Antioksidativne in antimelanogene aktivnosti izvlečka toplotno obdelanega sladkega korena (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* in Hyung Don Kim 1,*

Povzetek:Melanin je rjav ali črn pigment, ki ščiti kožo pred ultravijoličnim sevanjem in reaktivnimi kisikovimi vrstami (ROS). Vendar pa je čezmerna proizvodnja melanina povezana z lentigini, melazmo, pegami in kožnim rakom.sladki korenje pokazalantioksidantdeluje protitumorsko, protitrombocitno, protivnetno in imunomodulatorno ter se uporablja kot naravno zdravljenje kožebeljenje.Želeli smo potrditi potencial Wongama, nove sorte sladkega korena, ki jo je razvila Uprava za razvoj podeželja (RDA), kotbeljenjesredstvo v kozmetiki. Poleg tega smo s primerjavo preverili vpliv toplotne obdelave na bioaktivnost sladkega korenaantioksidantinantimelanogenoaktivnosti ekstrakta sladkega korena pred in po segrevanju (130 ◦C). Toplotno obdelan izvleček sladkega korena (WH-130) je pokazal višje aktivnosti lovljenja radikalov v ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-etil benzotiazolin-6-sulfonska kisline) diamonijeve soli) in testi DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Poleg tega je WH-130 učinkoviteje zaviral melanogenezo zaradi znižane regulacije tirozinaze v celicah melanoma B16F10 kot negretosladki korenekstrakt. Poleg tega je toplotna obdelava povečala skupno vsebnost fenolov. Zlasti izolikviritigenin, anantioksidantinantimelanogenospojina sladkega korena, je bila proizvedena s toplotno obdelavo. Skratka, WH-130 ima zvišane ravni bioaktivnih fenolov, kot je izolikviritigenin, potencial za razvoj v novo kožobeljenjematerial z aplikacijami v kozmetiki.

Ključne besede: antimelanogenodejavnost; toplotna obdelava;sladki koren; celice mišjega melanoma (B16F10)

Cistanche je antioksidant

1. Uvod

sladki koren(vrste Glycyrrhiza), trajnica z medicinsko uporabo v družini Leguminosae, je široko razširjena po Srednji Aziji, na Kitajskem, v Rusiji, Mandžuriji, Mongoliji in Evropi [1]. Že dolgo se uporablja kot aroma in sladilo. Posušena korenina in stolon sladkega korena sta bila uporabljena za zdravljenje prehlada, kašlja, astme, utrujenosti in okužb dihalnih poti zaradi bioloških aktivnosti sladkega korena, vključno zantioksidantprotimikrobno, protitumorsko, protitrombocitno, protivnetno in imunomodulatorno delovanje [2,3]. Rod Glycyrrhiza sestavlja približno 22 vrst sladkega korena, vključno z G. uralensisFisch, G. glabra L. in G. inflata Batal.

Wongam, novo medvrstno hibridno sorto sladkega korena, je razvila Uprava za razvoj podeželja kot hibrid Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam ima višje donose in boljšo odpornost na bolezni kot G. uralensis. Izvedene so bile številne študije o bioloških aktivnostih G. uralensis, medtem ko so obstoječe raziskave Wongam, nove sorte, omejene na njegove protialergijske, imunomodulatorne in protiulkusne aktivnosti [1,2]. Zato je treba raziskati široko bioaktivnost Wongama.

Glavne bioaktivne sestavine vsladki korenkoren so flavonoidi in triterpenski saponini, vključno z likviritinom, likviritigeninom, izolikviritigeninom (ISL) in glicirizinom (ali glicirizinsko kislino) [4,5]. ISL je flavonoid, ki ga najdemo v sladkem korenu in je pokazal različne farmacevtske aktivnosti, vključno z antitrombocitnim, antialergijskim, protitumorskim, protivnetnim inantioksidantdejavnosti [6–8]. ISL je produkt hidrolize izolikviritina v korenini sladkega korena. Lahko zavira melanogenezo z razgradnjo z mikroftalmijo povezanega transkripcijskega faktorja (MITF) z aktivacijo zunajcelične signalno regulirane protein kinaze (ERK) signalne poti. Posledično je razgradnja MITF zavrla izražanje tirozinaze (TYR) in genov, povezanih s tirozinazo (TRP-1 in TRP-2) v celicah SK-MEL-2 [9,10].ISL lahko zavira mono- in difenolazne aktivnosti gob TYR kot tudi temelanogenezo v melanocitih [11].

