Metformin izboljša izvornost človeških matičnih celic, pridobljenih iz maščobnega tkiva, z znižanjem

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Maščobno tkivo ima pomembno vlogo pri uravnavanju presnovne homeostaze s shranjevanjem odvečne maščobe in zaščito drugih organov pred lipotoksičnostjo. Staranje je povezano s centralno prerazporeditvijo maščobe, kar doseže vrhunec v zmanjšanju inzulinsko občutljivega podkožja in povečanju inzulinsko odpornih visceralnih maščobnih depojev. Maščobne matične celice (ASC) igrajo pomembno vlogo pri regeneraciji maščobnega tkiva. Stare ASC kažejo zmanjšano steblo in regenerativni potencial zaradi kopičenja oksidativnega stresa in poškodbe celic, povezane z mitohondrijsko disfunkcijo. Metformin je dobro uveljavljeno zdravilo proti sladkorni bolezni, ki je pokazalo učinke proti staranju pri različnih organizmih in živalskih modelih. V tej študiji smo analizirali učinek zdravljenja z metforminom na izvornost človeških ASC v celični kulturi in modelih kulture celega maščobnega tkiva. Naši rezultati kažejo, da metformin izboljša izvornost ASC, zmanjša njihovo stopnjo proliferacije in diferenciacijo adipocitov. Pri raziskovanju možnega osnovnega mehanizma smo opazili zmanjšanje aktivnosti mTOR in ERK pri ASC, zdravljenih z metforminom. Poleg tega smo opazili povečanje aktivnosti avtofagije po zdravljenju z metforminom. Sklepamo, da zdravljenje z metforminom izboljša izvornost ASC z zmanjšanjem signalizacije mTOR in ERK ter izboljšanjem avtofagije. Prihodnja vrednotenja in vivo na živalskih modelih in ljudeh bodo utrla pot klinični prilagoditvi tega dobro uveljavljenega zdravila za oživitev izvornosti starih matičnih celic.

Za več informacij kliknite tukaj

Ključne besede:maščobne matične celice; maščobno tkivo; stebelnost; diferenciacija; širjenje; metformin; mTOR; ERK; avtofagija

1. Uvod

Maščobno tkivo je dinamičen organ, ki prispeva pomembno homeostatsko vlogo pri uravnavanju ravnovesja hranil, občutljivosti na inzulin in imunske modulacije. Maščobno tkivo opravlja to vlogo tako, da skladišči in oksidira odvečne maščobne kisline, s čimer preprečuje steatozo in lipotoksičnost v drugih organih [1]. S starostjo povezana inzulinska rezistenca je najpogostejša presnovna bolezen. Približno 25 odstotkov prebivalstva ZDA, starejšega od 65 let, trpi za sladkorno boleznijo, kar ima za posledico višjo stopnjo umrljivosti, zmanjšano funkcionalno stanje, povečano tveganje hospitalizacije in prekomerno breme za zdravstveno gospodarstvo [2]. Čeprav je povezava med sladkorno boleznijo in debelostjo že dolgo znana, povezava med staranjem in sladkorno boleznijo tipa 2 ostaja nedosegljiva [3]. Prva ugotovitev, ki je povezala zmanjšanje tolerance za glukozo s staranjem, je bila podana leta 1921 [4]. Številne študije so od takrat ugotovile, da je zmanjšana občutljivost za inzulin glavni vzrok za s starostjo povezano motnjo presnove glukoze [5,6]. Glede na anatomsko lokacijo lahko maščobno tkivo na splošno razdelimo na dve depoji: podkožno in visceralno maščobno depojo. Lokacija in funkcija depoja maščobnega tkiva sta pomembna glede občutljivosti na insulin; na primer, visceralni depo je bolj odporen, medtem ko je podkožni depo bolj občutljiv na insulin [7]. S starostjo povezana postopna izguba volumna podkožnega maščobnega tkiva povzroči zmanjšan privzem glukoze in lipidov, kar povzroči prelivanje lipidov in zunajmaternično odlaganje lipidov v mišicah in jetrih, kar prispeva k razvoju insulinske rezistence [8].

Maščobno tkivo je sestavljeno iz različnih tipov celic. Encimska prebava maščobnega tkiva s kolagenazo proizvede dve glavni frakciji: adipocitno frakcijo in stromalno vaskularno frakcijo (SVF)[9]. SVF obsega matične celice (ASC), limfocite, endotelne celice, pericite in fibroblaste [10]. ASC so imunsko-fenotipsko definirane kot celice CD34 plus CD90 plus CD29 plus CD45-CD31 mezenhimskega izvora, ki kažejo sposobnost diferenciacije treh linij v kosti, hrustanec ali maščobo [11,12]. V belem maščobnem tkivu se te celice večinoma nahajajo v vaskularni stromi okoli majhnih krvnih žil ter se lahko razmnožujejo in diferencirajo v adipocite[11]. Maščobne matične celice (ASC) igrajo pomembno vlogo pri regeneraciji maščobnega tkiva s proliferacijo, samoobnavljanjem in diferenciacijo. Staranje je povezano z izgubo teh lastnosti stebla pri ASC [13,14]. S starostjo povezano zmanjšanje velikosti depoja podkožne maščobe naj bi bilo posledica spremenjene replikacije in diferenciacije ASC [15-17]. Findeisen et al. nakazujejo kopičenje oksidativnega stresa v maščobnem tkivu med staranjem, kar negativno vpliva na sposobnost diferenciacije; [15] vendar pa natančni mehanizmi, na katerih temelji izguba stebla pri ASC, niso razumljeni. Nedavne študije so pokazale, da so zmanjšana avtofagija, višja mehanična tarča aktivnosti poti rapamicina (mTOR) in kopičenje reaktivnih kisikovih vrst (ROS) povezani z izgubo stebla pri ASC in indukcijo prezgodnjega staranja pri ASC [18-20].

