Dolga nekodirajoča RNA KCNQ1OT1 uravnava protein kinazo CK2 prek MiR-760 pri staranju in omejevanju kalorij Ⅱ

3. Razprava

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 nukleotidov) in manjše miR.NA (21-25 nukleotidov) [1-3]. KCNO10T1 je bil sprva identificiran kot lncRNA, ki utiša več genov znotraj lokusa kcng1 z vzpostavitvijo strukture kromatina višjega reda (4 61). Pred kratkim so drugibiološke funkcije KCNO1OT1so poročali, vključno s tistimi, ki so povezani zfibroza,cerebralna ishemija,možganska kap ateroskleroza, onkogeneza, osteogena diferenciacija, celjenje zloma, inhipertrofija srca(7-13). Vendar podrobni mehanizmi, s katerimi KCNO10T1 uravnava celično staranje in CR, še vedno niso znani. Zato smo poskušali razjasniti, ali je bil KCNO10T1 vpleten v staranje in CR. Ta študija kaže, da je knockdown KCNO10T1 povzročil več markerjev celičnega staranja, vključno z indukcijo aktivnosti SA--gal, aktivacijo poti53-21Cip1/WAF1, povečano trimetilacijo H3K9, potrebno za tvorbo SAHF in faktor SASP (L{{ 13}}, IL-6 in MMP3) v človeških rakavih celicah HCT116 in MCF-7 (sliki 1 in 2A). Ker je oksidativni stres pomemben vzrok staranja (14,15), je bil raziskan učinek KCNO10T1 na nastajanje ROS. Kot je bilo pričakovano, je knockdown KCNO1OT povečal znotrajcelični ROS v celicah HCT116 in MCF-7 (slika 2B). Poleg tega je raven KCNO10T1 mRNA je bila zmanjšana v starajočih se celicah, ki jih povzroča LPS, ektopična ekspresija KCNQ10T1 pa je zavrla ekspresijo faktorja SASP, posredovano z LPS, v teh rakavih celicah (slika 3A, B). Poleg tega je knockdown KCNO10T1 povzročil aktivnost SA-B-gal v IMR človeških pljučnih fibroblastov{ {39}} celic, izražanje KCNO10T1 pa se je zmanjšalo med replikativnim staranjem v celicah IMR-90 (slika 6). Ti rezultati skupaj kažejo, da KCNO10T1 deluje kotreagent proti staranjuinantioksidantv človeških rakavih celicah, oprijetih na fibroblaste.

Cistanche Benefits in depression

Kliknite tukaj, če želite izvedeti več o dodatkih Cistanche za preprečevanje staranja

Prej je bilo dokazano, da knockdown Ck2 inducira markerje staranja, kot je barvanje s SA-gal [16], aktivacija poti p53-p21Cip1/WAF1 (generacija 171ROS [tvorba 18SAHF (19l in ekspresija faktorja SASP 20). Zato preučeno je bilo razmerje med KCNO10T1 in CK2. Ta študija kaže, da je prekomerna ekspresija CK2x razveljavila te označevalce staranja, ki jih je povzročil knockdown KCNO10T1 (slike 1, 2 in 6B) Poleg tega je knockdown KCNO10T1 zmanjšal ravni beljakovin in mRNA CK2x (slike 1B, 2A in 4B ) in prekomerna ekspresija KCNO10T1 (36, 181-37, 140) je stimulirala raven mRNA CK2x (slika 4A), kar kaže, da KCNQ1OT1 deluje kot pozitivni regulator CK2a v celicah. Nedavne študije so pokazale, da lahko lncRNA spužvajo miRNA in zavirajo izražanje ciljne mRNA (1-3]. Ker so prejšnje študije pokazale, da miR-760 sodeluje s CK2a (21,22] in KCNO10T1 [27], signalno mrežo KCNO10T1, CK2x in miR{{ Ta študija je pokazala, da je dodatno zdravljenje z miR-760 mimiki zavrlo regulacijo CK2x, posredovano s KCNQ10T1-, dodatno zdravljenje z zaviralcem miR-760 pa je zavrlo CK2, posredovano s knockdownom KCNO10T1. znižanje regulacije (slika 4). Dosledno je zdravljenje z LPS, ki je zmanjšalo izražanje KCNO10T1, povečalo raven miR-760 (slika 3C). Zato te študije kažejo, da lahko količina RNA KCNQ1OT1 titrira miR-760 in s tem uravnava razpoložljivost miR-760 za vezavo na mRNA CK2x. KCNO1OT1 in CK2a se lahko preslušata zaradi sposobnosti njunega transkripta, da tekmujeta za vezavo miR-760.