Melanin, glavni pigment, ki daje koži barvo, se sintetizira v epidermalnih melanocitih in shranjuje v znotrajceličnih organelih, imenovanih melanosomi [12]. Melaninski pigmenti so sestavljeni iz dveh vrst: rjavega ali črnega evmelanina in rdečega ali rumenega feomelanina [12]. Melanogenezo lahko sprožijo zunanji dražljaji, vključno z ultravijoličnim (UV) sevanjem, reaktivnimi kisikovimi vrstami (ROS) in kemikalijami, kot sta -melanocite stimulirajoči hormon (-MSH) in izobutilmetilksantin (IBMX), ki zvišuje ravni cikličnega adenozin monofosfata (cAMP). Melanin ščiti kožo pred temi dražljaji, medtem ko njegova prekomerna proizvodnja povzroča hiperpigmentacijo kože, ki lahko povzroči bolezni, kot je kožni rak [13–17]. kožabeljenjesredstva, kot so kojična kislina, hidrokinon, arbutin in askorbinska kislina, ki so zaviralci TYR, so bila uporabljena za zdravljenje hiperpigmentacije v več kozmetičnih izdelkih [13,18]. Melanogeneza je regulirana prek različnih signalnih poti in ti signali so povezani z regulacijo MITF. Aktivacija MITF spodbuja izražanje TYR in TRP (TRP-1, TRP-2). Nato TYR katalizira oksidacijo L-tirozina v 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), ki se nato oksidira v DOPAkinon. TRP-2 pretvori dopahrom v 5,6-dihidroksiindol-2-karboksilno kislino (DHICA) ali 5,6-dihidroksiindol (DHI). Končno DHICA in DHI oksidira TRP-1, kar povzroči melanogenezo [19].

Toplotni procesi vplivajo na fizikalno-kemijske in biološke lastnosti rastlinskih izvlečkov. Uničujejo celične stene in cepijo kovalentne vezi, kar povzroči sproščanje bioaktivnih spojin [20,21]. Toplotna obdelava izvlečkov izrabljenih zrn v pivovarni nad 130 °C poveča vsebnost skupnih fenolov (TPC) in vsebnost skupnih flavonoidov (TFC), z ustreznim povečanjem antioksidativnih aktivnosti [16,20,21]. Segrevanje olupkov citrusov lahko povzroči sproščanje fenolnih spojin in njihovo povečanjeantioksidantdejavnost [17].

Naš glavni cilj je potrditi potencial Wongama kot naravne kožebeljenjematerial v kozmetiki. Poleg tega je ta študija namenjena tudi dokazovanju, ali lahko toplotna obdelava izboljša antioksidativno in antimelanogeno delovanjesladki koren. Raziskali smoantioksidantdejavnosti, skupaj s TPC izvlečkov Wongam.AntimelanogenoUčinke izvlečkov Wongam so preverili z aktivnostjo inhibicije TYR in vsebnostjo melanina v celicah melanoma.

Cistanche je naravnakožobeljenje zelišče

2. Materiali in metode

2.1. Priprava vzorca

Vzorci so bili pripravljeni v skladu s predhodno opisano metodo [22].sladki koren(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, ki ga je identificiral Yun Ji Lee iz NIHHS, RDA in registrirano v Korejskem herbariju medicinskih virov s številko vavčerja MPS006326) so gojili in pobrali na Oddelku za raziskave zelišč (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Koreja). ) leta 2018 in sušimo pri 60 ◦C 20 ur. 10 kgsladki korenpobrali in zmleli 1 kg. Po njihovem mešanju so bili pridobljeni 3 vzorci WC oziroma WH. Zmleti sladki koren (5 g) smo dali v stekleno posodo z 1 ml destilirane vode in obdelali v avtoklavu (Jisico, Seul, Koreja) 1 uro pri 130 ◦C (WH-130). Neobdelan kontrolni sladki koren (WC , 5 g) in WH-130 smo ločeno ekstrahirali z uporabo 70-odstotnega etanola (vzorec: topilo, 1:50, v:v) 24 ur pri sobni temperaturi (RT). Po filtraciji smo ekstrakte uparili pod vakuumom, liofilizirali in shranili pri –80 ◦C. Vsi ekstrakti so bili solubilizirani v dimetil sulfoksidu (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, ZDA) in metanolu (Sigma, St. Louis, MO, ZDA).

2.2. Določanje porjavitve

Indeks porjavitvesladki korenekstraktov (WC in WH-130) je bila zabeležena na podlagi njihove vrednosti absorbance pri 420 nm (A420), izmerjene z bralnikom mikroplošč (BioTek, Winooski, VT, ZDA). Višje vrednosti absorbance pri 420 nm ustrezajo višjemu indeksu porjavitve [23, 24].

2.3. Skupna vsebnost fenolov (TPC)

V skladu s prej opisano metodo [25] je bil TPC izmerjen na podlagi načela, da se Folin–Ciocalteujev reagent reducira v modri kromofor, ki ga sestavlja kompleks fosfovolfram-fosfomolibden, odvisno od alkalnih pogojev in koncentracije fenolnih spojin. Vsak vzorec (10 µL) smo zmešali z 2-odstotnim natrijevim karbonatom (200 µL) in nato Folin-Ciocalteujevim reagentom (10 µL). Zmes smo aktivirali 30 minut pri sobni temperaturi. Nato smo izmerili absorbanco pri 750 nm z uporabo bralnika mikroplošč (BioTek, Winooski, VT, ZDA). TPC je bil izračunan iz standardne krivulje galne kisline in rezultati so bili izraženi kot vrednosti ekvivalenta galne kisline, mg GAE g-1 ekstrakta.