Cistanche lahko upočasni staranje

Metformin je zdravilo proti sladkorni bolezni, ki se običajno uporablja za zniževanje krvnega sladkorja in izboljšanje občutljivosti na insulin. Uporablja se lahko za zdravljenje različnih presnovnih motenj, povezanih s staranjem, kot so bolezni srca in ožilja, raki in kognitivni upad [21, 22]. Učinki metformina na podaljšanje dolgoživosti so bili dokazani pri črvih, miših in podganah z omejitvijo prehrane, ki posnema učinek stimulacije aktivnosti protein kinaze, aktivirane z adenozin monofosfatom (AMPK) [23]. Različne študije so pokazale, da metformin zavira tarčo rapamicina (mTOR) pri sesalcih [24, 25]. Signalne poti AMPK-mTOR specifično uravnavajo značilnosti celične homeostaze, kot so avtofagija, proliferacija, energetski metabolizem in sinteza beljakovin [26]. Pokazalo se je, da metformin zavira proliferacijo, diferenciacijo in vnetje, zmanjšuje oksidativni stres in mitohondrijski potencial ter izboljšuje splošno izvornost v različnih vrstah odraslih matičnih celic [27, 28]. Učinek metformina na presnovo in nastanek ASC in vitro in in vivo ni jasen.

V tej študiji smo uporabili 2D kulturo človeških ASC in tehnike kulture celotnega človeškega maščobnega tkiva za simulacijo celične organizacije in vivo in tkivnega mikrookolja. Z uporabo teh eksperimentalnih modelov smo proučevali učinek zdravljenja z metforminom na diferenciacijo, proliferacijo in izvornost ASC ter raziskali molekularne mehanizme, vključene v te celične procese.

2. Materiali in metode

2.1 Specifikacije donatorja

Maščobno tkivo je bilo zbrano pri petih darovalkah brez sladkorne bolezni v starosti 39 ± 13 let in ITM 27 ± 4, ki so bile podvržene elektivnim posegom plastične kirurgije v Medicinskem centru Univerze v Pittsburghu (UPMC). Postopek zbiranja tkiv je odobril Institucionalni revizijski odbor Univerze v Pittsburghu (IRB št. 0511186).

2.2. Izolacija in gojenje človeških ASC

Maščobne prekurzorske celice so bile izolirane na naslednji način [19,29]. Biopsije maščobnega tkiva po kirurških posegih so bile prenesene v laboratorij v sterilno zaprti posodi. Tkivo smo splaknili z Dulbeccovo fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), čemur je sledila odstranitev vlaknatega materiala in krvnih žil z disekcijo. Tkivo smo razrezali na koščke (1-2 mg) in prebavili v digestijskem pufru (HBSS, ki vsebuje 200 U/mL kolagenaz (CLS tipa II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI). , ZDA) in 2 odstotka brez BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA)) med mešanjem 60 minut pri 37 stopinjah; 1 mg maščobnega tkiva/3 mL pufra za prebavo. Razpršeno tkivo centrifugiramo 10 minut pri 200 × g pri sobni temperaturi. Plavajoče adipocite smo aspirirali in peletirane celice stromalne vaskularne frakcije (SVF) suspendirali v pufru za lizo eritrocitov (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) in inkubirali 10 minut pri sobni temperaturi. Za odstranitev tkivnih ostankov smo celično suspenzijo filtrirali skozi najlonsko mrežico (velikost por 100 um; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Po drugem koraku centrifugiranja (10 min pri 200 × g) smo peletirani SVF suspendirali v mediju ASC (Dulbeccov modificirani Eagleov medij (DMEM)/F-12 medij (1:1) s HEPES in L-glutaminom（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA）, dopolnjen s 33 μM biotina （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA）, 17 μM pantotenata（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA), 10 ng/mL EGF,1 ng/mL bFGF, 500 ng/mL insulina, 2,5 % fetalnega govejega seruma in 12,5 μM/mL gentamicina （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA） in nasajene pri gostoti 50000 celic /cm2 v bučkah T175.

Ko smo dosegli 70-odstotno sotočje, smo celice sprali s PBS in tripsinizirali z uporabo 0,05-odstotne raztopine tripsina-EDTA 1x (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Tripsin je bil inaktiviran z dodatkom medija ASC plus 10 odstotkov FBS in odstranjen s centrifugiranjem pri 300 × g 5 minut, preden so bile celice zasejane pri gostoti 5000 celic/cm². ASC so ponovno zrasli do 70-odstotne konfluence pred delitvijo. ASC v prehodih 3-4 so bili uporabljeni v tej študiji. Celice smo obdelali z različnimi koncentracijami metformina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), rapamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) ali inhibitorja U0126 v skladu z eksperimentalno shemo.

