Zaščitni učinki Cistanche proti razgradnji kolagena dermalnih fibroblastov, ki jo povzroči H2O2/UVB, preko Hsa-microRNA-4535-posredovanega TGF/Smad signaliziranja Ⅱ

DISKUSIJA

V tej študiji smo ugotovili, dazaščitna vloga cistanheposreduje z atenuacijo hsa-miR- 4535, ki cilja na Smad4, s čimer uravnava signalizacijo Smad2/3/4 in sintezo kolagena v koži, izpostavljeni H2O2/UVB povzročena dermalna poškodba in vitroinin vivo. Naše ugotovitve lahko povzamemo v šest glavnih točk: (1) cistanche atenuated H2O2-inducirano staranje celic HS68, vendar ne apoptoze pri odmerku 30 µM; (2) H2O2/induciran z UVBznotrajcelične in mitohondrijel Tvorba ROS in neravnovesje MMP sta bila obrnjena po temzdravljenje cistanche; (3) cistanche je bistveno izboljšal signalizacijo TGF/Smad kot tudi aktivacijo kompleksa Samd2/3/4 v H2O2- izpostavljene celice; (4) uravnavanje hsa-miR-4535 s H2O2/UVB je bil zatrtzdravljenje cistanche; (5) hsa-miR- 4535 sodeluje pri uravnavanju signalizacije TGF/Smad zciljanje Smad4 na oslabljeno sintezo kolagena pri H2O2/celice, izpostavljene UVB; (6)lokalna uporaba cistanchenahrbtna koža golamiši znatno zmanjšala UVB povzročenofotostaranje kože,nastanek gub, hiperplazija kože, in oslabitevsignalnih poti TGF/Smad.

Slika 10. Učinek cistanche na fotopoškodbo kože gole miši C57BL6/J, ki jo povzroči UVB. (A) Shematski postopek poskusov na živalih. Hrbtna koža štiri tedne starih golih miši C57BL6/J (n=6) ​​je bila izpostavljena sevanju UVB in zdravljena s cistanho enkrat na dva dni 8 tednov (B) Fotografija, ki prikazuje nastajanje gub na hrbtni koži golih miši zaradi izpostavljenosti UVB, čemur je sledila lokalna uporaba cistanche.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti, kako Cistanche Treatment For Reduce Skin Photodame

Slika 11. Lokalna uporaba cistanche ublaži UVB-induciranehiperplazija kožein razgradnjo kolagena v hrbtni koži golih miši C57BL6/J. Kožna tkiva so bila serijsko razrezana in obarvana s H&E, Massonovim trikromom in imunohistokemično za p-Smad2/3 Smad4 in -gal. H&E barvanje je pokazalo debelino povrhnjice. Dvokrake rdeče puščice označujejo odebelitev povrhnjice. Massonovo trikromno barvanje je pokazalo vsebnost kolagenskih vlaken v dermalnih plasteh. Kolagenska vlakna so videti modra. LD, nizek odmerek; HD, visok odmerek.

cistanchedomnevno je imel anti-apoptotične in antioksidativne lastnosti v različnih celicah, kot so keratinociti in kardiomiociti [13, 39, 40]. Peroralna uporaba cistanche je učinkovito zavirala s streptozotocinom povzročeno poškodbo jeter pri diabetičnih podganah z zmanjšanjem oksidativne poškodbe mitohondrijev in izboljšanjem signalizacije antioksidantov Nrf2 [13, 41]. Druge študije so pokazale, da je cistanche izboljšal hepatotoksičnost, ki jo povzroča ciklofosfamid, in nefrotoksičnost, ki jo povzroča cisplatin, z zmanjšanjem oksidativnega stresa in vnetja [42, 43]. Izpostavljenost dermalnih fibroblastov UVB ali H2O2 povzroči kopičenje ROS v mitohondrijih, kar povzroči fragmentacijo mitohondrijev in staranje celic [44]. Prejšnja študija je pokazala, da fragmentirani mitohondriji poslabšajo proizvodnjo kolagena [45]. Naša študija je pokazala, da ima cistanche sposobnost čiščenja radikalov, da prepreči neuravnoteženost potenciala mitohondrijske membrane, ki jo povzroči ROS, in kopičenje ROS v celicah, ki jih povzroči UVB in H2O2-. (Slike 3A–3C). Nedavne študije so poročale, da so dermalni fibroblasti odgovorni za organizacijo okolja, bogatega z ECM,

