Melatonin iz mikroorganizmov, alg in rastlin kot možna alternativa sintetičnemu melatoninu 1. del

Povzetek: Prehranska dopolnila z melatoninom se široko uporabljajo po vsem svetu, pri čemer so razvite države največji porabniki, z ocenjeno letno stopnjo rasti približno 10 odstotkov do leta 2027, predvsem v državah v razvoju. Široka uporaba melatonina proti motnjam spanja in posebnim težavam, kot je časovni zamik, je bila dodana drugim aplikacijam, kot so proti staranju, proti stresu, aktivacija imunskega sistema, proti raku in drugim, ki so na splošno sprožile njegovo uporabo. brez recepta. Kemična industrija trenutno pokriva 100 odstotkov potreb trga melatonina. Na podlagi sektorjev z bolj naravnimi potrošniškimi navadami se je pred nekaj leti pojavila možnost pridobivanja melatonina iz rastlin, imenovanega fitomelatonin. V zadnjem času je farmacevtska industrija razvila gensko spremenjene mikroorganizme, katerih sposobnost proizvajanja naravnega melatonina v bioreaktorjih je bila okrepljena. Ta članek obravnava vidike kemijske in biološke sinteze melatonina za prehrano ljudi, predvsem kot prehranskega dopolnila. Analizirane so prednosti in slabosti pridobivanja melatonina iz mikroorganizmov ter fitomelatonina iz rastlin in alg ter prednosti naravnega melatonina, s čimer se izognemo neželenim kemičnim stranskim produktom kemične sinteze melatonina. Nazadnje so analizirani ekonomski in kakovostni vidiki teh novih izdelkov, od katerih so nekateri že na trgu.

Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Cistanche feniletanoidni glikozidi imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih se miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in lahko lovi reaktivne kisikove vrste, preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, in ima tudi dober učinek popravljanja poškodb anionov prostih radikalov timina.

Kliknite Cistanche Stranski učinki Reddit

【Za več informacij: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ključne besede: prehranska dopolnila; GSO; melatonin; mikroorganizmi; fitomelatonin; rastlinska surovina

1. Uvod

Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is widely used around the world as a  dietary supplement. In general, melatonin is used as a sleep aid supplement, a mild tranquilizer, a generalist antioxidant, and an anticancer and anti-aging component, among others [1]. According to the American Psychiatric Association (APA), approximately one-third of adults suffer from insomnia during their lifetime [2]. It manifests itself in ongoing problems falling asleep and staying asleep. Therefore, it is very likely that the use of synthetic melatonin will spread. In 2019, the global production of synthetic melatonin,  which was around 4000 tons, accounted for around 1.3 billion USD. This vast market is fully assisted by the chemical melatonin, whose synthesis process is very cheap, effective, and,  therefore, lucrative. The melatonin market is expected to grow at a CAGR (compound annual growth rate) of >10 odstotkov v naslednjih 5 letih. Ob tem precejšnjem povečanju povpraševanja so bile težave z nespečnostjo, ki jih povzroča pandemija COVID-19, zelo pomembne [3]. Daleč največjo porabo ima Severna Amerika, sledi ji Evropa. Svetovni trg melatonina v glavnem nadzoruje nekaj večjih podjetij, kot so BASF, Aspen Pharmacare Australia, Nature's Bounty, Pfizer Inc., Natrol LLC, Aurobindo Pharma in Biotics Research Co. Upoštevajte, da uživanje melatonina v medicinske namene vključuje približno 50 odstotkov proizvedenega sintetičnega melatonina; ostalo se uporablja v kemiji in industriji [2,4].