2.4. Določanje antioksidativne kapacitete

Aktivnost lovljenja radikalov je bila izmerjena z uporabo 2,20-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin 6-sulfonske kisline) diamonijeve soli (ABTS) v skladu s predhodno opisano metodo z rahlo modifikacijo [19, 26]. Raztopino kationskega radikala ABTS smo proizvedli z mešanjem 2,6 mM kalijevega persulfata in 7,4 mM ABTS ter ju pustili reagirati 24 ur pri sobni temperaturi. Raztopino ABTS smo nato razredčili z destilirano vodo, da smo prilagodili absorbanco na območje 1.000–1.500. Nato je 20 µL vzorca reagiralo s 180 µL raztopine ABTS plus, zaščiteno pred svetlobo, in zmes vzorca in raztopine inkubirali 30 minut pri RT. Absorbanco smo izmerili z bralnikom mikroplošč (BioTek, Winooski, VT, ZDA) pri 735 nm. Iz standardne krivulje Trolox, ekvivalent Troloxantioksidantkapaciteta (TEAC) je bila izračunana in izražena v mg ekvivalenta troloksa (TE) na g suhega vzorca.

Raztopino radikala 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) smo pripravili z raztapljanjem 0.2 mM DPPH v 99-odstotnem etanolu. Raztopino DPPH smo razredčili z destilirano vodo do anabsorpcije pri 520 nm 1000–1500. Nato smo 50 µL vzorca zmešali z 200 µL raztopine DPPH in reagirali 30 minut pri sobni temperaturi. Po reakciji smo določili absorbanco zmesi pri 520 nm. Iz standardne krivulje Trolox je bil izračunan TEAC in izražen v mg TE na g suhega vzorca.

2.5. Analiza s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).

Uporabljena je bila modificirana metoda HPLC [22]. Vsebina ISLsladki korenekstrakte smo analizirali s HPLC z UV-vidnim detektorjem (HPLC: serija 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA; stolpec: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, ZDA). Mobilna faza je bila sestavljena iz topila A (0.1 % mravljinčne kisline v vodi) in topila B (0.1 % mravljične kisline v acetonitrilu). Gradientni program za mobilno fazo se je izvajal pod naslednjim gradientom: 0–8 min (20–20 odstotkov B), 8–30 minut (20–38 odstotkov B), 30–42 minut (38–50 odstotkov B), 42–47 min (50–90 odstotkov B), 47–53 minut (90–90 odstotkov B), 53–54 minut (90–20 odstotkov B) in 54–60 minut (20–20 odstotkov B) . Hitrost pretoka, valovna dolžina zaznavanja in volumen injiciranja so bili nastavljeni na 1,0 ml/min, 360 nm oziroma 10 µL. Standardne raztopine ISL so bile analizirane s štirimi različnimi koncentracijami (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/mL). Za določitev vsebnosti ISL je bila uporabljena umeritvena krivulja (y=ax plus b). V regresijski enačbi se x nanaša na koncentracijo ISL (mg mL-1), y pa pomeni površino vrha.

2.6. Test inhibitorne aktivnosti gobove tirozinaze

Test inhibitorne aktivnosti TYR je bil izveden z uporabo kompleta za presejanje inhibitorjev TYR (BioVision, Milpitas, CA, ZDA). Vsak ekstrakt (WC in WH-130) je bil raztopljen v DMSO do končne koncentracije 250 µg/mL. Kojična kislina, uporabljena kot pozitivna kontrola, je bila prav tako razredčena na 250 µg/mL v DMSO. Na kratko, 20 µL ekstrakta ali kojične kisline smo zmešali s 50 µL raztopine encima TYR. Po inkubaciji pri sobni temperaturi 10 minut smo v vsako vdolbinico dodali 30 µL raztopine substrata TYR. Končna koncentracija ekstraktov in kojične kisline je bila 50 µg/mL. Optično gostoto vdolbinic smo nato izmerili pri 510 nm v kinetičnem načinu 1 uro z bralnikom mikroplošč (BioTek, Winooski, VT, ZDA).

prašek cistanche: antioksidant

2.7. Celična kultura

Celice mišjega melanoma B16F10 so bile pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC, Manassas, VA, ZDA). Celice B16F10 smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS), 100 enot/mL penicilina in 100 µg/mL streptomicina (Gibco, Grand Island, NY, ZDA) v vlažni atmosferi, ki je vsebovala 5 % CO2 pri 37 ◦C.

2.8. Test viabilnosti celic

Citotoksičnostsladki korenekstraktov (WC in WH-130) do celic B16F10 smo določili z uporabo MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{8 }}difeniltetrazolijev bromid]. Celice B16F10 smo gojili pri 4 × 103 celic/vdolbino v 96-plošči z vdolbinicami 24 ur. Nato smo celicam dodali izvlečke v koncentracijah 50, 100 in 200 µg/mL in jih inkubirali pri 37 ◦C 48 ur. Nato smo v vsako vdolbinico dodali raztopino MTT (500 µg/mL) in ploščo inkubirali 1 uro pri 37 °C. Medij v vsaki vdolbinici smo zavrgli in dodali 100 µL DMSO. Po 30-minutnem stresanju smo absorbanco izmerili pri 540 nm z čitalcem mikroplošč. Vsi testi so bili izvedeni v treh izvodih.

