Dejavnost antioksidativnih encimov, glutation peroksidaze, tiol peroksidaze in katalaze za razbarvanje melanina

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· Uk Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho min¹

Povzetek

Melanin je najpomembnejši dejavnik pri določanju barve kože. Veliko raziskovalnih prizadevanj se izvaja za razgradnjo že proizvedenih spojin melanina v koži za lepoto. Ta raziskava je preučevala učinke treh antioksidantnih encimov, glutation peroksidaze (GPX), tiol peroksidaze (TPX) in katalaze, v lizosomski frakciji na zmanjšanje barve melanina. Raztopino melanina smo obdelali z encimi in vodikovim peroksidom, nato pa smo reagirali 48 ur. GPX in TPX sta razbarvala melanin, med njima pa je bil GPX učinkovitejši, katalaza pa ni bila učinkovita. GPX je tudi zaviral nastajanje melanina v celicah melanoma B16F10. GPX, ki je prisoten v skoraj vseh mikroorganizmih, ima pomembno vlogo v celičnem obrambnem mehanizmu z reaktivnimi kisikovimi spojinami. Poleg tega ni bil citotoksičen, vendar je bil znatno učinkovit pri razbarvanju barve melanina. Zato je na biološkem in mikrobiološkem področju njegova možnost uporabe v kozmetiki za beljenje kože velika.

Ključne besede Melanin · Glutation peroksidaza (GPX) · Tiol peroksidaza (TPX) · Katalaza · B16F10 · Lizosom

Cistanche je sestavina za beljenje kože.

Uvod

Čist obraz je eden bistvenih elementov lepote sodobnega človeka, nad belo kožo so navdušeni predvsem Azijci. Melaninska spojina je najpomembnejši dejavnik pri določanju barve kože. Razlikuje se od evmelanina, ki ima črno ali rjavo barvo, in feomelanina, ki ima za posledico rožnat do rdeč odtenek [1]. Melaninska spojina se sintetizira z oksidacijo tirozina v celicah melanocitov, ki se nahajajo v bazalni plasti povrhnjice; in glavna vloga tega pigmenta v koži je zaščita dermisa z blokiranjem škodljivega ultravijoličnega sevanja [2, 3]. Če pa je v koži prisotnih preveč melaninskih spojin, koža postane temna in nečista ter lahko povzroči hiperpigmentacijo, kot je melazma [4].

Veliko študij je bilo povezanih s kozmetiko za nego kože, ki rešuje te težave, vendar ima večina trenutno razvite kozmetike za beljenje kože funkcijo zaviranja sinteze melanina prek več mehanizmov, kot je blokiranje oksidacije tirozina ali UV žarkov, ki lahko spodbujajo sinteza melanina [5]. Ti izdelki potrebujejo dolgo časa, da postanejo učinkoviti, in niso učinkoviti pri specifičnih simptomih, kot je hiperpigmentacija [6]. Trenutno je tipična že izdelana metoda odstranjevanja melanina lasersko zdravljenje [7]. Če se razvijejo materiali, ki lahko rešijo te težave brez takšnih postopkov, bodo imeli veliko uporabnost na biološkem in kozmetičnem področju.

V prejšnjih raziskavah smo poskušali najti način za razbarvanje že proizvedenih melaninskih spojin. Obstajajo poročila o raziskavah o korelaciji lizosomov in melanina. Zelo verjetno je, da diferencirani keratinociti še posebej razgradijo zunanje melanosome v skladu z vrsto osnovnih funkcij avtofagije, ki nadzorujejo količino celičnih organelov ali odstranijo okvarjene organele, kot je peroksisom [8]. Avtofagna pot, od citoplazme do lizosomov, igra pomembno vlogo pri razgradnji melanosomov v človeških epidermalkeratinocitih [9]. Ti podatki dokazujejo, da lizosomski specifični encimi prispevajo k razgradnji melanina. Prej smo odkrili aktivnost encima za zmanjšanje barve melanina v lizosomski frakciji, kompleksu, ki vsebuje hidrolizate za razgradnjo odpadnega materiala in celičnih ostankov v peroksisomih in lizosomih [10, 11]. Ta članek je preučeval učinke treh izbranih encimov, glutation peroksidaze, tiol peroksidaze in katalaze, v lizosomski frakciji za zmanjšanje barve melanina. Te peroksidaze se branijo pred poškodbami celic, ki jih povzročajo reaktivne kisikove vrste (ROS), in so prisotne v vseh evkariontih [12].