2.3. Adipogena diferenciacija

Za indukcijo adipogeneze so bile ASC zasejane z gostoto 50,000 celic/cm² v 6-plošče za celične kulture 6-. Adipogenezo smo inducirali z diferenciacijskim medijem, sestavljenim iz 0.2 uM insulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA),0.5 mM 1-metil{{9 }}izobutilksantin (IBMX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), 0,25 μM deksametazon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in 10 ug/ml transferina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) v ASCmedium. Po 3 dneh diferenciacije smo gojišče zamenjali in celice gojili v diferenciacijskem gojišču brez IBMX 14 dni.

2.4. Kultura maščobnega tkiva

Kulturo maščobnega tkiva smo izvedli v 6-ploščih za celične kulture z vdolbinicami z nekaj spremembami, kot so objavili Harms et al. [30]. Celotno maščobno tkivo smo razrezali na manjše koščke velikosti 3-5 mm in gojili v 5 ml gojišča celične kulture. Celična cedila z velikostjo por 70 μM so bila nameščena nad fragmenti tkiva, da je bilo tkivo potopljeno v medij. Fragmenti tkiva so bili prebavljeni s kolagenazo, kot je razloženo zgoraj za postopek izolacije ASC, in SVF je bil analiziran za izražanje z ASC povezanih genov stebla.

2.5. Oljno rdeče O barvanje

Za vizualizacijo lipidnih kapljic smo celice 1 uro fiksirali s 4 odstotki paraformaldehida v PBS in jih obarvali s 0.3 odstotki Oil Red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) v izopropanolu/vodi ( 60:40) 1 uro. Končno pranje smo izvedli dvakrat z destilirano vodo. Za kvantifikacijo absorbiranega Oil Red O je bil madež eluiran z izopropanolom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in optična gostota je bila izmerjena pri 518 nm.

2.6. Barvanje telesa

Na 14. dan po indukciji adipogeneze smo celice obarvali z Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, ZDA) in Hoechstom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) 30 minut pri 37 stopinjah. Slike so bile pridobljene s fluorescenčnim mikroskopom in analizirane s programsko opremo ImageJ.

2.7. Floucitometrija

ASC v tretjem prehodu so bili uporabljeni za analize pretočne citometrije za površinsko izražanje CD29 (Biolegend, San Diego, CA, ZDA), CD90 (Biolegend, San Diego, CA, ZDA), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, ZDA) , CD24 (Biolegend, San Diego, CA, ZDA) in CD31 (BD, NJ, ZDA). Celice smo tripsinizirali, sprali s PBS in obarvali s protitelesi v pufru za barvanje FACS (1 odstotek BSA v PBS). Neobarvani ASC so bili uporabljeni kot kontrola. Fluorescenčni signal je bil izmerjen s pretočnim citometrom (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, ZDA), podatki pa so bili analizirani s programsko opremo FlowJo (BD, Franklin Lakes, NJ, ZDA).

2.8. Osteogena diferenciacija

ASC so gojili do sotočja v {{0}}ploščah z vdolbinicami in osteogeno diferenciacijo inducirali z uporabo osteogenega medija (DMEM 10 odstotkov FBS, 0,1 uM deksametazona, 10 mM -glicerol fosfata in 50 μM askorbinske kisline）. Na 21. dan po diferenciaciji so bile celice fiksirane v 4-odstotnem paraformaldehidu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in obarvane z Alizarin Red Stain (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). je bila izvedena s programsko opremo Image J.

2.9. Odkrivanje apoptoze z barvanjem z aneksinom V-APC/PI

Apoptotično celično smrt smo izmerili z uporabo kompleta Annexin V-APC/PI (Biolegend, San Diego, CA, ZDA). Skupno 10,000(celic/jamico) ASC smo zasejali na 6-plošče z vdolbinicami in inkubirali pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2. Celice smo obdelali z metforminom (0.25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM in 5 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Po 72 urah obdelave so bile celice zbrani s tripsinizacijo in obarvani z 2,5 μL AnnexinV-APC in 2,5 μL PIin vezavnega pufra, inkubirani v temi pri sobni temperaturi 15 do 20 minut in analizirani s pretočno citometrijo (Fortessa, BD, NJ, ZDA).

2.10.Odkrivanje reakcijskih vrst kisika

Ravni ROS so bile določene z uporabo sonde fluorescenčnega barvila 2',7'-diklorofluorescein diacetata (DCFH2-DA) (Invitrogen, Waltham, MA, ZDA). ASC (10, 000 celic/jamico) smo gojili v 6-plošči z vdolbinicami in inkubirali z metforminom (5 mM) pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO, 72 ur. Po inkubaciji smo ASC tripsinizirali in obarvali s 50 μM DCFH2-DA barvilom 30 minut pri 37 stopinjah in analizirali s fluorescenčnim mikroskopom.