Slika 12. Učinki cistanhe na signalizacijo TGF/Smad in izražanje hsa-miR-4535 pri miših, obsevanih z UVB. (A in B) ravni mRNA hsa-miR-4535 in Smad4 iz hrbtne kože miši, izpostavljenih UVB, so bile odkrite s qRT-PCR. (C) Raven beljakovin TGF, p-smad2/3 in Smad4 v hrbtnih kožnih tkivih je bila odkrita z Western blottingom. -tubulin je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD. Prikazana je kvantifikacija rezultatov; *P < 0.05, **P < 0.01 v primerjavi s kontrolno skupino vozila; #P < 0,05, ##P < 0,01 v primerjavi z UVB plus skupino vozil.

pretežno sestavljen iz kolagena tipa I in III [46]. Homeostaza kolagena tipa I in III je v bistvu odgovorna za vzdrževanje strukturne in mehanske podpore za kožo [47]. Pojavljajoči se dokazi kažejo, da med staranjem nastajajo obilne količine ROS, kar povzroči progresivno izgubo kolagenskih snopov v dermalnih plasteh in tako prispeva k nastanku gub zaradi oslabljene poti TGF/Smad in povečanega izražanja MMP [48, 49].ki jih posreduje cistancheaktivacija signalizacije TGF/Smad proizvaja kolagen, ki ohranja celovitost kože. V rakavih celicah pa ima drugačne učinke; pri raku jeter,cistanche-zdravljenjezaviral proliferacijo celic HepG2 z aktiviranjem signalizacije TGF/Smad [50]. V nasprotju s tem je cistanha zavirala signalizacijo TGF/Smad kot tudi inaktivirala Smad3, kar je povzročilo zaviranje rasti rakavih celic prostate in trebušne slinavke [51]. Vendar pa je vloga cistanche v signalizaciji TGF / Smad vkožni dermalni fibroblastiostal neznan. Tukaj smo opazili, da je cistanche povečal ekspresijo COL1A1 in COL3A1, ki je bila znižana v celicah, obdelanih s H2O2/UVB, z aktivacijo signalizacije TGF/Smad (slika 4A–4C, 8E, 9A). Poleg tega je bila indukcija MMP-1 s H2O2/UVB obrnjena po zdravljenju s cistančami (slika 4A, 9A). Naše ugotovitve kažejo, da cistanche ščiti dermalne fibroblaste pred poškodbami, ki jih povzroči H2O2/UVB, tako da aktivira signalizacijo TGF/Smad in inducira proizvodnjo kolagena.

Razvoj kolagena kožnega dermisaje zapleten fiziološki proces in dokazano je, da regulacija, posredovana z mikroRNA, prispeva k preoblikovanju in organizaciji ECM [23, 52, 53]. Kolagen, elastin in hialuronska kislina (HA) so tri glavne beljakovine, ki ohranjajo celovitost kože. Kopičenje dokazov kaže, da je več mikroRNA vključenih v dermalno staranje prek regulacije ECM. miR-181a je bila regulirana navzgor v starajočih se človeških dermalnih fibroblastih in je kolagenu XVI omogočila modulacijo komponent ECM [54]. Zanimivo je, da lahko visoka ekspresija miR-23a-3p inducira dermalno staranje z neposrednim zatiranjem hialuronan sintaze 2, enega od izoencimov transmembranske HA sintaze, ki sintetizira HA [21]. Nedavno so poročali o različnih naravnih spojinah, ki zmanjšujejo dermalno staranje kože z regulacijo mikroRNA [55–57]. Poleg tega naj bi bila cistanča vključena v regulacijo mikroRNA pri holangiokarcinomu in hepatocelularnem karcinomu ter povzročila zatiranje celične rasti in metastaz [58, 59]. Doslej nobena študija ni identificirala molekularnega mehanizma, kot je regulacija mikroRNA, vzdravljenih s cistankocelice dermalnih fibroblastov človeške kože. Tu smo analizirali profile nizov mikroRNA, da smo identificirali več mikroRNA, ki so se razlikovale med kontrolo in 30 µMzdravljenih s cistankoskupine (slika 5A). Z uporabo baz podatkov miRDB in TargetScanHuman smo predvideli Smad4 kot hsa-miR-4535tarča mRNA (slika 5B). Ekspresija hsa-miR-4535 je bila znižana po zdravljenju cistanhe v celicah, induciranih s H2O2/UVB (slika 6C, 9B). Nasprotno pa je bila ekspresija njegove tarče, mRNA-Smad4, znatno zavrta v celicah, izpostavljenih H2O2/UVB, in povečana po zdravljenju s cistanho (slika 6D, 9C). Različne študije so pokazale, da ROS deluje kot vmesni stimulacijski faktor transkripcije, ki ga povzroči stres, kot so p53, NF-κB in HIF [60]. Zato smo sklepali, da bi nekatere miRNA lahko modulirali z regulacijo teh transkripcijskih faktorjev. Z uporabo zbirke podatkov o mestih vezave transkripcijskega faktorja (PROMO) smo ugotovili, da obstaja en domnevni vezni element p53 na promotorju hsa-miR-4535. Naša prihodnja študija se bo osredotočila na regulacijo transkripcije p53 v promotorju hsa-miR-4535. Poleg tega razgradnje kolagena, ki jo povzroči H2O2-, ni bilo mogoče oslabiti v celicah s prekomerno izraženostjo hsa miR-4535 ali transfektiranih celicah s si-Smad4 niti po zdravljenju s cistanhami (slika 8C, 8E). Te ugotovitve dodatno potrjujejo vpletenost hsa-miR- 4535 pri uravnavanju sinteze kolagena z usmerjanjem na Smad4.