Reaktivne kisikove vrste (ROS) nastanejo kot naravni stranski produkt normalne presnove kisika v celicah in se lahko povečajo zaradi okoljskega stresa. Visoko ustvarjeni ROS lahko poškodujejo celice. Škodljivi učinki ROS na celico so naslednji [12, 13]: poškodbe DNK ali RNK, oksidacije polinenasičenih maščobnih kislin v lipidih, oksidacije aminokislin v proteinih in oksidativna deaktivacija specifičnih encimov z oksidacijo kofaktorjev. Celice nevtralizirajo ROS z antioksidacijskim sistemom za preprečevanje takšne poškodbe tkiva. V tem sistemu je superoksidanion, ki ga proizvaja metabolizem, zelo uničujoč; čeprav ga superoksid dismutaza (SOD) pretvori v vodikov peroksid, je vodikov peroksid še vedno reaktiven. Vodikov peroksid se s pomočjo katalaze pretvori v H2O in se porabi pri proizvodnji glutationdisulfida (GSSG) iz glutationa s katalizo GPX. TPX deluje podobno kot GPX [13].

Ta študija je raziskovala učinek treh antioksidantnih encimov, GPX, TPX in katalaze, na razbarvanje melanina. Posledično sta bila GPX in TPX učinkovita pri zmanjševanju barve melanina. Med njimi GPX ni imel citotoksičnosti pri optimalni koncentraciji aktivnosti za razbarvanje melanina in je učinkovito zaviral sintezo melanina. Zato zagotavlja dokaze, da igra GPX pomembno vlogo v mehanizmu razbarvanja lizosomske frakcije melanina, ne le pri antioksidativni aktivnosti, in ponuja potencial novega belilnega kozmetičnega sredstva kot enega samega encima.

Materiali in metode

Peroksidaze in analiza aktivnosti peroksidaze

Koncentracijo treh peroksidaz (glutation peroksidaze, tiol peroksidaze in katalaze) smo določili s testnim kompletom (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChromTM), kupljenim pri Bioassay Systems. Glutation peroksidaza 2 (GPX2, NBP1-78,824, Novus) in tiol peroksidaza (TPX,NBP1-78,805, Novus) sta bili kupljeni pri Novusu in Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) je bil kupljen pri Sigma-Aldrich.

Ta testni komplet uporablja H2O2 in barvilo donorjev elektronov, ki med peroksidazo tvori resorufin. Test je bil izveden pri sobni temperaturi (RT), intenzivnost barve pa je bila izmerjena pri 570 nm. Peroksidaze so reagirale z barvilom donorjev elektronov z 0,6-odstotnim vodikovim peroksidom 10 minut pri sobni temperaturi. Po reakciji smo dodali stop reagent in absorbanco vzorca izmerili s spektrofotometrijo na mikroplošči. Aktivnost je bila izračunana na naslednji način:

Aktivnost peroksidaze=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Volumen reakcije (𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Volumen vzorca (𝜇L)

(U/L). Ena enota (U) encima bo katalizirala tvorbo 1 μmola rezorufina na minuto pod pogoji testa. Tukaj so RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN in RH2O absorpcija vzorca, slepega vzorca, resorufina in vode; in n je faktor razredčitve vzorca. [Resorufin] za ta test je 50 μM. Reakcijski volumen je 100 μL, volumen vzorca v tej študiji pa 10 μL.

Razbarvanje melanina z glutation peroksidazo (GPX), tiol peroksidazo (TPX) in katalazo

Raztopina melanina vsebuje {{0}}.1 mM PBS (fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom, pH: 7,0) in melaninski prah (Synthetic, Sigma), ki je bil pripravljen z oksidacijo tirozina z vodikovim peroksidom. Vsebnost melanina smo izmerili z absorbanco pri 450 nm. Za določitev koncentracije melanina je bila pripravljena standardna krivulja iz avtentičnega standarda sintetičnega melanina (R2=0.999, podatki niso prikazani).