2.9. Merjenje vsebnosti celičnega melanina

Znotrajcelična vsebnost melanina je bila izmerjena z rahlo spremenjeno različico metode, ki je bila prej opisana [27]. Celice melanoma B16F10 so bile posejane v 6-plošče z vdolbinicami z gostoto 8 × 104 celic/vdolbinico in inkubirane 24 ur. Celice so bile 48 ur izpostavljene ekstraktom (WC in WH-130, 100 µg/mL), kojic kislini (100 µg/mL) ali ISL (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Združene države Amerike). prisotnost 100 µM 3-izobutil-1-metilksantina (IBMX). Po obdelavi smo celice sprali z Dulbeccovo fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (DPBS) in raztopili v 200 µL 1 N NaOH 2 uri pri 90 °C. Absorbanco pri 405 nm smo izmerili s čitalnikom mikroplošč.

2.10. Test aktivnosti celične tirozinaze

Znotrajcelična aktivnost TYR je bila izmerjena z rahlo spremenjeno različico predhodno opisane metode [27]. Celice melanoma B16F10 (8 × 104 celic/jamico) smo 48 ur obdelali z ekstrakti (100 µg/mL) ali kojično kislino (100 µg/mL) v prisotnosti 100 µM IBMX, jih zbrali in sprali z DPBS. Vzorce beljakovin smo lizirali v 1 odstotku TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, ZDA) z natrijevim fosfatnim pufrom (pH 6,8) in nato 10 minut centrifugirali pri 15000 obratih na minuto. Supernatantno frakcijo smo zbrali in koncentracijo beljakovin določili z uporabo kompleta za testiranje bicinhoninske kisline (BCA) (Waltham, MA, ZDA). Reakcijsko mešanico, sestavljeno iz 30 µg beljakovin (naravnanih na 100 µL z 1 odstotkom Triona X-100) in 100 µL 10 mM L-DOPA, smo dodali v vsako vdolbinico 96-plošče z vdolbinicami. Po inkubaciji pri 37 ◦C 1 uro smo dopahrom spremljali z merjenjem absorpcije pri 490 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Aktivnost TYR je bila izračunana z naslednjo formulo:

Aktivnost tirozinaze (odstotki)=(OD405 vzorca/OD405 kontrole) × 100

2.11. Verižna reakcija s polimerazo v realnem času (RT-PCR)

Stopnje ekspresije mRNA genov, povezanih z melanogenezo, vključno z MITF, TYR, TRP-1 in TRP-2, so bile določene z uporabo modificiranega testa RT-PCR [28]. Na kratko, celice B16F10 smo zasejali v 6-plošče z vdolbinicami pri gostoti 8 × 104 celic na vdolbinico in jih gojili 24 ur. Nato smo celice 48 ur obdelali z ekstrakti (100 µg/mL), kojično kislino (100 µg/mL) ali ISL (10 µM). Celotno RNA smo izolirali iz celic z uporabo TRIzol reagenta (Ambion, Austin, TX, ZDA) in nato koncentracijo RNA kvantificirali z mikroplatereaderjem. Po pripravi cDNA (2 µg) z uporabo kompleta predmešanice reverzne transkriptaze (ElpisBiotech, Daejeon, Koreja) v skladu s protokoli proizvajalca je bila izvedena PCR v realnem času z uporabo MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 in -aktinske primerje (tabela 1, Bioneer, Daejeon, Koreja) s kompletom SYBR Green (ProGEN, Heidelberg, Nemčija) v CFX96 PCR instrumentu v realnem času (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). Vsi podatki so bili normalizirani na ravni -actinmRNA kot referenčnega gospodinjskega gena.

2.12. Priprava celičnih lizatov in Western blot analiza

Celice B16F10 so bile posejane v 6-plošče z vdolbinicami z gostoto 8 × 104 celic na vdolbinico, inkubirane 24 ur in nato izpostavljene ekstraktom (100 µg/mL), kojic kislini (100 µg/mL). ) ali ISL (10 µM) 48 ur. Po izpiranju z DPBS smo celice pobrali in lizirali v pufru Triton X-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, ZDA), ki je vseboval 1 odstotek proteaze in mešanice inhibitorjev fosfataze. Koncentracije beljakovin v lizatih celih celic so bile izmerjene s kompletom za testiranje aBCA (Waltham, MA, ZDA). Enake količine proteina (20 µg) smo naložili na 10-odstotne natrijev dodecil sulfat-poliakrilamidne gele, ki smo jih izvajali 4 ure pri 70 V. Nato smo proteine ​​prenesli na membrano iz poliviniliden fluorida (PVDF). Membrana je bila trikrat sprana s Tris-pufrano fiziološko raztopino [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl], ki je vsebovala 0,1 odstotka Tween 20 (TBST) in blokirana z 2-odstotnim govejim serumskim albuminom (GenDEPOT) 1 uro. Nato smo membrane inkubirali čez noč pri 4 ◦C s primarnimi protitelesi (razredčitev 1:1000) 4 ure pri sobni temperaturi. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 in -actin so odkrili s kunčjim poliklonskim protitelesom proti MITF (Abcam, Cambridge, UK); kozje poliklonsko protitelo proti TYR (Santa Cruz, Dallas, TX, ZDA); in mišja monoklonska protitelesa antiTRP-1, anti-TRP-2 in anti- -aktinska protitelesa (Santa Cruz, Dallas, TX, ZDA). Nato so bile membrane večkrat sprane s TBST in inkubirali s sekundarnimi protitelesi (razredčitev 1:2000) 1 uro, in sicer kunčjim protimišjim IgG, mišjim protikozjim IgG in kozjim protimišjim IgG (Santa Cruz, Dallas, TX, ZDA), čemur je sledilo več izpiranj s TBST. Ciljne beljakovine so bile odkrite z reagentom za izboljšano kemiluminiscenco (ECL) (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) s sistemom za slikanje ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). Kvantifikacija proteinskih pasov je bila izvedena s programsko opremo ImageJ (različica 1.52a za Windows; NIH, Rockville, MD, ZDA) [28].