Slika 13. Shematski diagram za mehanizem delovanja cistanhe. cistanche izboljša poti sinteze kolagena TGF/Smad z zmanjšanjem has-microRNA-4535, ki jo povzroča H2O2-, da izboljša fotostaranje dermalnega fibroblasta človeške kože. Okrajšave: ECM: zunajcelični matriks; TGF : transformacijski gojeni faktor beta; T RI: TGF receptor tipa I; T RII: TGF receptor tipa II.

Na koncu so naše ugotovitve pokazale, da cistanche ščiti pred nastankom ROS, ki ga povzroči H2O2/UVB, neravnovesjem MMP, celičnim staranjem in razgradnjo kolagena v človeških dermalnih fibroblastih. Dermozaščitni učinki cistanche so bili povezani z inhibicijo hsa-miR-4535 in aktivacijo kompleksa Smad2/3/4 za izboljšanje sinteze kolagena. Aktivacijo kompleksa Smad2/3/4 je reguliral hsa-miR-4535 prek vezave na Smad4-3′-UTR. Zato lahko zaščitni mehanizem cistanhe pred dermalnimi poškodbami kože, ki jih povzroči H2O2/UVB, vključuje zaviranje sinteze Smad4/kolagena s hsa-miR- 4535

MATERIALI IN METODE

Celične kulture in zdravljenje

Človeški dermalni fibroblasti HS68 so bili pridobljeni iz Bioresource Collection and Research Center (BCRC, Hsinchu, Tajvan) in vzdrževani v Dulbeccovem modificiranem esencialnem mediju (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, ZDA), ki je vseboval 10 odstotkov fetalnega govejega seruma (Invitrogen, CA, ZDA). ), 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich, MO, ZDA), 100 U/mL penicilina (Sigma-Aldrich) in 100 ug/mL streptomicina (Sigma Aldrich) pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2. Za ovrednotenje učinka cistanche proti poškodbam celic, ki jih povzroča H2O2-, so bile celice HS68 1 uro obdelane z 200 μM H2O2 in nato 23 ur sočasno obdelane s cistanche (282200, Sigma-Aldrich). Celice smo sprali s PBS in dali v 1 ml svežega PBS pred izpostavitvijo UVB. Za obsevanje UVB so bile celice izpostavljene zamreževalcu (CX-2000, Upland, CA, ZDA) in žarnicam UVB pri intenzivnosti 40 mJ/cm2 in nato obdelane s cistančo.

MTT testi

Viabilnost celic HS68 po zdravljenju smo izmerili s testom MTT. Celice HS68 smo posejali v 96-plošče z vdolbinicami in obdelali z 200 μM H2O2 1 uro ali obsevali s 40 mJ/cm2 UVB in nato inkubirali z različnimi koncentracijami cistanche (10, 20, 30 μM) 23 ur. Po 24 urah smo gojišče nadomestili s 100 μL MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difenil tetrazolijev bromid) raztopino (0,5 mg/mL; 5 mg/mL osnovne raztopine v PBS smo razredčili z medijem kulture na 0,5 mg/mL) 4 ure pri 37 stopinjah. Nato smo vijolično obarvan formazan raztopili v 100 μL dimetil sulfoksida (DMSO) in izmerili optično gostoto pri 570 nm s spektrofotometrom (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA).