KSL01

Ker CR zagotavljaučinek proti staranju(23] je bilo preučeno, kako CR uravnava KCNQ1OT1 in miR-760. Ta študija kaže, da je stanje CR povečalo izražanje KCNO10T1 in CK2x ter znižalo raven miR-760 (slika 5A,B). Poleg tega , zdravljenje z miR-760, ki posnema, je zavrlo regulacijo CK2x, ki jo povzroči CR (slika 5C). Dosledno je knockdown KCNO10T1 zvišal ravni miR-760, medtem ko so dodatni pogoji zavrli miR, ki ga povzroči KCNQ10T1{{19} } indukcijo (slika 5D). Končno je pogoj CR rešil zmanjšano izražanje KCNO1OT1 in CK2a, posredovano z replikativnim staranjem (slika 6C). Skupaj so ti rezultati razkrili, da je pogoj CR znižal miR-760 prek regulacije KCNO10T1, kar ima za posledico povečano regulacijo CK2x v človeških celicah. Čeprav lncRNA SNHG6 deluje kot goba miR-760 v celicah CRC [25], CR ni spremenil ekspresije SNHG6 v eksperimentalnih pogojih (podatki niso prikazani). Kako CR poveča regulacijo KCNQ1OT1 Druge skupine so že dokazale, da transkripcijska faktorja NFY in -katenin uravnavata KCNO10T1 (28, 29). Vendar CR ni mogel regulirati ekspresije NF-Y in B-katenina vsaj v eksperimentalnih pogojih (podatki niso prikazani). Zato so potrebne dodatne študije za identifikacijo specifičnega zgornjega regulatorja KCNO10T1 v pogojih CR.

Na koncu je bil na podlagi rezultatov te študije predlagan model za vlogo KCNQ1OT1 pri staranju in CR. KCNQ1OT1 uravnava CK2 tako, da nabira miR-760. Pot KCNQ1OT1–miR-760–CK2 je vključena v staranje in CR. Zdravljenje z LPS in delitev celic v fibroblastih povzročita staranje z znižanjem regulacije KCNQ1OT1. CR zavira staranje z aktiviranjem poti KCNQ1OT1–miR-760–CK2 (slika 6D). Zato ta študija predlaga KCNQ1OT1 kot novo terapevtsko tarčo pri staranju in s starostjo povezanih boleznih, pa tudi kot alternativno zdravljenje, ki posnema učinke CR.

4. Materiali in metode

4.1. Materiali

Protitelesaproti CK2 (#sc-373894), p53 (#sc-71820), p21Cip1/WAF1 (#sc-6246) in -aktin (#sc-47778) so bili pridobljeni iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA). Protitelesa, specifična za histon H3- (#ab1791) in trimetilacijo histona H3 Lys9 (H3K9me3) (#ab8898), so bila kupljena pri Abcam (Cambridge, Anglija). Protitelesa, specifična za acetilacijo H3 Lys9 (H3K9Ac) (#06-942), 5-bromo-4-kloro-3-indolil- -D-galaktozid in LPS so bila pridobljena iz Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA). CM-H2DCFDA je bil pridobljen pri Invitrogenu (Carlsbad, CA, ZDA).