Za preverjanje razbarvanja melanina je 100 ppm raztopine melanina, ki je vsebovala (50 do 1000) μU/L peroksidaze (GPX, TPX, katalaza) z 1 mM vodikovega peroksida reagiralo pri sobni temperaturi in merilo vsak dan. Vrednost razbarvanja melanina je bila določena z odštevanjem koncentracije melanina po reakciji od začetne vrednosti.

Cistanche zavira sintezo melanina.

Celična kultura

Celice melanoma miši B16F10 (KCLB 80008) so bile kupljene pri korejski banki celičnih linij (KCLB, Seul, Koreja). Celice smo gojili v Dulbeccovem modificiranem orlovem mediju (DMEM), ki je vseboval 4500 mg/l glukoze, 4 mM l-glutamina, 1 mM natrijevega piruvata, ki mu je bilo dodanih 10 odstotkov fetalnega govejega seruma (FBS), 20 mM HEPES, 1 odstotek penicilina, in celice smo inkubirali v vlažnih pogojih, ki so vsebovali 5 odstotkov CO2 pri 37 stopinjah. Medij smo zamenjali vsaka 2 dni (d) in celice pobrali z raztopino tripsina/EDTA.

Test viabilnosti celic (MTT test)

Toksični učinek glutation peroksidaze na celico melanoma B16F10 je bil potrjen s testom MTT, splošno metodo, ki se uporablja za določanje učinka vzorca na sposobnost preživetja adherentne celice. Ta test uporablja 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijev bromid (MTT), ki ga mitohondriji lahko reducirajo v formazan encim v živi celici. 3 × 103 celic smo zasejali na vdolbinico v 96-ploščo z vdolbinicami in inkubirali 24 ur. Nato smo v vsako jamico dodali vzorec in inkubirali 72 ur. Po tem smo medij zamenjali s tistim, ki je vseboval 0,5 mg/mL MTT, in inkubirali 2 uri. Nato smo odstranili barvni reagent MTT in nastali formazan 30 minut raztopili z DMSO. Končno so bile koncentracije formazana izmerjene pri 570 nm s spektrofotometrijo na mikroplošči. Viabilnost celic je bila izračunana na naslednji način: viabilnost celic (v odstotkih)=(Avzorec − Prazno)/(Akontrola − Prazno)*100.

cistanche v hindijščini

Test vsebnosti melanina

3 × 105 celic B16F10 smo zasejali na vdolbinico v 6-ploščo z vdolbinicami in inkubirali 24 ur, da se oprimejo. Medij vsake vdolbinice smo zamenjali s tistim, ki je vseboval različne koncentracije encima in 10 nM -MSH, nato pa inkubirali 72 ur. Po tem so bile vse vdolbinice sprane s pufrom DPBS in pobrane z uporabo 0,5-odstotne raztopine tripsina/EDTA. Pelete celic, pridobljene s centrifugiranjem, smo lizirali z 200 μL 1 N NaOH, ki vsebuje 10 odstotkov DMSO, 1 uro pri 80 stopinjah. Končno smo vsebnost liziranega melanina izmerili z absorbanco pri 450 nm. Učinkovitost inhibicije proizvodnje melanina encima je bila določena s primerjavo s pozitivno kontrolo z uporabo 100 mg/mL arbutina.

Rezultati

Peroksidazna aktivnost glutation peroksidaze (GPX), tiol peroksidaze (TPX) in katalaze

Ta študija je razširitev raziskave uporabe zdravljenja z lizosomsko frakcijo za razbarvanje melaninskih spojin in vitro in in vivo. V prejšnji študiji smo ugotovili, da ima lizosomska frakcija, izolirana iz celic Hela, S. cerevisiae, kokošjega jajca, učinek zmanjšanja barve melanina inUčinkovitost razbarvanja melanina je bila povezana z aktivnostjo peroksidaze lizosomske frakcije, ki ni vezana na membrano, vključno z lizosomi in peroksisomi. Za potrditev učinka peroksidaz na zmanjšanje barve melanina so bile izbrane tri peroksidaze, glutation peroksidaza (GPX), tiol peroksidaza (TPX) in katalaza. Ti encimi igrajo pomembno vlogo pri zmanjševanju oksidativnega stresa, ki ga povzročajo reaktivne kisikove vrste v celicah [14].

