et al., 2017). Dve od treh linij iPSC (liniji 1 in 3) sta bili pridobljeni od posameznikov, starejših od 60 let, tretja linija iPSC (linija 2) pa je bila pridobljena iz fibroblastov 30-letnega posameznika. Organoide, ustvarjene iz linij 1 in 3, smo gojili do 2 meseca, na kateri točki se je celična proliferacija znatno upočasnila. Nasprotno pa so se organoidi, ustvarjeni iz linije 2, močno razmnoževali v kulturi do 4 mesece. Celično staranje je bilo potrjeno pri vseh 3 linijah s povečanim p16, pa tudi z zmanjšano dolžino telomer (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Ker se zdi, da te organoidne lastnosti in vitro zvesto povzemajo celične spremembe, skladne s staranjem človeškega tkiva (Baker et al.,2011; Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013), smo uporabili to model za nadaljnje preučevanje signalnih mehanizmov, ki so podlaga za staranje epitelija debelega črevesa pri človeku. V vrstici 1 so bile ravni mRNA GH inducirane po 1 mesecu v kulturi in se po 2 mesecih še povečale (p < 0,05)="" (slika="" 6c),="" kar="" je="" skladno="" s="" pomembno="" povečanim="" npgh,="" opaženim="" v="" starih="" organoidih="" tako="" pri="" western="" blotu="" kot="" pri="" imunohistokemiji="" (ihc).="" (slike="" 6d,="" 6e="" in="" s5b).="" yh2ax="" je="" bil="" močno="" induciran="" tudi="" s="" podaljšano="" kulturo,="" kar="" kaže="" na="" akumulirano="" endogeno="" poškodbo="" dna="" s="" staranjem="" in="" vitro.="" v="" skladu="" z="" rezultati,="" ki="" kažejo="" potlačen="" p53="" v="" ncc="" in="" organoidih,="" transficiranih="" z="" gh="" (sliki="" 4a-4c),="" smo="" opazili="" potlačen="" p53="" pri="" 1="" in="" 2="" mesecih="" kulture,="" skladno="" s="" povečanim="" npgh="" (sliki="" 6e="" in="" s5b).="" podobni="" rezultati="" (="" a="" in="" b)="" western="" blot="" (a)="" celic="" ancc,="" hncf="" in="" hct116="" ter="" (b)="" organoidov.="" celice="" smo="" obdelali="" z="" navedenimi="" odmerki="" etopozida="" in="" analizirali="" 24="" ur="" kasneje.="" organoide="" smo="" obdelali="" s="" 3="" um="" etopozida="">

(C) NCC, nukleofektiran z GH siRNA (siGH RNA) ali kodirano RNA (Scr RNA) kot kontrolo 24 ur, je bil zdravljen z navedenimi odmerki etopozida (Etop) in analiziran 24 ur kasneje. ImageJ kvantifikacija Western blotov je prikazana na sliki S1.

（D） Reprezentativna slika NCC, zdravljenega z 20 μM etopozida 24 ur. GH, rdeča; yH2AX, zelena; faloidin, siv; DAPI, modra. Svetlo zeleno jedro kaže na apoptozo. Lestvica, 20 um. Kontrolne neobdelane celice.

(E) Western blot GH v gojišču ANCC in organoidov, obdelanih z 20 oziroma 5 uM etopozida. Medij je bil zbran iz toplote 8 in 24 ur in iz organoidov 4-48 h po obdelavi. Ponceau je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. Prikazani so reprezentativni madeži iz vsaj 3 neodvisnih poskusov.

so bili pridobljeni s kultiviranjem organoidov, ustvarjenih iz linij 2 in 3 iPSC, 4 oziroma 2 meseca (sliki S6A-S6D).