4.2. Celična kultura in CR

Celice IMR-90 človeških diploidnih fibroblastov so bile pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC, Manassas, VA, ZDA) na ravni podvojitve populacije (PDL) 24. Celice MCF-7 raka dojke pri človeku, celice raka debelega črevesa HCT116 (ATCC) in celice IMR-90 so bile gojene v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju, ki je vseboval 10 odstotkov (v/v) fetalnega govejega seruma in 1 odstotek (v/v) penicilin-streptomicina, v vlažnem ozračju 95 odstotkov (v/v) zraka in 5 odstotkov (v/v) CO2 pri 37 ◦C. PDL celic IMR-90 je bil izračunan z uporabo formule PD=log(Nf/Ni)/log2, kjer je Nf končno število celic, Ni pa začetno število zasejanih celic. Za celično stradanje (omejitev kalorij) smo celice s fosfatnim pufrom dvakrat sprali in gojili v Earlovi uravnoteženi raztopini soli (Thermo Fisher, Waltham, MA, ZDA) s 5,5 mM glukoze, brez aminokislin, sedem ur.

KSL16

4.3. Ekstrakcija RNA in kvantitativna PCR miRNA v realnem času

RNA je bila ekstrahirana iz celic z uporabo TRIzol reagenta (Invitrogen). Kvantitativni PCR miRNA v realnem času (qPCR) je bil izveden z uporabo kompleta za reverzno transkripcijo miRNA TaqMan in s testom miRNA s sistemom ABI PRISM 7000 HT (Applied Biosystems, CA, ZDA), po navodilih proizvajalca. Majhna nukleolarna RNA U48 (RNU48) je bila izbrana kot referenčni gen za gospodinjsko majhno RNA. PCR v realnem času smo izvedli v treh izvodih iz treh različnih vzorcev cDNA.

4.4. Transfekcija DNK in interferenca RNK

Za generiranje pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181–37.140) je bil fragment nukleotidov od 36.181 do 37.140 KCNQ1OT1 kemično sintetiziran in ligiran v mesto BamHI/NotI vektorja pcDNA3.1 (Invitrogen). Celice smo transficirali s pcDNA3.1-HA-CK2 in pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181– 37.140) z uporabo Polyfect (Qiagen, Hilden, Nemčija) v skladu z navodili proizvajalca. Mimike za miR-760 in kontrolno miRNA so bile kupljene pri Genolution, Inc. (Seul, Koreja). Protismiselni inhibitor za miR-760 je bil pridobljen pri Panagene, Inc. (Seul, Koreja). Zaporedje siRNA za CK2 je bilo 50 -GAUGACUACCAGCUGGUUCdTdT-30. Zaporedje siRNA za KCNQ1OT1 je bilo 50 –GCCAAUGGAUAGAGAGCAAdTdT-30. Zaporedje siRNA za negativno kontrolo je bilo 50 -GCUCAGAUCAAUACGGAGAdTdT-30. RNA smo transficirali v celice z uporabo Lipofectamine (Invitrogen) 48 ur.

4.5. SA- -gal Test aktivnosti

Celice v subkonfluentnih kulturah smo sprali z ledeno mrzlo fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS), fiksirali s 3 odstotki (v/v) formaldehida v PBS 10 minut pri sobni temperaturi in nato inkubirali z obarvanjem raztopina, ki vsebuje 1 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-D galaktozida, 40 mM citronske kisline-natrijevega fosfata (pH 6,0), 5 mM kalijevega fericianida, 5 mM kalijevega ferocianida, 150 mM NaCl in 2 mM MgCl2 24 ur pri 37 ◦C. Modro obarvane celice so bile preštete v vsaj desetih poljih pri 400-kratni povečavi in izražene kot odstotek pozitivnih celic.

4.6. Merjenje znotrajceličnih ravni ROS

Za ovrednotenje ravni ROS je bila uporabljena na oksidacijo občutljiva flfluorescentna sonda CM-H2DCFDA. Celice smo obdelali s 5 µM CM-H2DCFDA 20 minut pri 37 °C v temi,ločimo s tripsinizacijo in nato speremo s PBS. Intenzivnost fluorescence je bila deterizkopano z uporabo Coulter Elite ESP Cell Sorter (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, ZDA). Thevrata za razprševanje naprej in stran so bila nastavljena tako, da so iz analize izključene vse mrtve celice; vsaj10,000 dogodkov znotraj vrat je bilo pridobljenih na vzorec.