Biološko je melatonin molekula, ki je široko razširjena v vseh kraljestvih živih organizmov [5]. Odkrit leta 1958 v epifizi krave [6] in kasneje pri ljudeh [7], je ena najbolj raziskanih biomolekul in poznane so njene številne funkcije, predvsem pri sesalcih [8,9], pa tudi pri ribah. [10–12], perutnina [13,14] in nevretenčarji [15]. V živalskih in človeških celicah melatonin deluje kot antioksidant – pomembno vlogo so mu pripisali leta 1993 [16–18]. Melatonin deluje kot zanimiv celični zaščitnik v stresnih situacijah, v različnih fizioloških vidikih pri ljudeh in po številnih študijah koristi izboljšanju različnih bolezni in disfunkcij. Slika 1 prikazuje nekaj zaščitnih in regulacijskih učinkov melatonina pri ljudeh in predstavlja melatonin kot zanimivo pleiotropno molekulo, ki izstopa zaradi svoje pomembnosti, vloge melatonina pri uravnavanju presnove lipidov in glukoze, povzročanju nočne insulinske rezistence in dnevne insulinske odpornosti. občutljivost. Zdi se, da je ta učinek povezan z nočnim postom in dnevnim hranjenjem, kar preprečuje čezmerno povečanje telesne mase [19]. Poudarjamo tudi njegovo vlogo antionkogenega sredstva, ki zavira rast, proliferacijo in metastaze več tumorjev. Zdravljenje tumorjev z melatoninom je izboljšalo občutljivost za kemoterapijo in radioterapijo ter delovalo kot sinergistična molekula pri nadzoru rakavih celic. Poleg tega melatonin blaži akutne poškodbe normalnih celic in jih ščiti pred toksičnostjo zdravil, po možnosti s krepitvijo imunskih odzivov [20–22]. Med motnjami in boleznimi, kjer so preučevali blagodejne učinke melatonina, so nevrološke, kot so Alzheimerjeva, Parkinsonova bolezen, fibromialgija, depresija, motnja pozornosti in hiperaktivnosti, avtizem in migrene; zdravstvene težave srca in ožilja, vključno s hiperholesterolemijo, hipertenzijo, presnovnim sindromom in glikemičnim neravnovesjem; zdravstvene težave prebavil, kot so gastroezofagealni refluks, razjede in sindrom razdražljivega črevesja; imunološke zdravstvene težave, kot so multipla skleroza, avtoimunski odzivi (športni stres, toksični stres, psoriaza itd.), sepsa, COVID-19 itd. [3,23–26]; med drugim tudi osteopenija [27], sarkopenija [28], preeklampsija, plodnost, sindrom policističnih jajčnikov in menopavza [29–32]. Kljub temu, da je melatonin molekula, ki je bila obsežno raziskana od leta 1950, izvedene študije zahtevajo več kliničnih in obsežnih dvojno slepih poskusov, da bi razjasnili njegovo včasih nejasno pleiotropno delovanje [33,34].

Vendar je melatonin dobro znan kot hormon, ki uravnava spanje. Njegove nihajoče ravni v krvnem obtoku glede na obdobja svetlobe in teme (cirkadiani ritmi) zaradi sproščanja melatonina iz epifize so eden najbolj raziskanih in znanih vidikov te molekule. Zvišanje ravni melatonina v krvi v prvem obdobju spanja na približno 150–220 polov/ml vpliva na začetek spanja, zmanjša zakasnitev in fragmentacijo spanja ter poveča trajanje in kakovost spanja [1,35,36]. Melatonin deluje kot notranji sinhronizator cirkadianega cikla spanja in budnosti ter sezonske ritmičnosti. V tem smislu je bilo z melatoninom zdravljenih veliko motenj spanja, vključno s sindromom zakasnjene faze spanja, motnjo spanja v nočnih izmenah, sezonsko afektivno motnjo, motnjami spanja pri slepih in starajočih se ter patofiziološkimi motnjami pri otrocih, z opaznimi izboljšavami kakovosti spanja. 37–41]. Najbolj razširjena motnja, ki se zdravi z melatoninom, je jet lag – defaziranje ritmov spanja in budnosti po čezoceanskih letih [42–45]. Verjetno je poudarek v študijah na njegovi vlogi regulatorja spanja povzročil pomanjkanje študij o njegovi možni vlogi v številnih drugih fizioloških in kliničnih vidikih.

Melatonin v rastlinah, tako imenovani fitomelatonin, so leta 1995 istočasno odkrile tri raziskovalne skupine v različnih rastlinskih materialih [46–48]. Izraz fitomelatonin, ki se nanaša na melatonin rastlinskega izvora (rastlin in alg), se uporablja za razlikovanje od živalskega in/ali sintetičnega melatonina. Ta izraz je zelo razširjen in se nenehno uporablja v študijah fitokemije, rastlinske fiziologije, botanike, živilske kemije itd., o rastlinskem melatoninu. V rastlinah je fitomelatonin tudi pleiotropna molekula, ki ima več vlog v različnih fizioloških odzivih (slika 1). Regulacija vidikov, kot je fotosinteza, vključno z absorpcijo CO2 iz želodca in porabo vode, presnovo ogljikovih hidratov, lipidov, dušika in žvepla ter presnovo preprostih fenolov, flavonoidov in terpenoidov, je pokazala ključno zanimanje za osnovne in tehnične procese vegetacije z melatoninom. (kalitev, rast rastlin, ukoreninjenje, razvejanje itd.) in reproduktivni razvoj, vključno s plodnostjo, partenokarpijo, razvojem semen in plodov, zorenjem, staranjem ter ohranjanjem plodov in rezanega cvetja [49–53]. Na splošno melatonin uravnava te procese z delovanjem mreže rastlinskih hormonov, z uravnavanjem več biosinteznih, katabolnih in transkripcijskih faktorjev, ki so povezani z rastlinskimi hormoni [54–56]. Eden od vidikov največjega agronomskega in biotehnološkega interesa je vloga fitomelatonina kot spodbujevalca tolerance proti biotskim in abiotskim stresom [57–68] (slika 1). Trenutno je fitomelatonin predstavljen kot zanimivo okolju prijazno orodje za nadzor bioloških bolezni in za lažjo odpornost/prilagajanje rastlin na/proti podnebnim spremembam.