2.13. Statistična analiza Podatki so bili analizirani z uporabo programa Microsoft Excel 2016 in vsi eksperimentalni rezultati so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD) treh neodvisnih meritev. Študentov dvovzorčni t-test je bil uporabljen za oceno razlik med kontrolo in vzorci. Enosmerna analiza variance (ANOVA) in Duncanov test sta bila izvedena s programsko opremo R (različica 3.6.3) za določitev pomembnosti vsake primerjave pri ravni p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" in="" p="">< 0,001="" (***).="" korelacijska="" analiza="" je="" bila="" izvedena="" z="" uporabo="" prism5.02="" (programska="" oprema="" graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">

3. Rezultati

3.1. Browningov indeks izvlečkov sladkega korena

Stopnja porjavelostisladki korenizvlečkov je prikazano na sliki 1a. Ti rezultati so potrdili, da ima toplotno obdelan ekstrakt (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [absorbančne enote]) veliko višje vrednosti indeksa porjavitve kot nesegret ekstrakt (WC, 0.758 ± 0.005 AU). Pričakujemo, da toplotna obdelava poveča tvorbo melanoidina v WH-130 in da je ta sprememba lahko povezana z različnimi biološkimi aktivnostmi.

3.2. Skupna vsebnost fenolov (TPC) izvlečkov sladkega korena

Slika 1b prikazuje TPC zasladki korenizvlečki. Ugotovili smo razliko v TPC med WC in WH{{0}}, saj je imel WC TPC 12.093 ± 0,061 mg GAE/g ekstrakta, medtem ko je imel WH-130 TPC 14,098 ± 0,781 mg GAE/g ekstrakta. Toplotna obdelava je povečala TPC izvlečkov sladkega korena.

3.3. Dejavnost izvlečkov sladkega korena za odstranjevanje radikalov

Theantioksidantdejavnostsladki korenizvlečki so predstavljeni na sliki 1c,d. ABTS in sposobnost lovljenja radikalov je bila višja za ekstrakt WH-130 (6.086 ± 0.304 mg TEAC/gekstrakt) kot ekstrakt WC (3,542 ± 0.093 mg TEAC/g ekstrakta). Pri testu DPPH so opazili podobno tendenco. Ekstrakt WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g ekstrakta) je pokazal večjo aktivnost lovljenja radikalov DPPH kot ekstrakt WC (4,033 ± 0,160 mg TEAC/g ekstrakta). Ti rezultati kažejo, da lahko segrevanje poveča antioksidativno aktivnost izvlečkov.

3.4. Vsebnost izolikviritigenina v izvlečkih sladkega korena

Rezultati so pokazali, da se je vsebnost ISL v WC po toplotni obdelavi izrazito povečala (tabela 2, slika 2), kar kaže, da lahko termična obdelava vpliva na vsebnost tegaantioksidantinantimelanogenospojina.

cistanche tubolosa

3.5. Viabilnost celic

Kot je prikazano na sliki 3,sladki korenekstrakti niso vplivali na viabilnost celic pri 50 ali 100 µg/mL glede na kontrolo, obdelano z IBMX. Pri zdravljenju s 50 in 100 µg/mL vseh izvlečkov je sposobnost preživetja celic ostala večja od 100 odstotkov. Zato so bili izvedeni nadaljnji poskusi z uporabo ekstrakta sladkega korena v koncentracijah do 100 µg/mL.

3.6. Učinki izvlečkov sladkega korena na proizvodnjo melanina v celicah melanoma B16F10

Pigmentacija in vsebnost melanina v celicah B16F10 sta prikazani na sliki 4a,b. Vsebnost melanina v celicah B16F10 se je z zdravljenjem z IBMX povečala do 3.4--krat glede na netretirano kontrolo. WC in WH-130 sta pokazala znatno zmanjšano pigmentacijo in vsebnost melanina v primerjavi s skupino, zdravljeno z IBMX (slika 4a,b). Tako WC kot WH{{10}} sta pokazali nižjo vsebnost melanina kot celice, obdelane s KA. Zaviralni učinek sinteze melanina v celicah B16F10, zdravljenih z WH-130, je bil večji kot WC. Količine melanina, prisotnega po zdravljenju s 100 µg/mL WC in WH-130, so se zmanjšale na približno 0.59--krat oziroma 0.51--krat glede na raven v zdravljenih z IBMX ISL (10 µM) in KA (100 µg/mL) sta zavrla nastajanje melanina na 0.59--krat in 0.67--krat, glede na raven v celicah, zdravljenih z IBMX.