Aktivnost teh encimov je bila določena s testnim kompletom (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChrom™). Ta metoda je temeljila na oksidaciji barvila donorjev elektronov, ki med reakcijo peroksidaze tvori rožnato barvo [15]. Aktivnost peroksidaze je bila izražena z uporabo naslednjih enot: 1 enota=1 U=tvorba 1 µmola rezorufina na minuto pod pogoji preizkusa. Tabela 1 povzema aktivnost in koncentracijo treh peroksidaz, GPX, TPX in katalaze.

Aktivnost razbarvanja melanina glutation peroksidaze (GPX), tiol peroksidaze (TPX) in katalaze

Za potrditev učinka razbarvanja melanina s peroksidazami smo 100 ppm raztopino melanina obdelali z 1 mM vodikovega peroksida in (50 do 1000) µU/L koncentracije vsake peroksidaze. Vzorci so reagirali 2 dni pri RT, nato pa so jih primerjali z začetno koncentracijo. Slika 1 prikazuje zmanjšanje melanina po 48 urah. Slika 1 prikazuje dokaze, da imata TPX in GPX aktivnost razbarvanja melanina. Katalaza ni vplivala na zmanjšanje barve melanina (slika 1a). TPX je bil učinkovit pri razbarvanju melaninskih spojin, učinkovitost pa je bila najboljša pri obdelavi s koncentracijo 1 µU/mL (slika 1b). GPX je imel tudi aktivnost zmanjšanja barve melanina, ki je bila najboljša pri koncentraciji 0,2 µU/mL in se je postopoma zmanjševala pri višjih koncentracijah (slika 1c). Ta vrednost predstavlja 175-odstotno izboljšano zmanjšanje barve melanina v primerjavi s kontrolo, obdelano samo z vodikovim peroksidom. GPX je bil učinkovitejši glede koncentracije in aktivnosti peroksidaze v primerjavi s TPX. Obdelava z 0,2 µU/mL GPX in 1 mM vodikovega peroksida doraztopina melanina je za 4 dni razbarvala 13 odstotkov 100 ppm melanina (sl.2). Vendar niti GPX niti TPX nista pokazala učinka zmanjšanja barve brez vodikovega peroksida (podatki niso prikazani).

Tabela 1 Specifični podatki za encime, glutation peroksidazo 2, tiol peroksidazo in katalazo

Vpliv glutation peroksidaze (GPX) in H2O2 na sposobnost preživetja celic B16F10

Učinek GPX na sposobnost preživetja melanomskih celic B16F10 je bil potrjen s testom MTT pred testom inhibicije sinteze melanina. Da bi našli ustrezno koncentracijo vodikovega peroksida za zdravljenje, smo ocenili citotoksičnost z zdravljenjem z vodikovim peroksidom 72 ur pri različnih koncentracijah. Pri koncentraciji 0.1 mM H2O2 ni imel celične toksičnosti za celice 72 ur, medtem ko so pri koncentraciji nad 1 mM opazili veliko toksičnost. (slika 3a). Učinek GPX na preživetje celic so nato ocenili v prisotnosti 0.1 mM vodikovega peroksida, ki ni bil citotoksičen. GPX ni imel citotoksičnosti za celice B16F10 pod koncentracijo 0,5 μU/mL, kar je bilo učinkovito v študijah razbarvanja melanina (slika 3b).

Slika 1Relativno zmanjšanje barve melanina v primerjavi z zdravljenjem samo z vodikovim peroksidom.