Poleg tega je bil povečan npGH v starih organoidih povezan z oslabljenim DDR, z zatrto fosforilacijo ATM in DNA-PKcs ter nižjimi ravnmi fosforiliranega p53 (sliki 6E in S5B). Ti rezultati kažejo, da potlačena aktivnost DDR vodi do akumulirane nepopravljene poškodbe DNK, kar dokazuje tudi indukcija yH2AX (sliki 6E in S5B). Po 2 mesecih v kulturi so stari organoidi, okuženi z GH shRNA, pokazali povečan p53 (sliki 6F in S7A) in zmanjšano poškodbo DNA, izmerjeno s testom Comet (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

Pomanjkanje signalizacije GH zmanjša in vivo poškodbe DNA debelega črevesa pri starajočih se miših

Za potrditev naših rezultatov, pridobljenih pri starih organoidih, smo preučevali stare miši WT in GHR-7 in vivo. Poškodba DNK debelega črevesa je bila bistveno večja pri starih (24-mesečnih) v primerjavi z mladimi (3-mesečnimi) WT mišmi (p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

DISKUSIJA

Tukaj prikazujemo, da se npGH s starostjo povečuje v tkivu človeškega debelega črevesa in v 3D človeških črevesnih organoidih. Dokazujemo več vrst dokazov, ki kažejo, da je v starem tkivu debelega črevesa npGH induciran s poškodbo DNK, kot so opazili na človeških modelih, vključno z epitelnimi netumornimi celicami, normalnimi fibroblasti debelega črevesa, organoidi in tkivom raka debelega črevesa bolnikov, ki so podvrženi terapijam, ki poškodujejo DNK. ; prav tako prikazujemo podobne ugotovitve in vivo v debelem črevesu miši z aktiviranim DDR.

Z uporabo 3D človeških črevesnih organoidov smo opazili povečan p16, staranje in skrajšanje telomer, vse skladno s starostnimi spremembami v človeškem tkivu (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). Kljub omejitvam organoidnega modela naši rezultati podpirajo črevesne organoide kot zvesto človeško rekapitulacijo za preučevanje signalnih mehanizmov, na katerih temeljijo spremembe debelega črevesa, povezane s starostjo (Hu et al., 2018).

Ugotovili smo, da lokalni npGH, ki deluje na avtokrini/parakrini način, zavira p53 in poveča proliferacijo sosednjih celic. Inducirani GH prav tako zavira DDR in popravilo DNK, kar dodatno poveča kopičenje poškodb DNK. Rezultati so tudi skladni z opaženimi učinki na kopičenje poškodb DNK v tumorjih hipofize, ki izločajo GH (Ben-Shlomo et al., 2020).

Delovanje GH v normalnem tkivu debelega črevesa podpira razvoj proliferativnega okolja, ki je lahko osnova s ​​starostjo povezanih povečanih stopenj polipov debelega črevesa, kar ponazarjajo s starostjo povezane poškodbe DNK in kromosomska nestabilnost kot gonila razširjenosti raka debelega črevesa pri bolnikih, starejših od 50 let (Aunan et al., 2017). S starostjo povezana povečana poškodba DNK, ki jo prikazujemo tukaj, je tudi skladna s poročili, da yH2AX narašča linearno s starostjo v vzorcih normalnega debelega črevesa (Risques et al., 2008). Naše opaženo izrazito povečanje yH2AX v starajočih se organoidih kaže na kopičenje poškodb DNK, saj yH2AX označuje mesta poškodbe DNK, da pritegne proteine ​​za popravilo DNK (Turinetto in Giachino, 2015). Ti rezultati so lahko na videz neskladni z dejstvom, da GH, induciran v starajočih se celicah, zavira fosforilacijo H2AX. Vendar si ta opažanja razlagamo tako, da pokažemo, da GH zmanjša aktivnost DDR z zmanjšanjem fosforilacije ATM, kar posledično zmanjša (vendar ne popolnoma odpravi) fosforilacijo spodnjih proteinov, vključno s H2AX. Ko DDR ni ustrezno aktiviran, se popravilo DNK spremeni, vendar se yH2AX še vedno kopiči, saj označuje mesta nepopravljene poškodbe DNK. Tako ravni yH2AX, opažene v starajočem se človeškem tkivu in organoidih, odražajo neto rezultat aktivnosti DDR in količino nepopravljene DNK.