Ta rezultat kaže, da toplotno obdelansladki korenizvleček (WH-130) lahko učinkoviteje zavre nastajanje melanina kot izvleček brez segrevanja (WC). Poleg tega smo opazili, da je zdravljenje z ekstraktom WH-130 pri 25, 50 in 100 µg/mL (slika 4c) povzročilo od koncentracije odvisno zmanjšanje vsebnosti melanina v celicah melanoma B16F10. Ti rezultati skupaj kažejo, da je ogrevanje izboljšaloantimelanogenoaktivnost ekstrakta sladkega korena.

3.7. Učinki izvlečkov sladkega korena na aktivnost tirozinaze

3.7.1. Aktivnost tirozinaze gob

Učineksladki korenizvlečkov o aktivnosti gob TYR je prikazano na sliki 5a. Potrdili smo, da se je učinek izvlečkov (WC in WH-130) na oksidacijo substratov z gobo TYR pojavil v pogojih brez celic. Pri 50 µg/mL je ekstrakt WC zaviral aktivnost encimov na 81,33 odstotka, medtem ko je WH-130 zaviral aktivnost TYR na 65,95 odstotka ravni EC. Medtem je kojična kislina (KA), zaviralec TYR, povzročila inhibicijo encimske aktivnosti na 47,09 odstotka ravni EC. Inhibicija aktivnosti TYR je bila večja pri toplotno obdelanem sladkem korenu (WH-130) kot pri neogrevanem sladkem korenu (WC).

3.7.2. Dejavnost celične tirozinaze

Kot je prikazano na sliki 5b, se je aktivnost TYR celic, zdravljenih z IBMX, povečala na 233 odstotkov glede na neobdelano kontrolo (100 odstotkov). WC je zmanjšal aktivnost TYR na 82,17 odstotka v primerjavi s skupino, zdravljeno z IBMX. Ekstrakt WH-130 je zaviral celično aktivnost TYR na 59,88 odstotka v primerjavi s celicami, zdravljenimi z IBMX. KA je zmanjšal celično aktivnost TYR na 74,07 odstotka ravni v celicah, zdravljenih z IBMX. Ti rezultati skupaj kažejo, da izvlečki sladkega korena (WC in WH-130) zavirajo aktivnost TYR in da ima WH-130 močnejšo inhibitorno aktivnost TYR kot WC in KA.

Nato smo raziskali korelacije med TPC, vsebino ISL,antioksidantaktivnost in antimelanogeno aktivnost (tabela 3). TPC je bil v pozitivni korelaciji z vsebnostjo ISL (0.827) kot tudi z aktivnostmi odstranjevanja radikalov ABTS plus in DPPH (0.886 oziroma 0.896), medtem ko TPC je bil v obratni korelaciji z vsebnostjo melanina (–0.859). Vsebnost ISL je bila v pozitivni korelaciji z aktivnostmi odstranjevanja radikalov ABTS plus in DPPH (0.977 oziroma 0.985), medtem ko je bila vsebnost ISL v obratni korelaciji z aktivnostjo TYR (–0). 834) in vsebnost melanina (–0.995). Antioksidativne aktivnosti (ABTS plus in DPPH) so bile v obratni korelaciji z aktivnostjo TYR (–{{20}}.879 oziroma –0.856) in vsebnostjo melanina (–0). 974 oziroma –0,984). Ti rezultati kažejo, da so fenolne spojine, kot je ISL v sladkem korenu, tesno povezane z antioksidantom inantimelanogenoaktivnosti izvlečkov sladkega korena.

3.8. Učinki izvlečkov sladkega korena na izražanje mRNA genov, povezanih z melanogenezo

Preučili smo izražanje genov, povezanih z melanogenezo, v celicah B16F10, da bi pojasnili učinke izvlečkov sladkega korena na melanogenezo. Tako WC kot WH-130 sta zavirala ekspresijo mRNA MITF, TYR, TRP-1 in TRP-2 (slika 6). WC je zaviral ekspresijo mRNA MITF, TYR, TRP-1 in TRP-2 do ravni 0.{{10}}krat, 0.{ {12}}fold, 0.71-fold oziroma 0.65-fold tistih v celicah, obdelanih z IBMX. WH-130 je zaviral izražanje mRNA MITF, TYR, TRP-1 in TRP{{20}} na 0.43-krat, {{33 }}.60-fold, 0.62-fold in 0.49-fold v tem zaporedju ravni skupin, obdelanih z IBMX. Ekstrakt WH{{30}} je imel močnejši zaviralni učinek na izražanje mRNA kot ekstrakt WC. ISL je prav tako zavrl izražanje MITF, TYR, TRP-1 in TRP-2 (0.42-krat, 0.59-krat, 0.68-krat in 0.44-krat glede na celice, obdelane z IBMX). V skupini, zdravljeni z WH-130-, je bil obseg zmanjšanja izražanja mRNA genov, povezanih z melanogenezo, večji kot v skupini, zdravljeni z WC, kar kaže, dasladki korenizvlečki zavirajo melanogenezo z zaviranjem transkripcije z melanogenezo povezanih genov in da toplotna obdelava izboljšaantimelanogenoaktivnost ekstrakta sladkega korena.