2.11. Barvanje TMRM

ASC (10,000 celic/jamico) smo gojili v 6-plošči z vdolbinicami, obdelali z različnimi odmerki metformina (5 mM) 72 ur in inkubirali pri 37 stopinjah s 100 nM TMRM (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, ZDA) 30 minut pri 37C. Po inkubaciji smo celice opazovali pod fluorescenčnim mikroskopom. Image] je bil uporabljen za kvantifikacijo fluorescence mikroskopskih slik.

2.12. Kvantitativna ekspresija genov RT-PCR

Celotno RNA smo izolirali z RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija), sintezo cDNA pa smo izvedli s kompletom RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Gensko specifični primerji so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA. Kvantitativno analizo izražanja smo izvedli z uporabo Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Kvantifikacijo mRNA smo izvedli z uporabo -aktina za normalizacijo. Podatke za vsak genski zapis smo normalizirali z izračunom razlike (ACt) med geni Ct-housekeeping in Ct-Target. Relativno povečanje ali zmanjšanje izražanja je bilo izračunano s primerjavo referenčnega gena s ciljnim genom (AACT) z uporabo formule za relativno izražanje (=24ACt).

2.13. Western Blot

Western blot analiza je bila izvedena v bistvu, kot je opisano [19]. Metoda, uporabljena za normalizacijo ravni beljakovin, je bila "Pierce BCA Protein Assay Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Celične lizate (15 ug celotnega proteina na stezo) pripravimo v pufru vzorca natrijevega dodecil sulfata (SDS), ločimo s SDS-PAGE in popivnamo na poliviniliden difluoridne membrane. Uporabljena so bila naslednja protitelesa: mišji protičloveški -aktin (Proteintech, IL, ZDA), perilipin (Cell Signaling, MA, ZDA), fosfor-P70S6K (Cell Signaling, MA, ZDA), skupni P70S6K (Cell Signaling, MA, ZDA), pERK1/2 (Cell Signaling, MA, ZDA), skupni ERK1/2 (Cell Signaling, MA, ZDA), protimišji IgG HRP konjugat (Proteintech, IL, ZDA) in kunčji protipodganji IgG HRP( Proteintech, IL, ZDA). Za denzitometrične analize je bila uporabljena programska oprema Image J. 2.14. Statistična analiza

Statistične analize so bile izvedene v GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ZDA). FlowJo je bil uporabljen za analizo FACS. Pomembnost razlike med povprečji smo ocenili s Studentovim t-testom ali analizo variance. Prazna napaka je predstavljena kot povprečje ± SEM. Vrednosti so bile značilne pri vrednosti p<><0.01 and=""><>

3. Rezultati

Metformin je dobro uveljavljeno zdravilo proti sladkorni bolezni, za katerega se je izkazalo, da igra pomembno vlogo pri podaljševanju dolgoživosti [31]. Da bi preučili učinek zdravljenja z metforminom na izvornost matičnih celic, pridobljenih iz maščob, smo izolirali ASC iz maščobnega tkiva človeških darovalcev s presnovo kolagenaze. Izolirani ASC so bili plastični adherenti in so imeli fibroblastno ali vretenasto morfologijo. Analiza s pretočno citometrijo je pokazala, da so bili ASC pozitivni na označevalce mezenhimskih matičnih celic, kot so CD29, CD90 in CD24, vendar negativni na označevalec hematopoetske linije CD45 in endotelijski označevalec linije CD31 (slika 1A). Poleg prikaza tipičnega fenotipa ASC, ASC so pokazali močan potencial adipogene in osteogene diferenciacije, identificiran z obarvanjem Bodipy oziroma Alizarin Red S (slika 1B).cistanche แอ ม เว ย์Označeni ASC so bili uporabljeni za nadaljnje poskuse v naši študiji.

V literaturi so poročali, da metformin zmanjša adipogeno diferenciacijo izvornih celic. Naš cilj je raziskati regulacijo diferenciacije adipocitov ASC po zdravljenju z metforminom. ASC so zdravili z 1, 2,5 in 5 metforminom, začenši 2 dni pred adipogeno indukcijo in skozi celoten proces diferenciacije. Bodipy in Oil Red Ostains smo uporabili za vizualizacijo oljnih kapljic 14. dan po indukciji diferenciacije. Rezultati Oil Red O (slika 1C) in obarvanja Bodipy (slika 1D) razkrivajo, da zdravljenje z metforminom znatno zavira adipogeno diferenciacijo na način, ki je odvisen od odmerka, v primerjavi s kontrolnimi celicami. Zaviranje adipogene diferenciacije je bilo nadalje potrjeno z uporabo Western blot analize markerskega proteina diferenciacije adipocitov perilipina. Za to smo celične lizate zbrali iz diferenciranih celic na 14. dan adipogene diferenciacije in analizirali izražanje perilipina. Naši rezultati Western blota kažejo pomembno znižanje ekspresije perilipina po zdravljenju z metforminom med adipogeno diferenciacijo (slika 1E), kar je bilo v korelaciji z zmanjšanjem madežev Bodipy in Oil Red O. Sklepamo, da zdravljenje z metforminom zavira adipogeno diferenciacijo človeških ASC, pri čemer obseg zaviranja pozitivno korelira z odmerkom zdravljenja z metforminom.