Vpliv glutation peroksidaze (GPX) in H2O2 na sintezo melanina v celicah melanoma B16F10

Raziskovali smo vpliv GPX, ki je bil najbolj učinkovit pri razbarvanju melanina, na sintezo melanina v mel-anocitih. Slika 4 prikazuje vsebnost melanina v celicah melanoma B16F10, zdravljenih z vsakim vzorcem 72 ur. Zdravljenje z 0.05 μU/mL GPX in 0,1 mM H2O2 je povzročilo največjo inhibicijo melanogeneze za 43 odstotkov v primerjavi s kontrolo (samo zdravljenje z -MSH). To je bilo za 153 odstotkov višje kot pri pozitivni kontroli (zdravljenje z arbutinom in -MSH) in za 22 odstotkov višje kot pri vodikovem peroksidu brez encima, medtem ko zdravljenje z GPX ni pokazalo dramatičnega zmanjšanja melanina v odsotnosti vodikovega peroksida, kar podpira to mnenje. (podatki niso prikazani). Posledično je GPX zaviral proizvodnjo melaninskih spojin, vendar je na sintezo melanina v celicah bolj vplival vodikov peroksid kot GPX.

Diskusija

V tej študiji so naši raziskovalci odkrili optimalno koncentracijo in učinek GPX, TPX in katalaze, antioksidativnih encimov, ki zmanjšujejo oksidativni stres v celicah, na razbarvanje melaninskih spojin. Kot rezultat zunajceličnih poskusov z uporabo sintetiziranih melaninskih spojin imata GPX in TPX učinek razbarvanja melanina, Catalaseda pa ne. Obstajajo poročila, da lahko encimi, ki razgrajujejo lignin, v nekaterih glivah, kot je lakaza, lignin peroksidaza, razgradijo melanin v prisotnosti vodikovega peroksida [16–18]. S to študijo je bilo potrjeno, da antioksidanti, ki so v vseh evkariontih in ne encimov, ki razgrajujejo lignin, imajo aktivnost razbarvanja melanina. Čeprav lahko GPX in TPX tudi zmanjšata barvo melanina v prisotnosti vodikovega peroksida, lahko ti encimi delujejo kot glavna komponenta mehanizma razbarvanja melanina v lizosomski frakciji.

GPX, ki je bil najučinkovitejši za zmanjšanje barve melanina in vitro, je bil obdelan s celicami melanoma B16F10, da bi ugotovili njegov učinek na sintezo melanina. V melanomskih celicah B16F10 GPX ni bil citotoksičen pri koncentracijah, ki so bile učinkovite pri razbarvanju melaninskih spojin, koncentracija vodikovega peroksida, obdelanega skupaj, pa je bila 0,1 mM, brez toksičnosti. Zdravljenje z vodikovim peroksidom je močno zaviralo sintezo melanina, pri delu z GPX pa je bila učinkovitost boljša, medtem ko ni bilo koncentracijske odvisnosti zdravila. Ker encimi vodikov peroksid hitro porabijo, je mogoče razumeti, da večja kot je koncentracija encima, ki ga je treba obdelati, manjša je inhibicija sinteze melanina z vodikovim peroksidom. To mnenje podpira tudi dejstvo, da zdravljenje z GPX ni pokazalo dramatičnega zmanjšanja melanina v odsotnosti vodikovega peroksida (podatki niso prikazani). Posledično je GPX zaviral proizvodnjo melaninskih spojin, vendar je na sintezo melanina v celicah bolj vplival vodikov peroksid kot GPX. Ti rezultati kažejo, da antioksidativni encimi inducirajo razgradnjo melanina v mehanizmih avtofagije, ki prebavljajo melanosome.

cistanche tablete

Za več informacij kliknite tukaj.

Zaključek

Naša študija kaže, da glutation peroksidaza (GPX) in tiol peroksidaza (TPX) prispevata k razbarvanju melanina, GPX pa učinkovito zavira sintezo melanina. Rezultati podpirajo hipotezo, da antioksidativni encimi inducirajo razgradnjo melanina v mehanizmih avtofagije, ki prebavljajo melanosome. Za dokončen zaključek bo morda potrebna študija o mehanizmu prebave melanosomov v kožnih celicah, keratinocitih in melanocitih.