KSL13

4.7. Reverzna transkripcija (RT)-PCR

Celotno RNK smo ekstrahirali iz celic. RNA je bila reverzno prepisana z uporabo gensko specifičnih primerjev in reverzne transkriptaze (Takara Bio Inc., Japonska) in nastala cDNA je bila pomnožena s PCR. Primerji, uporabljeni za teste, so navedeni v dodatni tabeli S2. Produkte PCR smo ločili na 1,5-odstotnem agaroznem gelu. Kvantifikacija pasov reverzne transkripcije-PCR je bila izvedena z uporabo denzitometrije. - Ravni aktinske RNA so bile uporabljene za standardizacijo količine RNA v vsakem vzorcu.

4.8. Imunobloting

Proteine smo ločili na 10 odstotnih poliakrilamidnih gelih v prisotnosti SDS in nato prenesli na nitrocelulozne membrane. Membrane so bile blokirane s 5 odstotki (m/v) nemastnega, posušenega posnetega mleka v TBST (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl in 0,05 odstotka Tween 20) za 2 uri. in nato 1 uro inkubirali s specifičnimi protitelesi v 1 odstotku (m/v) nemastnem posušenem posnetem mleku. Membrane so bile trikrat sprane s TBST in nato obdelane s sistemom ECL za razvoj signalov (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Ko je bilo potrebno, smo membrane odstranili s pufrom za odstranjevanje (2-odstotni SDS, 100 mM -merkaptoetanol in 50 mM Tris-HCl (pH 7,0)) pri 50 °C 1 uro z nežnim stresanjem in nato ponovno testirali z anti{{ 25}}aktinsko protitelo kot notranji nadzor obremenitve.

4.9. Statistična analiza

Enosmerna analiza testiranja variance podatkov je bila izvedena s paketnim programom SPSS (IBM, Armonk, NY, ZDA). Rezultati so veljali za pomembne, če je bila p-vrednost<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05.

Dodatna gradiva: Naslednje podporne informacije lahko prenesete na:

Prispevki avtorja: Y.-SB je zasnoval in oblikoval poskuse, YL je izvedel poskuse, Y.-SB pa je napisal prispevek. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje: To raziskavo je podprl Program za temeljne znanstvene raziskave prek Nacionalne raziskovalne fundacije Koreje (NRF), ki jo financira Ministrstvo za znanost, IKT in načrtovanje prihodnosti (NRF-2019R1A2C1005219).

Izjava institucionalnega nadzornega odbora: Ni primerno.

Izjava o informiranem soglasju: Ni primerno.

Izjava o razpoložljivosti podatkov: Ni uporabno.

Nasprotje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Reference

1. Ulitsky, I.; Bartel, DP lincRNA: genomika, evolucija in mehanizmi. Celica 2013, 154, 26–46. [CrossRef] [PubMed]

2. Esteller, M. Nekodirajoče RNA pri človeških boleznih. Nat. Rev. Genet. 2011, 12, 861–874. [CrossRef] [PubMed]

3. Quinn, JJ; Chang, HY Edinstvene lastnosti biogeneze in delovanja dolge nekodirajoče RNA. Nat. Rev. Genet. 2016, 17, 47–62. [CrossRef] [PubMed]

4. Mancini-Dinardo, D.; Steele, SJ; Levorse, JM; Ingram, RS; Tilghman, SM Podaljšanje transkripta Kcnq1ot1 je potrebno za genomski vtis sosednjih genov. Genes Dev. 2006, 20, 1268–1282. [CrossRef] [PubMed]