Prehodna transfekcija

Analiza mikromrež

Luciferazni reporterski test

Celice so bile sotransfektirane z divjim tipom in mutantnim luciferaznim Smad4-3′-UTR-WT oziroma reporterskim konstruktom Smad4-3′-UTR-MT in plazmidi luciferaze notranje kontrole. Po transfekcijah so bile aktivnosti luciferaze odkrite s sistemom Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Sunnyvale, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Plošče smo odčitali na Reporter Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, ZDA). Relativne aktivnosti luciferaze so bile normalizirane na aktivnost luciferaze Renilla.

Western blot analiza

Celice smo sprali z 1 × fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) in lizirali v pufru za lizo (50 mM Tris-baze (pH7,5), {{10}}.5 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1 mM -merkaptoetanol, 1 odstotek NP-40, 1 odstotek glicerola in koktajl tablete zaviralca proteaze (Roche Molecular Biochemicals, Zgornja Bavarska, Nemčija) 30 minut na ledu in nato centrifugirano pri 12,000 × g 10 minut pri 4 stopinjah. Supernatante smo zbrali v 1,5 ml mikrocentrifugirnih epruvetah. Koncentracijo beljakovin v teh supernatantih smo določili z metodo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). Vzorci ki vsebujejo enake količine beljakovin (20 ug), smo ločili s 6-odstotno –12-odstotno gradientno elektroforezo natrijevega dodecil sulfata in poliakrilamidnega gela (SDS-PAGE) in nato prenesli na membrane iz poliviniliden difluorida (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, ZDA). Membrane smo blokirali z uporabo blokirnega pufra (5 odstotkov nemastnega suhega mleka, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl in 0,1 odstotka Tween 20) 1 uro pri sobni temperaturi. Nato so membrane inkubirali s primarnimi protitelesi (1: 1,000 razredčitev) proti TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, ZDA), p-smad2/3 (sc- 11769, Santa Cruz), Smad4 (sc{{ 50}}, Santa Cruz),COL1A1 (sc-28657, Santa Cruz), COL3A1 (sc-271249,Santa Cruz), p16 (10883-1-AP, Proteintech), p21 (sc{ {60}}, Santa Cruz), MMP-1 (sc-1731, Santa Cruz), GAPDH (sc-32233, Santa Cruz) in Histon H1 (sc-10806 , Santa Cruz) čez noč pri 4 stopinjah. Nato so jih inkubirali z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (razredčitev 1:80, 000), protikunčjim (A0545), protimišjim (A9044) ali protikozjim (A5420) IgG (Santa Cruz Biotechnology) 1 uro pri RT. Imunoblote smo zaznali s substratom za izboljšano kemiluminiscenco (ECL) hrenovo peroksidazo (HRP) (Millipore) z uporabo ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK).

Ekstrakcija jedrnega proteina

Ekstrakcija RNA in qRT-PCR

Celotno RNK smo ekstrahirali s komercialnim kompletom Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research Corporation, CA, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca [65, 66]. miRNA so bile obratno prepisane v cDNA z uporabo kompleta za sintezo cDNA miRNA (Takara, Shiga, Japonska), kot je opisano prej [16, 67]. Ekspresija hsa-miR-4535 in Smad4 je bila odkrita s PCR v realnem času v sistemih LightCycler 96 (Roche, Basel, Švica) z uporabo standardnega protokola LightCycler 480 SYBR Green I Master. 10 μL PCR reakcija je vključevala 2 μL cDNA, 5 μL 2× SyberGreen PCR mešanice, 0,5 μL prednjega primerja (10 μM), 0,5 μL povratnega primerja (10 μM) in 2 μL ddH2O. Vse reakcije so bile izvedene v treh izvodih. Za detekcijo mRNA je bil določen cikel praga (Ct) za vsak gen in izražanje vsakega gena glede na izražanje GAPDH je bilo izračunano kot 2ΔCt, kjer je ΔCt=(Cttarget gen – CtGAPDH). Za odkrivanje miRNA je bil Ct določen za vsak gen in izražanje vsakega gena glede na izražanje U6 rRNA je bilo izračunano kot 2ΔCt, kjer je ΔCt=(Cthsa-miR-4535 – CtU6 rRNA). Prednji (F) in povratni (R) primerji, uporabljeni za odkrivanje izražanja miRNA in mRNA, so bili: hsa-miR-4535 (3′-CAGGG TCGGUCCA5′); človek-Smad4 (F'-TGACCCAAA CATCACCTTCA, R'- ATACGTGGACCCTTCTG GA); človeški-GAPDH (F'-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG, R'-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); miš-Smad4 (′′-GTGGAAGCCACAGGAATGTT, R′-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); mišji-GAPDH (F'-CCTT CCACAATGCCAAAGTT, R'-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).

Imunofluorescenčna analiza