3.9. Učinki izvlečkov sladkega korena na izražanje beljakovin genov, povezanih z melanogenezo

Kot je prikazano na sliki 7b, je zdravljenje z WC in WH-130 znatno zmanjšalo ravni izražanja beljakovin MITF, TYR, TRP-1 in TRP-2. Stopnje ekspresije MITF, TYR,TRP-1 in TRP-2 so bile zavrte v celicah, obdelanih z WC (0.79-krat, 0.{{9 }}fold, {{10}}.89-foldin 0.67-fold, glede na celice, obdelane z IBMX). WH-130 je pokazala zmanjšano raven ekspresije beljakovin MITF, TYR, TRP-1 in TRP-2 ({{20}}.74-krat, {{24 }}.73-zgib, 0.80-zgib in {{30}}.48-zgib glede na celice, obdelane z IBMX) . ISL je zmanjšal ravni izražanja beljakovin MITF, TYR in TRP-2 (0.76--krat, 0.83--krat oziroma 0.41--krat glede na zdravljenje z IBMMX celice). WH-130 je zaviral ekspresijo beljakovin z melanogenezo povezanih genov močneje kot WC, kar kaže, dasladki korenizvlečki zavirajo melanogenezo prek supresije prevajanja z melanogenezo povezanih genov in da toplotna obdelava izboljšaantimelanogenoaktivnost ekstrakta sladkega korena.

beljenje kože cistanche v prahu

4. Razprava

Rezultati te študije dokazujejo, da toplotna obdelavasladki korenvpliva na TPC, antioksidativno aktivnost inantimelanogenodejavnost. WH-130 je imel višji indeks porjavitve in vrednosti TPC kot WC. Pogoji obdelave, vključno s temperaturo in tlakom, vplivajo na sestavine vzorcev. [29]. Ogrevanje lahko spodbudi Maillardove reakcije, ki so povezane s proizvodnjo melanoidina [23]. Melanoidini imajo nekatere biološke učinke, med drugimantioksidant, protitumorsko in antihipertenzivno delovanje ter modulacijo krvnega sladkorja [30]. Te spojine so polimerne rjavo obarvane makromolekule, ki nastanejo z Maillardovo reakcijo iz interakcij med sladkorji in aminokislinami pri visokih temperaturah [21]. Tako je več melanoidinov v segretem ekstraktu, višji je indeks porjavitve. Barva negretega ekstrakta sladkega korena (WC) je bila svetlo rjava, vendar je barva postopoma temnejša z visoko temperaturo (130 stopinj). Postopek segrevanja lahko povzroči tudi nekatere spremembe v kemičnih strukturah fenolnih spojin in povzroči razgradnjo celičnih sten rastlin, sproščanje fenolov, kar vodi do antioksidativnih aktivnosti [31]. Tako se lahko vsebnost fenolov v ekstraktih sladkega korena poveča s toplotno obdelavo [21]. Prejšnja poročila so pokazala, da je toplotna obdelava medu povečala tvorbo melanoidina, stopnja porjavitve pa je sovpadala s povečanjem antioksidativne aktivnosti [24]. Zato je WH-130 pokazal višjo antioksidativno zmogljivost kot WC v testih ABTS plus in DPPH za lovljenje radikalov, ki se pogosto uporabljajo za določanje antiradikalnih aktivnosti vzorcev na podlagi sposobnosti prenosa elektronov ali vodikovih atomov [32].

Najpogostejši naravniantioksidantin antimelanogene spojine so fenoli. Tricin in 9-hidroksioktadekadienojska kislina sta bila identificirana kot glavna fenolna spojina Sorghum bicolor. Poleg tega so te komponente pokazale antioksidativne in antimelanogene učinke z zaviranjem aktivnosti tirozinaze [19]. Poleg tega je bilo dokazano, da p-kumarinska kislina, neaktivna spojina Sasa quelpaertensis Nakai, močno zavira aktivnost tirozinaze in zmanjša nastajanje melanina v celicah melanoma [27]. Glede na prejšnje raziskave ima ISL, dobro znana flavonoidna spojina v produktu hidrolize korenine sladkega korena [6–8], antioksidativno in antimelanogeno delovanje z zaviranjem aktivnosti TYR, transporta melanosomov in indukcije razgradnje melanina [10,31]. Zato smo se osredotočili na vsebnost ISL v izvlečkih in delovanje ISL v mehanizmih, povezanih z melanogenezo. ISL se uporablja kot terapevtsko sredstvo za številne bolezni zaradi številnih bioloških aktivnosti, vključno s protivnetnimi, protimikrobnimi, antioksidativnimi, protirakavimi, imunoregulacijskimi, hepatoprotektivnimi in kardioprotektivnimi učinki [33]. V tej študiji je bila višja vsebnost ISL izmerjena v WH-130 kot v WC. Hiperpigmentacija kože je povezana z oksidativnim stresom. Poročali so, da imajo lovilci prostih radikalov pomembno vlogo pri zatiranju hiperpigmentacije [17, 34]. Ti rezultati skupaj kažejo, da lahko toplotna obdelava sladkega korena izboljša njegove aktivnosti odstranjevanja radikalov inantimelanogenoaktivnosti prek povečanih ravni antioksidantnih fenolnih spojin, kot je ISL. Glede na prejšnjo literaturo so v sladkem korenu (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra) glabrene, glabridin, glabrol, likviritigenin, ki zavirajo tirozinazo. Torej lahko te spojine vplivajo tudi na antimelanogene aktivnosti [10,11,15,35]. Nadaljnje študije o njih so pomembne za pojasnitev antimelanogenih učinkov sladkega korena.