5. Pandey, RR; Mondal, T.; Mohammad, F.; Enroth, S.; Redrup, L.; Komorowski, J.; Nagano, T.; Mancini-Dinardo, D.; Kanduri, C. Kcnq1ot1 protismiselna nekodirajoča RNA posreduje za linijo specifično transkripcijsko utišanje z regulacijo na ravni kromatina. Mol. Celica 2008, 32, 232–246. [CrossRef]

6. Kanduri, C. Kcnq1ot1: Regulativna RNA za kromatin. Semin. Celica. Dev. Biol. 2011, 22, 343–350. [CrossRef]

7. Yang, F.; Qin, Y.; Lv, J.; Wang, Y.; Che, H.; Chen, X.; Jiang, Y.; Li, A.; Sonce, X.; Yue, E.; et al. Utišanje dolge nekodirajoče RNA Kcnq1ot1 ublaži piroptozo in fibrozo pri diabetični kardiomiopatiji. Cell Death Dis. 2018, 9, 1000. [CrossRef]

8. Ju, S.; Yu, M.; On, X.; Wen, L.; Bu, Z.; Feng, J. KCNQ1OT1 spodbuja avtofagijo z uravnavanjem poti miR-200a/FOXO3/ATG7 pri cerebralni ishemični kapi. Celica staranja 2019, 18, e12940. [CrossRef]

9. Yu, XH; Deng, WY; Chen, JJ; Xu, XD; Liu, XX; Chen, L.; Shi, MW; Liu, QX; Tao, M.; Ren, K. LncRNA kcnq1ot1 spodbuja kopičenje lipidov in pospešuje aterosklerozo z delovanjem kot ceRNA skozi os miR-452-3p/HDAC3/ABCA1. Cell Death Dis. 2020, 11, 1043. [CrossRef]

10. Cagle, P.; Qi, Q.; Niture, S.; Kumar, D. KCNQ1OT1: Onkogena dolga nekodirajoča RNA. Biomolekule 2021,

11, 1602. [CrossRef] 11. Wang, JL; Wei, X.; Wang, AG; Bai, Y.; Wu, XJ KCNQ1OT1 uravnava osteogeno diferenciacijo hBMSC po osi miR-320a/Smad5. EUR. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2020, 24, 2843–2854. [PubMed]

12. Chen, L.; Xiong, Y.; Yan, C.; Zhou, W.; Endo, Y.; Xue, H.; Hu, Y.; Hu, L.; Leng, X.; Liu, J.; et al. LncRNA KCNQ1OT1 pospešuje celjenje zlomov prek modulacije osi miR-701-3p/FGFR3. FASEB J. 2020, 34, 5208–5222. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Y.; Zhang, Z.; Zhu, D.; Zhao, W.; Li, F. Knockdown KCNQ1OT1 zmanjša srčno hipertrofijo z modulacijo osi miR-2054/AKT3. J. Thorac. Dis. 2020, 12, 4771–4780. [CrossRef] [PubMed]

14. Childs, BG; Durik, M.; Baker, DJ; van Deursen, JM Celično staranje pri staranju in s starostjo povezanih boleznih: Od mehanizmov do terapije. Nat. Med. 2015, 21, 1424–1435. [CrossRef]

15. McHugh, D.; Gil, J. Staranje in staranje: vzroki, posledice in terapevtske poti. J. Cell Biol. 2018, 217, 65–77. [CrossRef]

16. Ryu, JZ; Woo, JH; Kim, YH; Lee, YS; Park, JW; Bae, YS Znižana regulacija protein kinaze CKII je povezana s celičnim staranjem. FEBS Lett. 2006, 580, 988–994. [CrossRef]

Vprašaj za več:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950

Zaščitni učinki Cistanche proti razgradnji kolagena dermalnih fibroblastov, ki jo povzroči H2O2/UVB, preko Hsa-microRNA-4535-posredovanega TGF/Smad signaliziranja Ⅱ

Zaščitni učinki Cistanche proti razgradnji kolagena dermalnih fibroblastov, ki jo povzroči H2O2/UVB, preko Hsa-microRNA-4535-posredovanega signala TGF/Smad