Večje stopnje diferenciacije in proliferacije povzročijo izgubo stebla. Ker smo opazili, da metformin zmanjša adipogeno diferenciacijo, nas je zanimalo raziskovanje učinka zdravljenja z metforminom na proliferacijo ASC in vitro. ASC smo zdravili z metforminom in celice prešteli 4. dan po gojenju v prisotnosti ali odsotnosti metformina. Iz naših rezultatov smo ugotovili, da metformin bistveno zmanjša stopnjo celične proliferacije v primerjavi s kontrolnimi ASC (slika 2A). Matične celice imajo pomembno vlogo pri regeneraciji in vzdrževanju tkiv.koliko cistanche vzetiDa bi matične celice učinkovito opravljale svojo regenerativno vlogo, morajo ohraniti svojo značilnost izvornosti. Analizirali smo učinek zdravljenja z metforminom na izražanje genov stebla v ASC. V ta namen smo uporabili kvantitativno PCR v realnem času za analizo genov, povezanih z vzdrževanjem stebla v ASC. Opazili smo, da je metformin znatno povečal izražanje markerjev maščobnih matičnih celic, kot so BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 in DLK1, v primerjavi s kontrolnimi ASC (slika 2B). Naši rezultati kažejo, da zdravljenje z metforminom učinkovito upočasni proliferacijo ASC in tako prepreči izčrpanost celic zaradi proliferacije s povečanjem izražanja genov za podpis stebla.

Slika 1. Zdravljenje z metforminom zavira adipogeno diferenciacijo ASC na način, ki je odvisen od odmerka. (A) ASC so testirali na izražanje CD29, CD90, CD24, CD31 in CD45 s pretočno citometrijo. Predstavljena sta odstotek pozitivnosti, prikazan v histogramih, in srednja intenzivnost fluorescence (MFI), prikazana v tabeli za kontrolo (neobarvane ASC) in obarvane (ASC, obdelane z ustreznimi protitelesi). (B) ASC so bili izpostavljeni adipogeni ali osteogeni diferenciaciji z uporabo diferenciacijskih koktajlov, specifičnih za rod. Diferenciacijo do adipocitne linije smo potrdili z obarvanjem Bodipy, osteogenezo pa z obarvanjem z alizarin rdečim. Odstotek območja, obarvanega z alizarin rdečim, je bil izračunan z uporabo slike J. (C) ASC so bile 14 dni obdelane s koktajlom za diferenciacijo adipocitov v prisotnosti ali odsotnosti različnih odmerkov metformina. Razvoj adipocitov 14. dan po indukciji so ocenili z barvanjem lipidnih kapljic z uporabo Oil Red O madeža. Absorbirano oljno rdeče O madež smo ekstrahirali in izmerili optično gostoto. Optična gostota iz kontrolnih ASC je bila vzeta za 100 odstotkov, relativna sprememba po zdravljenju z metforminom pa je bila prikazana (n =3). (D) Vsebnost lipidov na dan 14 je bila določena z barvanjem Bodipy (zeleno). Za barvanje jeder smo uporabili Hoechst (modro).kaj je cistanche(E) Western blot analiza ekspresije proteina perilipina. -Aktin je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. Kvantifikacija gostote pasov perilipinskega proteina, normalizirana na uporabljeni -aktin Slika J. Slike in grafi so predstavniki treh neodvisnih ponovitev (n=3). *str<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Da bi izključili, da zmanjšanje diferenciacije in proliferacije ni posledica citotoksičnih učinkov metformina na ASC, smo analizirali sposobnost preživetja celic, zdravljenih z metforminom. Analize obarvanja AnnexinV/PI s pretočno citometrijo niso pokazale pomembnega povečanja apoptotičnih ali nekrotičnih celic po zdravljenju z naraščajočimi koncentracijami metformina do 5 v primerjavi s kontrolo medija celične kulture (slika 3A). Mitohondrijska aktivnost in nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) sta pomembni za celično diferenciacijo, med adipogeno diferenciacijo pa so opazili povečane ravni mitohondrijske presnove in nastajanja ROS [32]. Iz naših rezultatov smo ugotovili, da zdravljenje z metforminom zmanjša adipogeno diferenciacijo ASC. Nato smo raziskali učinke na mitohondrijsko aktivnost in proizvodnjo ROS. ASC so obdelali z metforminom in obarvali s TMRM za oceno aktivnosti mitohondrijske membrane in z DCF2DA za oceno koncentracije ROS. Slike s fluorescenčnim mikroskopom in kvantifikacija fluorescentnega signala so razkrile, da zdravljenje z metforminom bistveno zmanjša mitohondrijsko aktivnost (slika 3B, C) in proizvodnjo ROS (slika 3D, E). Ugotavljamo, da z metforminom posredovano zmanjšanje mitohondrijske aktivnosti in proizvodnje ROS prispeva k povečanju stebla ASC.