Poškodba DNK se lahko kopiči v starajočem se tkivu zaradi izgube popravila baze z izrezom, verjetno zaradi izgube odziva p53 na poškodbo DNK (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). V naših poskusih se je p53 zmanjšal v celicah debelega črevesa in organoidih, ki izražajo npGH, kar je skladno s prejšnjimi ugotovitvami, da GH zavira p53 (Chesnokova et al., 2016). Nasprotno pa stare GHR-/-miši, ki so odporne proti raku in imajo daljšo življenjsko dobo (Basu et al., 2018), kot tudi miši GHRcolKO, specifične za debelo črevo, kažejo povečano izražanje p53 kolona, ​​kar verjetno izboljša popravilo DNA. Ker GH zavira p53 (Chesnokova et al., 2013), lahko indukcija npGH povzroči spremembe v lokalnem mikrookolju, ki so skladne s starostjo povezanim zmanjšanim p53 (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). Promotor GH vsebuje vezavno mesto p53 (Chesnokova et al., 2013), p53, ki ga povzroči poškodba DNA, pa aktivira izražanje GH (Chesnokova et al. 2013, 2019a). Tako naši rezultati kažejo, da v starih organoidih kopičenje poškodbe DNK povzroči npGH, ki posledično zniža p53.

Pomembno je, da ker se npGH izloča lokalno iz celic, poškodovanih z DNK, bi lahko delovalo parakrino delovanje izločenega GH na sosednje celice. Med so-kultiviranjem hNCF, ki izraža GH, s čipom Colon Intestine-Chip smo opazili povečano poškodbo DNA in proliferacijo ter znižan p53/p21 v epitelijskih celicah, vgrajenih v čip, ki so bile izpostavljene parakrinim učinkom fibroblastov, pridobljenih navzgor. Ti rezultati kažejo, da lokalno neinducirano staranje v človeškem tkivu spremeni tkivno mikrookolje z zaviranjem tumorskih supresorskih proteinov in izboljšanjem proliferacije epitelija in poškodbe DNA.

Rezultati so skladni z opažanji, da zdravljenje z eksogenim GH poveča proliferativno sposobnost, tvorbo kolonij in metastaze pri miših DJ-1 KO (Chien et al., 2016), in z dokazi, da je indukcija GH v človeških tumorskih celicah povezana z napredovanje več vrst raka (Perry et al., 2017); ti so v skladu z našimi rezultati, ki kažejo manjše število tvorb kolonij in manjšo velikost kolonij z zatiranjem GH.