2. Biosinteza melatonina

Melatonin je acetilirana spojina, pridobljena iz serotonina. Oba indolična amina se sintetizirata iz aminokisline triptofan po biosintetski poti, ki je bila obsežno raziskana tako pri živalih kot rastlinah [69,70]. V rastlinah se triptofan pretvori v triptamin z encimom triptofan dekarboksilaza (TDC) (slika 2). Triptamin se nato pretvori v 5-hidroksitriptamin (serotonin) s triptamin 5-hidroksilazo (T5H), encimom, ki je bil obsežno raziskan v rižu in bi lahko deloval s številnimi substrati, čeprav tega niso raziskali v globino. Serotonin je N-acetiliran s serotonin N-acetiltransferazo (SNAT). N-acetilserotonin nato metilira acetilserotonin metil transferaza (ASMT) – hidroksi indol-O-metiltransferaza – ki tvori melatonin. V rastlinah lahko metilacijo N-acetilserotonina izvede tudi O-metiltransferaza kofeinske kisline (COMT), razred encimov, ki lahko delujejo na različne substrate, vključno s kofeinsko kislino in kvercetinom [71]. Serotonin se lahko pretvori tudi v 5-metoksi triptamin z ASMT/COMT, da se po delovanju SNAT ustvari melatonin. Ta pot bi se zgodila pri staranju in/ali stresnih situacijah [70,72]. Poleg tega lahko melatonin nastane s tvorbo N-acetil triptamina s SNAT, ki bi ga T5H pretvoril v N-acetilserotonin [73], čeprav ta pot ni bila dokazana, verjetno zato, ker je T5H najmanj raziskan encim poti. (Slika 2). Zanimivo je, da so bili v rastlinah riža identificirani do štirje geni, ki kodirajo histonske deacetilaze (DAC), ki lahko obrnejo korake od serotonina do N-acetilserotonina in od 5-metoksi triptamina do melatonina. DAC, izražen v kloroplastu, je pokazal encimsko aktivnost proti N-acetilserotoninu, N-acetil triptaminu in melatoninu, z najvišjo aktivnostjo deacetilaze za N-acetil tiramin [74].

V živalskih celicah se serotonin tvori iz 5-hidroksitriptofana po zaporednem delovanju triptofan hidroksilaze (TPH) in TDC. Čeprav TPH v rastlinah niso odkrili, prisotnost 5-hidroksitriptofana nakazuje, da nekatera encimska aktivnost, kot je TPH, v rastlinskih celicah deluje v manjši meri. Poleg tega lahko melatonin nastane s tvorbo 5-metoksi triptamina, predvsem v stresnih razmerah, kot predlaga več avtorjev, kar nakazuje, da lahko pot biosinteze melatonina sledi različnim alternativnim potem v primerjavi z živalskimi celicami, z večjo sposobnostjo prilagajanja na presnovne spremembe v rastlinah [72,75]. Vsi imenovani encimi so bili odkriti in karakterizirani v rižu in Arabidopsisu, razen TPH, ki je dobro znan pri živalih, ne pa tudi pri rastlinah. Kljub temu so nekateri avtorji predlagali, da lahko T5H deluje kot hidroksilaza z nizko substratno specifičnostjo in je sposoben delovati v vseh opisanih korakih hidroksilacije [70,76–79]. To isto široko substratno specifičnost lahko pripišemo tudi encimom SNAT, ASMT in COMT. Intermediati melatonina nastajajo v različnih podceličnih predelih, kot so citoplazma, endoplazmatski retikulum, mitohondriji in kloroplasti, ki določajo nadaljnje encimske korake [80,81].