Da bi razumeli morebitno signalno kaskado, ki je odgovorna za zmanjšano diferenciacijo adipocitov, proliferacijo in uravnavanje genov stebla v ASC po zdravljenju z metforminom, smo se osredotočili na signalne kaskade mTOR, avtofagije in zunajcelične signalno regulirane kinaze (ERK). Prejšnje študije so pokazale pomembno vlogo teh poti pri ohranjanju stebla v ASC [19, 33]. Signalizacija ERK in mTOR imata pomembno vlogo pri spodbujanju celične proliferacije in diferenciacije. Potem ko smo ASC obdelali z različnimi odmerki metformina, smo zbrali celične lizate in jih Western blotirali za LC3, fosforilirano-p70S6 kinazo, skupno p70S6 kinazo, fosforilirano-ERK42/44 in skupna protitelesa ERKp42/44. Beta-aktin je bil uporabljen kot gospodinjski gen. Western blot analiza je pokazala, da je zdravljenje z metforminom v primerjavi s kontrolnimi ASC znižalo ekspresijo fosforilirane p70S6K in fosforilirane ERK42/44 kinaze (slika 4A, B, D). Tako signalizacija ERK kot mTOR imata pomembno vlogo pri regulaciji poti avtofagije.bioflavonoidiRezultati Western blota so pokazali, da zdravljenje z metforminom poveča aktivnost avtofagije v ASC (slika 4A, C). Nadalje smo analizirali izražanje genov poti avtofagije po zdravljenju z metforminom na ravni mRNA z uporabo kvantitativnega PCR v realnem času. Z analizo qPCR smo opazili znatno povečanje genov poti avtofagije VMP1, P62, ATG5 in ATG7 po zdravljenju z metforminom (slika 4E), kar je skladno s povečanjem aktivnosti avtofagije, prikazano v naših rezultatih Western blota. V naših analizah so opazili tudi nepomembno povečanje izražanja ATG 9. Sklepamo, da zdravljenje z metforminom zmanjša aktivnost ERK in mTOR ter poveča avtofagijo v ASC kot možen osnovni mehanizem za zmanjšano proliferacijo in diferenciacijo ter povečano steblo.

Da bi poudarili neposredno vlogo signalizacije ERK in mTOR pri inhibiciji diferenciacije in povečanju stebla v ASC, ki jo povzroča zdravljenje z metforminom, smo ločeno inhibirali signalizacijo ERK in pot mTOR z uporabo zaviralca ERK U0126 oziroma rapamicina in analizirali učinke na ASC. diferenciacijo in steblo [19,33]. Dodatek zaviralca ERK U0126 med diferenciacijo adipocitov ASC je povzročil znatno zmanjšano diferenciacijo, kot so razkrile slike, obarvane z Bodipy, in kvantifikacija fluorescence (slika 5A, B). Kvantitativni rezultati PCR v realnem času kažejo povečano regulacijo genov stebla po specifični inhibiciji, ki jo posreduje inhibitor signaliziranja ERK (slika 5C) je dodatno podprlo našo ugotovitev, da znižanje poti ERK z zdravljenjem z metforminom prispeva k povečanju nerodnosti.

Nato smo uporabili rapamicin, dobro znani zaviralec poti mTOR, ki lahko aktivira avtofagijo, in ovrednotili učinke na adipogenezo in ekspresijo genov stebla [19]. Celične lizate ASC, obdelanih z rapamicinom, smo zbrali in testirali s fosforilirano kinazo p70S6, celotno kinazo p70S6 in protitelesi proti aktinu. Opazili smo, da je rapamicin znižal ekspresijo fosforilirane p70S6 kinaze (slika 6A). Za določitev funkcionalne vloge pri adipogeni diferenciaciji smo ASC obdelali z rapamicinom in inducirali z adipogenim medijem. Po 14 dneh smo celice obarvali z barvilom Bodipy, da bi ocenili adipogenezo. Opazili smo, da je zdravljenje z rapamicinom znatno zmanjšalo adipogeno diferenciacijo (slika 6B, C). Nato smo analizirali učinek blokiranja prenosa signala mTOR na steblo ASC. V ta namen so ASC zdravili z rapamicinom, PCR v realnem času pa je bil uporabljen za merjenje izražanja transkriptov, povezanih s steblom. Opazili smo, da je rapamicin znatno povečal izražanje markerjev, povezanih s steblom (slika 6D). Sklepamo, da inhibicija obeh poti ERK in mTOR prispeva k zmanjšanju diferenciacije adipocitov in povečanju stebla v človeških ASC.

Nato smo preizkusili, ali lahko reproduciramo učinke zdravljenja z metforminom, ki povečujejo steblo, na 2D kultiviranih ASC v bolj zapletenem in in vivo prevedljivem modelu kulture celega maščobnega tkiva. Za to smo spremenili protokol kulture maščobnega tkiva, ki so ga objavili Harms et al.30], z uporabo celičnih cedil namesto vložkov transwell, da ostanejo fragmenti maščobnega tkiva potopljeni v medij (slika 7A). Po 5-dnevnem gojenju 3-5 mm fragmentov človeškega maščobnega tkiva z ali brez metformina smo izolirali stromalno vaskularno frakcijo (SVF) s kolagenazno razgradnjo fragmentov maščobnega tkiva in analizirali izražanje genov, povezanih s steblom. Podatki PCR v realnem času so pokazali, da je SVF iz maščobnega tkiva, zdravljenega z metforminom, pokazal znatno povečanje izražanja označevalcev izvornosti, kot so BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR in Wnt2 (slika 7B). ).