Sintezo melanina uravnavajo TYR, TRP-1, TRP-2 (dopakrom tavtomeraza) in MITF (slika 8). TYR, glikoprotein, ki vsebuje baker, deluje kot encim, ki omejuje hitrost, in igra ključno vlogo pri proizvodnji melanina. TYR katalizira hidroksilacijo tirozina v 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA). TYR tudi katalizira oksidacijo DOPA v dopakinon in pretvorbo dopakinona v dopakrom. Nato se dopahrom pretvori v dihidro-indolizin (DHI) ali indol 5,6-kinon-2-karboksilno kislino (DHICA) [36–38]. Na tej poti TRP-2 katalizira pretvorbo dopakroma v DHICA, ki ga TRP-1 oksidira, da nastane eumelanin. MITF je specifičen transkripcijski faktor, ki igra ključno vlogo pri melanogenezi kot glavni regulator izražanja TYR, TRP-1 in TRP-2 (slika 8) [28,37]. Kemični induktor melanogeneze je 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX), ki poveča aktivnost TYR prek signalne poti cAMP [13]. IBMX poveča znotrajcelično koncentracijo cAMP z zaviranjem cAMP fosfodiesteraze. Povečanje ravni cAMP aktivira protein kinazo A (PKA) in aktivirana PKA izboljša aktivnost in izražanje cAMP povezanega vezavnega proteina (CREB) [39]. CREB se veže na promotor MITF, kar vodi do povečane ekspresije gena MITF. Aktivacija MITF spodbuja izražanje TYR in TRP [13, 19]. Zato znižana regulacija MITF povzroči hipopigmentacijo.

Segret izvleček sladkega korena (WH-130) je zaviral TYR gob in celično aktivnost TYR učinkoviteje kot nesegret izvleček sladkega korena (WC). Inhibicijo celične aktivnosti TYR v izvlečkih sladkega korena lahko povzroči znižana regulacija TYR. Ti rezultati so povezani z vsebnostjo melanina v celicah melanoma B16F10. V celicah B16F10 je zdravljenje z WH-130 bolje zaviralo nastajanje melanina, ki ga povzroča IBMX, kot zdravljenje z WC. Poleg tega je WH 130 znižal transkripcijo in prevod z melanogenezo povezanih markerjev (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) v celicah B16F10 v večji meri kot WC. Ti označevalci lahko skupaj prispevajo k skupnemuantimelanogenodejavnost [40].

Ogrevanje odsladki korenekstrakt je povečal številčnost antioksidantnih fenolnih spojin, kot je ISL, in to povečanje je bilo povezano s povečanoantioksidantdejavnosti (ABTS plus in DPPH). Segret ekstrakt sladkega korena (WH-130) je prav tako pokazal povečano inhibitorno aktivnost TYR in zmanjšano sintezo melanina. Obstaja nov trend v razvoju naravnih materialov zaradi možnosti varnosti. Sladki koren se uporablja v kozmetičnih kremah za hiperpigmentacijo [41]. Pokazali smo potencial Wongama kot novegabeljenje kožesredstvo za uporabo v kozmetiki in preverjeno, da lahko toplotna obdelava izboljša njegov potencial.

Glycyrrhiza uralensis Fischer (sladki koren) deluje antioksidativno in UV-fotoprotektivno v človeških dermalnih fibroblastih [22]. Vendar pa je treba študije primerjave med Wongamom (sladki koren) in drugimi avtohtonimi vrstami opraviti pozneje. Poleg tega je treba z ustreznimi metodami opraviti nadaljnje študije o neidentificiranih sestavinah Wongama, kot sta glabrene in glabridin, povezanih z njegovim antimelanogenim učinkom. Po analizi sestavin v ekstraktu sladkega korena je treba raziskati sinergistične ali antagonistične učinke med fenolnimi spojinami [40]. Preučiti, kako te snovi delujejo naantioksidantin antimelanogene mehanizme, je treba ovrednotiti prenos vodikovega atoma ali sisteme prenosa enega elektrona in signalne poti protein kinaze, aktivirane z mitogenom [32,37].

5. Sklepi

V tej študiji smo raziskali potencial izvlečkov Wongam, nove sortesladki koren, kotbeljenjesredstva za uporabo v kozmetiki in vpliv toplotne obdelave na njihovo bioaktivnost. Izvlečki Wongam (WC in WH-130) so pokazali visoko aktivnost lovljenja radikalov in zavirali sintezo melanina v melanocitih, ki jih povzroča IBMX, tako da so zavirali aktivnost TYR. Toplotna obdelava je povečalaantioksidantin antimelanogene aktivnosti Wongama. Posledično je WH-130 pokazal boljše antioksidativne inantimelanogenoaktivnosti kot WC. Naši rezultati kažejo, da je toplotno obdelan izvleček Wongam (WH-130) močno sredstvo za zmanjševanje pigmentacije z možnimi aplikacijami pri različnih dermatoloških hiperpigmentacijskih motnjah, vključno z rjavimi madeži, pegami in melazmo, in kažejo, da se lahko termična obdelava uporabi za izboljšanje antimelanogeno delovanje sladkega korena.

koristi cistanche tubolosa: beljenje kože