Pri mikroorganizmih je malo raziskav o poti biosinteze melatonina [82]. Saccharomyces in bakterije (Geobacillus, Bacillus in Pseudomonas) proizvajajo serotonin in melatonin v različnih koncentracijah [83–89]. Poleg tega so nastajanje melatonina dokazali drugi avtorji v kulturah kvasovk Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae in S. uvarum ter bakterij (Agrobacterium, Pseudomonas, Variovorax, Bacillus in Oenococcus) [85,90,91] in prej. pri fotosintetskih bakterijah Rhodospirillum rubrum [92] in Erythrobacter longus [93] ter Escherichia coli [94].

Zdi se, da pri kvasovkah Saccharomyces cerevisiae, za razliko od rastlin in živali, ne pride do biosinteze 5-hidroksitriptofana iz triptofana. Zanimivo je, da se zdi, da je več opisanih stopenj pri S. cerevisiae reverzibilnih, na primer med 5-hidroksitriptofanom in serotoninom, N-acetilserotoninom in melatoninom ter 5-metoksi triptaminom in melatoninom [90,95], kot je podrobno prikazano na sliki 2. V Bacillus amyloliquefaciens SB-9 in Pseudomonas fluorescens RG11, 5- hidroksitriptofan, serotonin in N-acetilserotonin, niso pa zaznali triptamina [85,86]. Tako je bilo za izdelavo seva Escherichia coli, ki proizvaja melatonin, uporabljenih več genov bakterijskega izvora. Na primer, testirali so gen DDC, ki kodira dekarboksilazo aromatske L-aminokisline iz Candidatus Koribacter versatile Ellin 345 in Draconibacterium orientale, in gen AANAT, ki kodira alkilamin N-acetiltransferazo iz Streptomyces griseofuscus [96,97]. Nedvomno so potrebne nadaljnje študije za pojasnitev celotne biosintetske poti melatonina v različnih prokariontskih in evkariontskih mikrobih [82].

3. Biološki melatonin v primerjavi s sintetičnim melatoninom

Sprva so melatonin za eksperimentalne in klinične študije pridobivali iz živalskih virov (predvsem iz epifize in urina), s posledično nevarnostjo prenosa virusa [98,99]. Te tehnike so bile umaknjene, ko je bilo melatonin mogoče pridobiti s kemično sintezo [100]. Trenutno je ves melatonin, ki se uporablja v industrijske in medicinske namene, pridobljen z metodami kemične sinteze. Te metode, ki so v osemdesetih letih predstavljale resne težave, vključno s smrtnimi primeri zaradi prisotnosti stranskih produktov sinteze iz triptofana [101], so danes veliko varnejše in učinkovitejše. Vendar pa so pripravki melatonina opisali prisotnost celega niza nezaželenih stranskih produktov zaradi njihove toksične narave. Slika 3 prikazuje tri najpogosteje uporabljene načine kemične sinteze melatonina in stranskih produktov, ki nastanejo pri njegovi sintezi [102]. Sinteza melatonina iz derivatov triptofana (slika 3, shema A) ustvarja strupene stranske produkte, ki so včasih povzročili pomembne bolezni, kot je sindrom eozinofilije in mialgije [101, 103, 104], medtem ko najnovejše metode (slika 3, shema B) za sinteza melatonina iz ftalimida [105] vzbuja pomembne dvome o toksičnosti več stranskih produktov, ki nastanejo [106]. Poleg tega Fischerjeve indolne reakcije iz alilamina (slika 3, shema C) predstavljajo nevarne in strupene reaktante [107].

Po drugi strani pa je pridobivanje melatonina iz neživalskih bioloških virov predstavljeno kot močna zaveza prihodnosti, ne da bi nadomestil sintetični melatonin, ampak kot bolj naraven dopolnilni in alternativni vir [108].

4. Strategije za pridobivanje biološkega melatonina

Melatonin je prisoten v vseh znanih bioloških vrstah, od prokariontov do evkariontov, vključno s kvasovkami, algami, glivami in rastlinami ter živalmi [80,109–111]. Spodaj so predstavljene metodologije, razvite pri mikroorganizmih in rastlinah kot možnih virih naravnega melatonina.