4. Razprava

Maščobne matične celice (ASC) regenerirajo maščobno tkivo s samoobnavljanjem in diferenciacijo ter tako ohranjajo izvorne celice tkiva. Vendar sta staranje in debelost povezana z izgubo lastnosti stebla v ASC. Metformin je antidiabetik in je pokazal obetavne rezultate kot sredstvo proti staranju. Osredotočili smo se na analizo učinka metformina na izvornost ASC in razumevanje osnovnega mehanizma, s ciljem vzpostaviti metformin kot potencialno sredstvo za ohranjanje izvornosti ASC s starostjo. Za lažji prevod naših rezultatov na ljudi smo uporabili 2D model celične kulture človeških ASC in uporabili metodo kulture človeškega maščobnega tkiva za simulacijo kompleksnejšega tkivnega okolja. Kot vir tkiva za naše raziskave smo uporabili podkožno maščobno tkivo. Z uporabo teh raznolikih metod celične in tkivne kulture smo proučevali učinek zdravljenja z metforminom na izvor ASC.

Debelost povzroči spremembo kinetike diferenciacije ASC, kar zmanjša nabor matičnih celic. Naši rezultati kažejo, da je v primerjavi z nezdravljenimi ASC zdravljenje z metforminom zmanjšalo stopnjo adipogeneze na način, ki je odvisen od odmerka. To opažanje je skladno s prejšnjimi poročili, ki so pokazala, da metformin zavira adipogenezo v matičnih celicah maščobnega tkiva, stromalnih celicah kostnega mozga, izvornih celicah periodontalnega ligamenta in celičnih linijah 3T3 [34-37]. Stopnja proliferacije matičnih celic ima pomembno vlogo pri ohranjanju nabora izvornih celic, izvornosti in sposobnosti samoobnavljanja. Opazili smo, da je metformin zaviral proliferacijo ASC, ne da bi povzročil kakršen koli citotoksični učinek na ASC, kar se ujema z drugimi študijami, objavljenimi o izvornih celicah mišjega maščobnega tkiva [28], stromalnih celicah in fibroblastih [38,39].kupi cistancheNedavna študija, v kateri so uporabili konjske matične celice iz maščobne kisline, je pokazala proliferativni učinek metformina [27]. Najverjetnejša razlaga za ta protislovna opažanja je razlika v vrstah darovalcev in anatomskem mestu nabiranja celic, saj so bile konjske ASC pobrane iz repa. Agnieszka Smieszek idr. opazili, da metformin zavira celično proliferacijo in pospešuje celično smrt z naraščajočimi odmerki (5 in 10 mM) v stromalnih celicah mišjega kostnega mozga in celični liniji embrionalnih fibroblastov Balb/3T3 [40]. Poleg tega metformin zavira proliferacijo satelitskih celic, izoliranih iz mišjih mišic |41. V podporo našemu opazovanju Min-lung Park et al. poročali, da metformin izboljša protivnetno lastnost človeških ASC z znižanjem ravni izražanja IL-1, IL-6 in TGF-; metformin tudi poveča preživetje presajenih ASC in ščiti pred apoptotično celično smrtjo [42]. Ti rezultati kažejo na različne učinke zdravljenja z metforminom na sposobnost preživetja celic, pridobljenih iz različnih vrst, in da so človeške ASC odporne na možne citotoksične učinke zdravljenja z metforminom.

Diferenciacija ASC v adipocite je povezana z višjimi potrebami po energiji in presnovnimi stopnjami, kar ima za posledico večjo mitohondrijsko aktivnost in proizvodnjo ROS. ROS ima ključno vlogo pri ohranjanju mirujočega stanja in izvornih celic v odraslih matičnih celicah, saj višje ravni ROS potiskajo celice k diferenciaciji in končno staranju matičnih celic in celični smrti [43]. Opazili smo, da metformin pomembno zmanjša potencial mitohondrijske membrane in nastajanje reaktivnih kisikovih vrst. V skladu z našimi podatki so prejšnje študije tudi poročale, da metformin zmanjša oksidativni stres in izboljša izražanje antioksidantov v fibroblastih mišjih zarodkov [44], mišjih ASC [38] in endotelijskih celicah človeške aorte [45]. Poleg tega so v skladu z našo študijo Chien-Hung Lin et al poročali, da metformin deluje kot nevroprotektivno sredstvo z zmanjšanjem oksidativnega stresa v človeških živčnih matičnih celicah [46]. Več drugih študij potrjuje, da metformin deluje kot antioksidant z zmanjšanjem oksidativnega stresa in povečanjem ekspresije antioksidativnih encimov, kot je superoksid dismutaza v mišjih ASC, mišjih mioblastih C2C12 in krožečih človeških endotelijskih matičnih celicah [38,47,48]. Poleg tega je študija Alejandra Martin-Montalva et al. podpira naše opažanje in dokazuje, da metformin pomembno zavira mitohondrijski kompleks in zavira mitohondrijsko dihanje pri miših [49]. Učinki metformina na zmanjšano nastajanje reaktivnih kisikovih vrst so verjetno posredovani s povečanjem reduciranega glutationa [50] v mehanizmu, ki vključuje redoks- občutljiv transkripcijski faktor Nrf2 [51].