Poti popravljanja poškodb DNK ščitijo pred kromosomsko nestabilnostjo, ki poganja celično transformacijo (Negrini et al. 2010). Na primer, Tip60 aktivira ATM (Jackson in Bartek, 2009), ATM, osrednji regulator DDR, pa fosforilira in stabilizira p53. Starajoče se celice kažejo zmanjšano supresijo ATM in p53, pa tudi disregulacijo popravljanja DNK s kasnejšo nepopravljeno poškodbo DNK (Lan et al., 2019). Tako se v celicah debelega črevesa poškodbe DNK kopičijo s starostjo (Risques in sod., 2008; Schu-macher in sod., 2008), vsaj deloma zaradi upadanja učinkovitosti DDR (Jackson in Bartek, 2009), in potlačenega p53 v odziv na y-obsevanje pri starajočih se miših so pripisali s starostjo povezanemu upadu p53-stabilizirajočega ATM (Feng et al, 2007). V naših poskusih je neinducirano kot odziv na poškodbo DNK tudi zavrlo Tip60, kar je verjetno povzročilo do zmanjšanega popravljanja DNA, kar dokazuje oslabljena fosforilacija ATM oziroma p53. Ti rezultati kažejo, da lahko lokalna čezmerna ekspresija npGH prispeva k s starostjo povezani neregulirani DDR in popravljanju DNK. V starih organoidih je indukcija GH oslabila DDR, medtem ko je supresija GH aktivirala DDR, kar dokazuje zmanjšana poškodba DNK. Te rezultate podpirajo naša prejšnja opažanja, da je blokiranje signalizacije GH v ANCC povzročilo zmanjšano poškodbo DNK (Chesnokova et al., 2019a). Poleg tega smo pokazali, da se poškodba DNK debelega črevesa ne kopiči pri miših GHRcolKO, usmerjenih v debelo črevo, z izrezanim GHR, ampak se je kopičila v tankem črevesu, kjer je bil GHR nedotaknjen. Ti rezultati, skupaj z našo demonstracijo, da ostarele GHR-7-miši ne kopičijo poškodb DNK debelega črevesa, in vivo podpirajo hipotezo, da lokalna indukcija npGH s celicami agemayrender, dovzetnimi za transformacijo, in morda tudi prispeva k odpornosti proti terapiji raka, kot je bilo predlagano (Basu in Kopchick, 2019).

Tukaj prikazani rezultati prav tako povečajo možnost, da bi učinke GH lahko posredoval insulinu podoben rastni faktor 1 (IGF1). Za razliko od GH signalizacija IGF1 aktivira popravljanje DNA v netumorskih in tumorskih celicah (Chesnokova in Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012) in pokazali smo, da GH zavira p53 in inducira DNA poškodbe pojavijo neodvisno od IGF1 v normalnem tkivu debelega črevesa (Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). Vendar pa lahko v celicah in tkivih, v katerih GH aktivira IGF1, slednji rastni faktor signalizira tudi na celično specifičen način, da prepreči delovanje GH na stabilnost genoma.

Ugotovitve kažejo, da npGH, induciran v starajočem se tkivu debelega črevesa kot odziv na nakopičeno poškodbo DNK, olajša nadaljnje poškodbe DNK in se zdi, da je škodljiva determinanta popravljanja poškodb DNK. Ekstrapolacija teh ugotovitev zagotavlja platformo za več potencialnih kliničnih aplikacij. Ker je kopičenje poškodb DNK značilnost bolezni, povezanih s starostjo, se lahko usmerjanje signalizacije GH za blokiranje avtokrinih/parakrinih učinkov izkaže za koristno za oviranje s starostjo povezane poškodbe epitelijske DNK in končno izboljšanje napredovanja s starostjo povezanih epitelijskih patologij (Miman et al. ,2016) Takšen pristop lahko koristi tudi bolnikom z rakom, ki so podvrženi terapijam, ki poškodujejo DNK, pri katerih spremembe epitelnega polja, ki jih povzroči avtokrino/parakrino, nobeno dejanje ne more poškodovati normalnega sosednjega tkiva. V zvezi s tem lahko prekinitev signalizacije GH z odobrenim antagonistom GHR (List et al., 2011; Trainer et al, 2000) prinese klinične koristi. Pomembno je, da je bil človeški GH neustrezno promoviran kot neodobrena terapija za preprečevanje staranja in krepitev moči (Giordano et al., 2008; Holt in Ho, 2019; Medeiros in Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Glede na škodljive parakrine učinke npGH, o katerih poročamo tukaj, lahko dolgoročno neustrezno dajanje GH kot eliksirja proti staranju izzove signalizacijo GHR in tvega razvoj poškodbe DNA epitelijskih celic ter potencialno aktivacijo okultnih proliferativnih lezij.

Ta članek je izvleček iz Cell Reports 37, 110068, 14. december 2021, ª 2021 Avtor(ji). 1 To je članek z odprtim dostopom pod licenco CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)