4.1. Melatonin iz mikroorganizmov

a. Saccharomyces

Prvi pristop k proizvodnji biološkega melatonina je nedavno izvedla skupina danske farmacevtske družbe Novo Nordisk z uporabo gensko spremenjene Saccharomyces cerevisiae (tabela 1, izdelek št. 1). Germann in sodelavci so skonstruirali rekombinantno pot melatonina v sevu kvasovk, ki je vseboval heterologne gene, ki kodirajo več encimov biosinteze melatonina in poti, ki podpirajo kofaktorje [112]. Transgene kvasovke so kodificirale različne gene Rattus norvegicus, Lactobacillus ruminis, Pseudomonas aeruginosa, Homo sapiens, Schistosoma mansoni, Bos Taurus in Salmonella enterica. S hranjenjem kvasovk samo z glukozo in acetil Co-A je proizvodnja melatonina dosegla 14,5 mg·L -1 po 76 urah. Kljub temu pa je po mnenju drugih avtorjev treba obravnavati nekatere težave, kot so visoko kopičenje N-acetilserotonina v celicah kvasovk, neuravnotežena genska ekspresija in identifikacija nekaterih potencialnih toksičnih intermediatov [113].

b. Escherichia coli

V drugem pristopu, tokrat z uporabo transgensko spremenjene kulture Escherichia coli (tabela 1, izdelek št. 2), je Novo Nordisk poročal o biološki proizvodnji melatonina iz heterolognega seva, izdelanega iz rekombinantne E. coli, vključno z več geni, kot je gen TDC iz Candidatus Koribacter versatile, gen SNAT iz Streptomyces griseofuscus in človeški gen ASMT. Poleg tega so bili nekateri geni, povezani s triptofanom, blokirani ali izbrisani, da bi preprečili neželeno zatiranje, degradacijo in izvozni transport [96,97]. Po več izboljšavah seva in hranjenju z mineralnimi solmi, vitamini in antibiotiki so gojene celice proizvedle melatonin pri ~1 g·L −1 z uporabo glukoze kot edinega vira ogljika in do 2 g·L −1 v celicah, hranjenih s triptofanom, z zanemarljivo količino stranskih produktov. Tako so lahko po mnenju avtorjev ti GSO sevi E. coli osnova za prihodnjo biološko komercialno proizvodnjo melatonina z uporabo tovarn mikrobnih celic. Kljub temu je lahko uporaba transgenih organizmov za proizvodnjo snovi za prehrano ljudi problematična, če je cilj približati naravni proizvod občutljivemu potrošniku ali potrošniku proti GSO.

c. Mlečnokislinske bakterije

Melatonin so proizvajali tudi industrijsko z mikrobno fermentacijo, kot je navedeno v [114]. Biosintezo melatonina so usmerjale večsevne mlečnokislinske bakterije, kot je Lactobacillus sp. (L. brevis, acidophilus, bulgaricus, casei subspecies. sake, fermentum, helveticus subspec. jogorti, plantarum); Bifidobacterium sp. (B. breve spp. breve, longum spp. infantis); Enterococcus sp. (E. faecalis TH10); in Streptococcus thermophilus. Izdelke, izdelane po tej tehnologiji, trži Quantum Nutrition Labs (Texas, ZDA) kot Melatonin Drops, Qultured™, ki vsebujejo 8 mg melatonina iz kvasa (tabela 1, izdelek št. 3).

d. Chlorella

Izdelek iz alg je Herbatonin® (Tabela 1, izdelek št. 4), formuliran v tabletah, ki vsebujejo 0.3 ali 3 mg fitomelatonina, čeprav se v Evropi trži v odmerkih 0.3 in 1,9 mg, v skladu z zakonodajo EU. Ta formulacija vsebuje več rastlinskih vrst, kot sta riž (Oryza sativa L.) in lucerna (Medicago sativa L.), skupaj z zeleno algo Chlorella pyrenoidosa in C. vulgaris. Naši podatki kažejo, da te mikroalge niso vsebovale več kot 2–15 ng·g DW−1 [115], spremljevalne rastlinske vrste pa vsebujejo zelo nizke ravni fitomelatonina, 1–5 ng·g−1 v rižu in 16 ng·g −1 v lucerni [116]. Prisotnost Chlorelle nakazuje, da se fitomelatonin v glavnem pridobiva z gojenjem zelenih alg v bioreaktorjih, po možnosti hranjenih s prekurzorji, kot je triptofan, na podoben način kot v Achillea millefolium [117], čeprav ni objavljenih podatkov o metodi pridobivanje teh izvlečkov, bogatih s fitomelatoninom, samo njihovo biokemijsko karakterizacijo [118]. Prav tako ni podatkov o nadzoru prisotnosti cianotoksinov v teh izvlečkih zaradi možnih kontaminacij s cianobakterijami (modrozelene alge). Ti cianotoksini imajo med drugim številne neželene učinke, povezane z rakotvornostjo, hepatotoksičnostjo in nevrotoksičnostjo. Tako odkrivanje cianotoksinov v nekaterih prehranskih dopolnilih iz alg krepi potrebo po boljšem nadzoru kakovosti [119,120].

【Za več informacij: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】