Dokazano je, da metformin spodbuja stanje mirovanja satelitskih celic z znižanjem metabolizma, potrebnega za proliferacijo in diferenciacijo. Različne študije tudi potrjujejo, da metformin močno spodbuja zarodnost in pomlajevanje izvornih celic [23,39,41,49,52,53]. Znano je tudi, da znatno izboljša in uravnava ravni izražanja markerjev izvornih celic. Ker smo opazili, da metformin zavira proliferacijo in adipogenezo z zaviranjem oksidativnega stresa in mitohondrijske aktivnosti, smo skušali potrditi, ali metformin izboljša steblo v ASC ali v in vitro modelu kulture maščobnega tkiva. V skladu s tem smo opazili, da je metformin znatno izboljšal ekspresijo markerjev, povezanih s steblom, DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 in Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 in Mycl v 2D ASCkulturi in modelih kulture maščobnega tkiva . Uporaba kulture celotnega maščobnega tkiva ponuja edinstveno priložnost za simulacijo mikrookolja človeškega tkiva in vivo, kjer so celice usmerjene kot v svoji naravni arhitekturi in imajo interaktivno podporo različnih tipov celic, vtkanih v tkivni matriks. Kolikor nam je znano, naša študija prvič dokazuje učinek zdravljenja z metforminom na povečanje stebla na človeških ASC, tako v 2D kot v celih kulturah maščobnega tkiva. Menimo, da naši rezultati, ki kažejo povečano regulacijo podpisa genov stebla v ASC, izoliranih iz fragmentov maščobnega tkiva, zdravljenih z metforminom, zagovarjajo nadaljnje preiskave uporabe metformina kot terapije za upočasnitev procesa staranja in pomlajevanje staranega maščobnega tkiva.

Mehanska tarča rapamicina (mTOR) ima ključno vlogo pri proliferaciji in diferenciaciji izvornih celic. Znižanje aktivnosti mTOR z genetsko manipulacijo, terapevtskim posegom ali spremembami, povezanimi z življenjskim slogom, poveča moč in dolgoživost [19, 20]. Ker smo opazili, da metformin zavira adipogenezo, smo testirali učinek metformina na signalizacijo mTOR. Zanimivo je, da so rezultati pokazali, da metformin občutno zniža nivoje fosforilacije kinaze PS70S6, ki je ključna signalna molekula za mTOR in poročevalec aktivnosti poti mTOR. Prejšnje študije tudi kažejo, da metformin zavira adipogenezo z zaviranjem signalne poti mTOR v mišjih embrionalnih fibroblastih (MEF), mišjih mezenhimskih matičnih celicah C3H10T1/2 in preadipocitih 3T3-L1 [34]. Mehanska tarča rapamicina je sestavljena iz dveh kompleksov, mTORCl in mTORC2, signalizacija pa ima pomembno vlogo pri adipogenezi. Pokazalo se je, da zaviranje signalizacije mTORC1 z rapamicinom poslabša adipogenezo z zmanjšanjem fosforilacije PS6kinaze v preadipocitih 3T3-L1. Te študije so tudi pokazale, da inhibicija signalizacije mTOR zavira adipogenezo z znižanjem ravni izražanja markerjev adipocitne linije, kot so PPARgama, CEBPI, CEBP1 in adiponektin [54-56]. Poleg tega je signalizacija mTOR posredovana s fosforilacijo S6 kinaze. Izkazalo se je, da je uničenje S6 kinaze odporno na debelost in povečanje telesne mase med dieto z visoko vsebnostjo maščob zaradi poslabšanja adipogeneze [57]. Potrdili smo naše opažanje znižanja regulacije aktivnosti mTOR, posredovanega z metforminom, kot možnega posrednika povečanja stebla in zmanjšane diferenciacije ASC z uporabo rapamicina, ki specifično blokira aktivnost poti m TOR.

Poleg mTOR ima signalna pot ERK ključno vlogo pri proliferaciji in adipogenezi. Xiaomin Ning et al. v svoji publikaciji trdijo, da se adipogeneza aktivira s signalizacijo ERK [58]. Ker smo opazili, da metformin zavira adipogenezo in proliferacijo, smo se odločili raziskati učinek metformina na signalizacijo ERK. V skladu s prejšnjimi poročili so naši rezultati tudi pokazali, da bi metformin lahko zaviral adipogenezo prek zaviranja signalizacije ERK s povečanjem izražanja genov, povezanih s steblom. Signalizacija mTOR je potrebna za celično proliferacijo in diferenciacijo in je negativni regulator avtofagije [{{2 }}]. Vendar je izguba avtofagije povezana z izgubo stebla, čeprav je zdravljenje z metforminom izboljšalo izražanje genov, povezanih s steblom, z aktivacijo izražanja markerjev, povezanih z avtofagijo, kot je LC3Il. Tako naši rezultati kažejo, da metformin poslabša adipogenezo z izboljšanjem stebla v modelih kulture človeškega ASC ali človeškega maščobnega tkiva z aktiviranjem avtofagije in zaviranjem signalnih poti mTOR. Prihodnje študije in vivo na živalih in ljudeh, osredotočene na oceno učinkov metformina na biologijo ASC, bodo usmerjale prilagoditev uporabe metformina kot sredstva proti staranju matičnih celic.

Ta članek je izvleček iz Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines