Melatonin preprečuje infiltracijo T-limfocitov v ledvice hipertenzivnih podgan, ki jo povzroča prehrana z veliko soli, s preprečevanjem izražanja kemokinov liganda CXCR3
Mar 14, 2022
Za več informacij:ali.ma@wecistanche.com
Ariel Bier1, Rawan Khashab2, Yehonatan Sharabi1,2,3, Ehud Grossman1,2,3in Avshalom Leibowitz1,2,3,*
1Medicine D, Medicinski center Chaim Sheba, Tel-Hashomer 5262000, Izrael; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (npr.)2 Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com3Medicinska fakulteta Sackler, Univerza Tel Aviv, Tel Aviv 6997801, Izrael*
Povzetek: V prejšnji študiji smo to dokazalimelatoninpreprečujeledvicapoškodbe v modelu hipertenzije, ki jo povzroča sol, z zmanjšanjem oksidativnega stresa. Domnevali smo, da ta učinek vključuje imunomodulatorne lastnosti melatonina. Študija in vivo - Dahlove podgane, občutljive na sol (DSS), so bile hranjene z običajno hrano, dieto z veliko soli (HSD) ali HSD inmelatonin(30 mg/kg/dan) v njihovi vodi osem tednov.Ledviceso bili pobrani za takojšnjo izolacijo in karakterizacijo limfocitov s pretočno citometrijo (CD3 plus CD4 plus in CD3 plus CD8 plus ) in za limfocitni kemoatraktant (predvsem CXCLkemokini) študije izražanja genov. In vitro študija - podgane, mezangialne celice (RMC) so bile gojene v mediju z visoko vsebnostjo soli brez in zmelatonin. HSD je bil povezan s pomembno renalno filtracijo CD4 plus in CD8 plus T limfocitov v primerjavi s kontrolo. Melatonin je znatno zmanjšal infiltracijo ledvičnih limfocitov. HSD je znatno povečal ekspresijo mRNA CXCLkemokini.Dodajanje melatonina v HSD je ta učinek odpravilo. Obdelava celic RMC s soljo je povečala izražanje CXCL10 in CXCL11, ne pa tudi CXCL9. Dodajanjemelatoninkulturnim medijem preprečilo to povečanje. Zdravljenje podgan, hranjenih s HSD, z melatoninom je zmanjšalo izražanje kemoatraktantne mRNA ledvičnih limfocitov in je povezano z znatnim zmanjšanjem ledvične infiltracije limfocitov T. Sol ima lahko neposreden učinek na ledvične celice, ki proizvajajo kemokine, kar je zmanjšano z zdravljenjem z melatoninom.
Ključne besede:melatonin; sol; T-limfociti; hipertenzija;ledvica; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11
1. Uvod
Hipertenzija (HTN) je vodilni spremenljivi dejavnik tveganja za srčno-žilne bolezni. Zaradi staranja prebivalstva prevalenca HTN vztrajno narašča in v napredovalih doseže do 30 odstotkov [1]. Kljub različnim medicinskim terapevtskim možnostim je nadzor nad HTN po vsem svetu slab. Posledice nenadzorovanega HTN so uničujoče in povzročajo velik negativen vpliv na javno zdravje [2].
V patogenezo HTN so vpleteni različni vedenjski, okoljski in genetski dejavniki. Visoka vsebnost soli v zahodnih dietah je bila vpletena v glavni dejavnik HTN in je povezana s povečano obolevnostjo in umrljivostjo. Smernice in javne pobude priporočajo zmanjšanje vnosa soli za splošno populacijo. Vendar ta omejitev morda ne bo koristila vsem posameznikom, saj patofiziologija, ki povezuje občutljivost na sol in HTN, ni popolnoma razumljena in potrebuje izboljšano mehanično razumevanje [3]. Tako so nove strategije ključne za boljše razumevanje in nadzor HTN, zaradi česar so nove raziskovalne paradigme takojšnja potreba.
Ugotovljeno je bilo, da sta vnetje in oksidativni stres vpletena v patogenezo esencialne HTN. Med raziskovanjem sprožilcev, ki sprožijo in nadaljujejo te procese, številni eksperimentalni modeli HTN kažejo na vpletenost adaptivnega imunskega odziva [4].
Kliknite zaKoristi in neželeni učinki Cistanche za delovanje ledvic
Namigi, ki povezujejo adaptivno imunost z HTN, obstajajo že od šestdesetih let prejšnjega stoletja. Vendar pa je šele v zadnjem času z boljšim razumevanjem imunskega sistema mogoče doseči napredek v tej smeri. Pionirska študija Guzik et al. dokazali, da je angiotenzin (Ang) II ali deoksikortikosteronska (DOC) sol HTN oslabljena pri miših rag1-/-, ki imajo pomanjkanje limfocitov T in B, in posvojitveni prenos celic T, ne pa celic B, bi lahko obnovil odziv BP [5]. Od tega dokumenta je bilo ugotovljeno, da so različne komponente posvojitvene imunosti pomembne za patogenezo HTN v večini običajnih živalskih modelov. Vloga celic T v modelu HTN, ki ga povzroči sol, je bila prav tako obsežno raziskana. Študije in vitro kažejo, da lahko sol potisne naivno diferenciacijo celic T v celice TH17 [6]. Številna dela in vivo na modelih HTN, povzročenih z dieto z visoko vsebnostjo soli (HSD), kot so podgane, občutljive na sol Dhal (DSS), kažejo obsežno infiltracijo ledvičnih celic T [7–9].
Med mnogimi fiziološkimi procesi,melatoninasodelovanje pri uravnavanju krvnega tlaka je nekoliko intuitivno. Cirkadiani vzorec krvnega tlaka spodbuja obsežne raziskave o melatoninu in HTN. Številna dela v preteklosti, pri ljudeh in na eksperimentalnih modelih, so povezovala nizke ravni melatonina z HTN [10]. Obstaja nekaj kliničnih podatkov, ki kažejo, da lahko dodatek melatonina zdravi HTN, predvsem pri bolnikih z nočno HTN [11]. Nedoslednost teh podatkov pa postavlja vprašanja, ali so necirkadiane lastnosti melatonina vključene tudi v uravnavanje krvnega tlaka.
Protivnetne in antioksidativne lastnosti melatonina kažejo na interakcijo melatonina z imunskim sistemom. Nastajajoči podatki kažejo na vlogo signalizacije melatonina pri razvoju, aktivaciji, diferenciaciji in spominu celic T. Obstajajo dokazi, damelatoninna celicah T so prisotni membranski in jedrski receptorji [12,13].Melatoninvpliva na proizvodnjo številnih citokinov, ki sodelujejo pri imunskem odzivu, kot je interferon (IFN), ki je glavni regulator odziva Th1 [14].
Oksidativni stres in T-celični odziv po mnenju nekaterih raziskovalcev delujeta usklajeno in spodbujata razvoj HTN in hipertenzivne poškodbe organov [15]. V prejšnjem delu smo to dokazalimelatoninzmanjša lokalni (ledvični) oksidativni stres in prepreči s soljo povzročeno ledvično fibrozo in proteinurijo v na sol občutljivem modelu podgan HTN (model DSS) [16]. Ker ima oksidativni stres ključno vlogo pri adaptivnem imunskem odzivu, povezanem s HTN, smo domnevali, da so imunomodulatorne lastnosti melatonina odgovorne za njegovo zaščitno vlogo pri HTN, ki ga povzroči HSD.
Cilj te študije je oceniti, alimelatoninzmanjša odziv celic T, ki ga povzroči sol, in pojasniti mehanizme, odgovorne za ta učinek.
2. Materiali in metode
2.1. Živali in protokol študije
Protokol študije je odobril institucionalni odbor za etiko živali v medicinskem centru Sheba v Izraelu. Njihovo zdravstveno stanje smo spremljali z merjenjem telesne teže in vsakodnevnim splošnim opazovanjem gibanja in zdravstvenega stanja za vsako žival. Samci Dahlovih podgan, občutljivih na sol, stari štiri tedne (RGD Kat. št. 1582190, RRID: RGD_1582190), so bili nastanjeni v objektu za živali v navadnih kletkah (dve podgani na kletko) pri 22 ◦C s ciklom 14 svetil/10 ur teme. Podgane so vzdrževali na običajni dieti s soljo in jim dajali vodo iz pipe, da so pile ad libitum v obdobju prilagajanja pet dni. Podgane so bile nato razdeljene v tri skupine (n=8) glede na prehrano v obdobju 8 tednov. Po mnenju komisije za etiko naj bi bile živali, ki so kazale znake bolezni in trpljenja, žrtvovane.
Kontrolna skupina je bila hranjena s standardno hrano za podgane (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, ZDA) in vodo iz pipe; skupina z visoko vsebnostjo soli (HSD) je bila hranjena z ustrezno obogateno hrano s soljo (4 odstotki) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, ZDA) in vodo iz pipe, inmelatoninskupina je bila hranjena z enako obogateno hrano s soljo (4 odstotki) z melatoninom (M5250; Sigma, Rehovot, Izrael) (30 mg/kg/dan) v njihovi pitni vodi. Občasno so merili telesno težo in porabo vode. Ustrezna količina melatonina je bila raztopljena v ustrezni količini vode za vsako kletko, da se zagotovi pravi odmerek za vsako žival. Dan nič je definiran kot dan začetka HSD in uživanja melatonina. Na koncu študije so bile podgane žrtvovane z globoko anestezijo s 3-odstotnim izofluranom (globina anestezije potrjena s stiskanjem zadnje noge) inledviceso bili pridelani. Obe ledvici sta bili odstranjeni in hemisicirani. Ledvice so bile vzete za analizo s pretočno citometrijo, razen več delov, ki so bili hitro odstranjeni in na hitro zamrznjeni v tekočem N2 ter shranjeni pri –80 ◦C. Za ekstrakcijo RNK so uporabili zamrznjena tkiva.
Cistanche - simptomi bolezni ledvic
2.2. Kvantitativna reverzna transkripcija PCR v realnem času
Ravni ekspresije mRNA genov so bile ugotovljene vledvicatkiva s kvantitativno reverzno transkriptazo-PCR v realnem času (qRT-PCR). Celotno RNK smo ekstrahirali iz ledvičnega tkiva z uporabo kompleta NucleoSpin RNA (MACHERY-NAGEL, Düren, Nemčija). Reverzno transkripcijo smo izvedli z uporabo kompleta Applied Biosystems High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Reakcije qRT-PCR so bile izvedene z uporabo Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) in Applied Biosystems 7500 sistema PCR v realnem času. Pogoji kroženja so bili: prvi posamezen korak pri 95 ◦C za 0.20 min in nato 40 ciklov stopnje taljenja za 3 s pri 95 ◦C in podaljšana stopnja 30 s pri 60 ◦C. Na koncu 40 ciklov je bila izvedena krivulja taline. Kot notranja kontrola je bila uporabljena mRNA podenote stranskega stebla ribosomskega proteina P0 (Rplp0). Primerji so navedeni v tabeli 1.
Tabela 1. Seznam primerjev za podgane, uporabljenih v tej študiji.
2.3. Izolacija T celic iz ledvic
Po odstranitvi ledvične kapsule staledviceso bile zdrobljene in dražene z batom 2 ml brizge skozi celično cedilo 100 µm v RPMI 1640, ki vsebuje 2 mML-glutamina, 10 odstotkov FBS, 10 ug/ml DNaze 1 (tehnologije matičnih celic, Cambridge, MA , ZDA) in 0,1 odstotka kolagenaze tipa IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, ZDA). Raztopino smo inkubirali 25 minut pri 37 ◦C. Homogenatu ledvic smo nato dodali raztopino za izpiranje (DPBS/2 % FBS/2 mM EDTA), da smo dosegli 45 mL, in jo filtrirali skozi 70 µm celično cedilo. Raztopino smo centrifugirali pri 400 × g/7 min. in pelet smo suspendirali v 5 ml raztopine za izpiranje in filtrirali skozi 40 µm celično cedilo ter ponovno centrifugirali pri 400 × g/7 min. Pelet smo resuspendirali v 3 ml FBS (10 mM EDTA) in nanesli na Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Izrael) in centrifugirali pri 20 ◦C pri 400 × g/30 min z izklopljeno zavoro. Plast mononuklearnih celic, ki leži nad Histopaque, je bila odstranjena, dvakrat sprana z raztopino za izpiranje in suspendirana v 5 ml raztopine za izpiranje za pretočno citometrično analizo.
2.4. Pretočna citometrija
Iz vsake skupine,ledviceod 5–7 podgan so analizirali. Za vsak vzorec je bilo vzetih 1 × 106 celic. Izolirane mononuklearne celice smo inkubirali z zunajceličnimi markerji: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) in njegovo izotipsko kontrolo (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) in nadzor njegovega izotipa (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) in nadzor njegovega izotipa (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB _657914). Vse celice so bile analizirane s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) z uporabo programske opreme FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).
Cistanche-delovanje ledvic
2.5. Celična kultura
Mezangialna podganja celična linija, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), je bila pridobljena od ATCC®. Celico smo gojili v Dulbeccovem modificiranem gojišču Eagle (01-055-1A, biološka industrija, Beit HaEmek, Izrael) s 4 mM L-glutaminom, prilagojenim tako, da vsebuje 1,5 g/L natrijevega bikarbonata in 4,5 g/L glukoze ter dopolnjenim z 0,4 mg/mLG418 in 15 odstotkov fetalnega govejega seruma. Melatonin je bil pridobljen pri Sigmi (M5250 Rehovot, Izrael). 250 mMmelatoninzaloga je bila narejena v etanolu. Celice smo gojili v normalnih pogojih ali pogojih z visoko vsebnostjo soli (z dodajanjem 80 mM NaCl v medij) brez ali z melatoninom (0,5 mM). Obdelava z melatoninom je bila časovno določena 45 minut pred dodajanjem NaCl v medij. Vsi poskusi so bili na ploščah s 6 vdolbinicami s 3 × 105 celicami na vdolbinico in izvedeni s 6 neodvisnimi poskusi.
2.6. Statistična analiza
Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Statistične analize so bile izvedene z uporabo IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Enosmerna analiza variance (ANOVA) in posthoc Tukeyjeva metoda sta preučevali razlike med skupinami. Podatki qPCR v realnem času so bili analizirani z uporabo DataAssist, RRID: SCR_014969.
3. Rezultati
3.1. Melatonin ščiti podgane, ki uživajo HSD
Starost podgan med to študijo je bila 4–13 tednov. Pri tej starosti se dobro počutje podgan kaže s povečanjem telesne mase, ki ga je pokazala kontrolna skupina [17]. Vendar pa je skupina HSD dosegla plato na 30. dan in dodatekmelatoninna HSD je ta pojav izboljšal (slika 1A). Skupina HSD je pokazala visoko stopnjo umrljivosti, kjer je 50 odstotkov podgan med poskusnim obdobjem poginilo ali imelo klinično stanje, ki je zahtevalo evtanazijo v skladu s pravili odbora za etiko živali. Melatoninski dodatki so znatno preprečili umrljivost podgan, kjer je samo ena od osmih podgan poginila 58. dan, ob koncu poskusnega obdobja (slika 1B).
Slika 1.Melatoninizboljšan krvni tlak in preživetje pri HSD. DSS Podgane so bile 9 tednov zdravljene s HSD z melatoninom in brez njega. Prehrana z veliko soli je zmanjšala telesno težo od 36. dne naprej, melatonin pa je ublažil ta učinek (A). HSD je povečal stopnjo umrljivosti od 4. dne0. Zdravljenje HSD-fedratov z melatoninom izboljša njihovo preživetje. (B). (n=8) *-p Manjše ali enako 0.05 sol in sol plus melatonin proti kontroli. #-p Manj kot ali enako 0,05 soli v primerjavi s kontrolo in soljo plus melatonin. HSD – dieta z veliko soli.
3.2. Melatonin preprečuje infiltracijo T-celic ledvic, ki jo povzroči HSD
Izolirali smo celice izledvicain jih povezal z markerjem celic T, CD3. Celice CD3 plus so bile povezane s CD4 in CD8. Tako CD3 plus CD4 plus kot CD3 plus CD8 plus sta bila bistveno višja pri HSD (5,18 ± 1,62 oziroma 4,6 ± 0.75 odstotkov) v primerjavi s kontrolo (0.16 ± {{18} }.{{20}}2 oziroma 0,95 ± 0,15 odstotka) inmelatonindodajanje HSD je zmanjšalo celice CD3 plus CD4 plus in CD3 plus CD8 plus nazaj na kontrolne ravni (0.68 ± 0.21 oziroma 1,37 ± 0.45) (slika 2A–D).
Slika 2. Melatonin preprečuje infiltracijo celic T vledvica. Celice T so bile izolirane iz podganjih ledvic in so bile odkrite za CD3. CD3-pozitivne celice so bile preverjene za CD4 in CD8. Melatonin (C) je zmanjšal CD3 plus CD4 plus in CD3 plus CD8 plus v primerjavi s HSD brez melatonina (B) brez razlike od kontrolne skupine (A). Analiza za vse podgane je prikazana v (D) (n=7–8). HSD – dieta z veliko soli. *-p Manjše ali enako 0.05 v primerjavi s kontrolo. #-p Manjše ali enako 0,05 v primerjavi s soljo in melatoninom.
3.3. Melatonin zmanjša nekatere hemokine v ledvicah, ki so bili povečani pri HSD
Pridobivanje celic T v vnetna tkiva uravnava lokalna ekspresija kemokinov. Zato smo izmerili izražanje dveh družin kemokinov pri podganahledvice: družina ligandov kemokinov (CXC motiv) (CXCL) in družina ligandov kemokinov (C-Cmotif) (CCL).
Za družino CXCL so bili CXCL 9, 10 in 11, ki pritegnejo celice T v njihovo ciljno tkivo z uporabo receptorja CXCR3 na celicah T, pri podganah HSD znatno povečani. Dodatek kmelatoninna HSD zmanjšalo njihovo izražanje nazaj na kontrolne ravni. Enak vzorec je bil zaznan za CXCL 1 in 16. Vendar pa za CXCL12 ni bila zaznana nobena regulacija v HSD (slika 3A).
Za družino CCL CCL 2, 4, 12, 17, 19 in CX3CL1 niso pokazali povečane regulacije HSD. CCL3 je bil povečan pri HSD, vendar z dodajanjem melatonina v prehrano niso odkrili pomembne spremembe. Za CCL7, znatno povečanje regulacije v HSD in znatno znižanje regulacije z dodatkommelatoninna HSD (slika 3B).
Slika 3. Regulacija navzgorledvičnakemokiniv HSD z in brez melatonina. Pri podganah so določili izražanje družine ligandov kemokinov (motiv CXC) (CXCL) (A), družine ligandov kemokinov (motiv CC) in CX3CL1 (B). (n=7–8) *-p Manjše ali enako 0.05 v primerjavi s kontrolo. #-p Manj ali enako 0,05 v primerjavi s soljo in melatonizacijo. HSD – dieta z veliko soli.
3.4. Neposredni učinek melatonina na mezangialno celično linijo RMC
Nato smo se osredotočili na CXCL9, 10 in 11, ki privlačijo celice T z vezavo na receptor CXCR3. Določili smo izraznost tehkemokiniv celicah RMC, ki so podganja mezangialna celična linija.
Celice smo tretirali z 80 mM NaCl brez in z 0,5 mMmelatonin. Ta koncentracija NaCl je znatno povečala izražanje CXCR10 za 2,4 ± 0.26-krat v primerjavi s kontrolo, dodatek 0.5 mM melatonina pa se je znatno zmanjšal ta izraz na 1,4 ± 0.{{10}}krat v primerjavi s kontrolo (slika 4A). Za CXCL11 je 80 mM NaCl znatno povečalo izražanje za 3 ± 0.48-krat v primerjavi s kontrolo, dodatek 0,5 mM melatonina pa je znatno zmanjšal izražanje na 1,8 ± 0.{{22 }}krat v primerjavi s kontrolo (slika 4B). CXCL9 ni bil odkrit v celicah RMC.
Slika 4. Sol poveča ekspresijo CXCL10 in CXCL11 v mezangialni celični liniji, kjer je zdravljenje z melatonom zmanjšalo njeno ekspresijo. RMC (mezangialna celična linija podgan) smo obdelali s soljo 80 mM z in brez 0,5 mM melatonina. CXCL10 (A) in CXCL11 (B) sta bila regulirana navzgor z obdelavo soli in dodatkommelatoninzmanjšati to regulacijo. Grafi predstavljajo 6 neodvisnih poskusov. *-p Manjše ali enako 0.001 v primerjavi s kontrolo #-p Manjše ali enako 0.005 v primerjavi s soljo 80 mM in melatonin 0,5 mM. $-p Manjše ali enako 0,05 v primerjavi s soljo 80 mM in melatoninom 0,5 mM.
4. Razprava
Blagodejni učinekmelatoninna HTN je bilo dokazano v prejšnjih študijah in je bilo predlagano kot možen način ukrepanja za na zdravljenje odporno HTN [18]. V naši prvi študiji smo se osredotočili na oksidativni stres in razkrili, da melatonin zmanjšuje oksidativni stres, ki ga povzroča HSD. V tej študiji smo se osredotočili na adaptivni imunski učinek in pokazali, da melatonin izboljša preživetje podgan, hranjenih s HSD. Ta učinek je povezan z zmanjšanjem števila celic T, ki se infiltrirajo v ledvice, in zmanjšano regulacijoledvicaizražanje kemokinov.
Zgodovinski podatki kažejo, da podgane DSS, ki uživajo HSD, razvijejo hudo HTN in imajo višje stopnje umrljivosti [19]. Sam Dahl je med vzpostavljanjem modela poročal, da so podgane DSS ob odstavitvi (21–23 dni starosti) dali na HSD (8 odstotkov NaCl) hitro razvile HTN in vse poginile do 16. tedna hranjenja s soljo [20]. Lateron, po nekaterih modifikacijah seva, Rapp et al. so poročali, da so bile vse podgane mrtve v osmih tednih po HSD (8 odstotkov NaCl) [21]. Podgane v naši študiji so imele visoko stopnjo smrtnosti, vendar niso dosegle 100 odstotkov, verjetno zaradi nižjega odstotka (4 odstotke) soli v njihovi prehrani. Kljub temu je očitno, damelatonindopolnjevanje je bistveno preprečilo umrljivost podgan.
Pridobivanje teže je pokazatelj dobrega počutja podgan v starosti 4–13 tednov. Podgane DSS izvirajo iz Sprague Dawley, ki je dobro označena vrsta. Pri starosti podgan, ki smo jo uporabili v naših poskusih, naj bi podgane dosledno pridobivale težo [22]. V mnogih študijah na živalih je zmanjšanje telesne teže ena od "končnih točk" poskusov [23]. Iz več študij je razvidno, da HSD pri podganah DSS povzroči manjšo stopnjo povečanja telesne mase v primerjavi s kontrolami [24, 25]. V skladu s temi študijami smo opazili tudi razlike v teži med skupinama. Tu se podgane po štirih tednih HSD niso zredile. Melatonin je ustavil tudi ta učinek HSD, saj so podgane, ki so bile zdravljene z melatoninom, še naprej pridobivale na teži, čeprav manj kot kontrolne skupine.
Sposobnostmelatoninza znižanje krvnega tlaka na živalskih modelih so odkrili v poznih sedemdesetih letih 20. stoletja [26–28]. Od takrat so poročali v več drugih modelih, na primer, da dieta z visoko vsebnostjo fruktoze povzroči presnovni sindrom pri spontano hipertenzivnih podganah [29, 30]. Naše študije na tem področju so prve, ki so pokazale, da ima melatonin vlogo pri HTN, ki jo povzroča sol, saj preprečuje poškodbe organov in zmanjšuje umrljivost.
V tej študiji smo pokazali, da HSD inducira infiltracijo T limfocitov vledvica, proces, ki ga je pri podganah DSS opisala predvsem Mattsonova skupina [31–33]. Ključno vlogo tega procesa infiltracije v modelu DSS je pokazala nedavna študija, ki je ugotovila, da so podgane DSS s pomanjkanjem celic T zaščitene pred HTN, ki ga povzročata HSD in prenos splenocitov, poslabša na sol občutljivo HTN [34].
Melatonin lahko vpliva na celice T v različnih vidikih (za pregled glej [35]). Ta študija je to prvič pokazalamelatoninzmanjša privlačnost T-celic CD4 plus in CD8 plus zaledvicav HSD. Ta učinek melatonina je lahko mehanizem, ki poudarja njegov koristen učinek v tem modelu.
Sposobnost melatonina, da zmanjša infiltracijo celic T, je bila opisana v eksperimentalnem modelu miši z avtoimunskim encefalomielitisom (EAE). Pri EAE je bilo dokazano, da melatonin zmanjša infiltracijo celic CD4 plus T in celic Th17 v CNS [36,37].
Privlačnost celic T na določeno tkivo v glavnem uravnavajo lokalne visoke koncentracijekemokiniki so kemotaktični citokini, ki nadzorujejo migracijske vzorce in položaj imunskih celic. Dve veliki družini kemokinov, ki inducirata infiltracijo celic T, sta družini kemokinov liganda motiva CXC (CXCL) in liganda motiva CC (CCL) [38].
Cistanche za izboljšanje ledvične disfunkcije
V naši študiji nismo našli stalnega vzorca v odzivu družine CCL na HSD in namelatonin. Od devetihkemokiniv tej družini so opazili, da sta samo CCL7 in CLL21 povečala izražanje zaradi HSD, dodatek melatonina pa ga je zmanjšal. HSD je povečal izražanje CCL3, vendar pri podganah, zdravljenih z melatoninom, niso zaznali zmanjšanja. Nedavna študija na istem modelu je pokazala, da HSD poveča CCL2 vledvicaz uporabo metode RNA-Seq [39]. Vendar pa je ta študija testirala ravni 3. in 21. dan po začetku diete. V naši študiji smo testirali ravni po osmih tednih. Možno je, da se izražanje kemokinov med obdobjem HSD spremeni.
Nasprotno pa so se ravni večine družine CXCL, vključno s CXCL 1, 9, 10, 11 in 16, povečale pri podganah, zdravljenih s HSD, inmelatoninsamo CXCL12 ni pokazal povečanja odziva na HSD.
CXCL9, CXCL10 in CXCL11, imenovani "ligandi CXC kemokinskega receptorja 3, inducibilni z interferonom", inducira IFN- in so ligandi CXC kemokinskega receptorja 3 (CXCR3). Študije in vivo so pokazale njihov pomen pri aktivaciji in rekrutiranju limfocitov T v ciljni organ [40–42]. Youn et al. je pri ljudeh s hipertenzijo pokazala ledvično infiltracijo celic T in povišane ravni vseh treh CXCR3 v obtoku.kemokini, kar kaže, da so CXCR3 in njegovi ligandi pomembni za celice T, ki sodelujejo pri človeški HTN [43]. Druga študija je pokazala, da je CXCL10 povišan pri hipertenzivnih bolnikih, njegove ravni pa so povezane z njihovimi vrednostmi krvnega tlaka [44].
Zaradi teh študij smo se osredotočili na CXCL9, CXCL10 in CXCL11. Vzgojili smo mezangialno celično linijo podgan in jih obdelali z 80 mM NaCl in 0,5 mM melatonina. Ugotovili smo, da sta CXCL 10 in 11 regulirana navzgor v celicah in melatonin odpravi to zvišanje. Naši rezultati kažejo, da je učinek soli na zvišanje CXCL 10 in 11 ter nasprotni učinekmelatonin, sta bila oba neposredno odkrita v mezangialnih celicah. V nasprotju s tem CXCL9 v teh celicah ni bil odkrit.
Naša študija ima omejitve. V naših rezultatih FACS je bilo veliko CD3 plus dvojno negativnih za CD4 in CD8. Enake rezultate je pokazala Mattsonova študija iz leta 2010 [31]. Vendar pa je bilo v novejših študijah Mattsonove skupine celic CD3 plus CD4-CD8- zelo malo [32,33,45,46]. Znatno zmanjšanje števila dvojno negativnih celic CD3 bi lahko bilo posledica dodajanja markerja CD45 in samo analize celic, ki so bile pozitivne na CD45, kar je bilo izvedeno v kasnejših študijah Mattsona. Možno je, da je velika populacija CD3 plus CD4-CD8- artefakt. Vendar za celično populacijo CD3 plus CD4 plus in CD3 plus CD8 plus ni znan artefakt.
5. Sklepi
Skratka, dieta z veliko soli je povezana z infiltracijo celic T vledvicepodgan DSS. Sol je tudi povečala izražanje specifičnih kemoatraktantov celic T v ledvicah. Zdravljenje zmelatonin(30 mg/kg/dan) odpravilo te učinke (melatoninzmanjša s HSD povzročeno infiltracijo celic T v ledvice skupaj z zmanjšanjem ekspresije kemokina liganda CXCL3).
Naša študija in vitro dokazuje, da lahko sol in melatonin uravnavata izražanje kemoatraktantov z neposrednim vplivom naledvicacelice.
Avtorski prispevki: Conceptualization, AL; formalna analiza, AB in RK; preiskava, RK;metodologija, AB in AL; pisanje—izvirni osnutek, AB in AL; pisanje—recenzija in urejanje, YS in EG Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.
Financiranje: Ta raziskava ni prejela zunanjega financiranja.
Izjava institucionalnega nadzornega odbora: Protokol študije je odobril institucionalni odbor za etiko živali v medicinskem centru Sheba, protokol št. 1219/19/ANIM in protokol št. 16418 Ministrstva za zdravje.
Izjava o informiranem soglasju: Ni primerno.
Izjava o razpoložljivosti podatkov: Podatki, predstavljeni v tej študiji, so na voljo na zahtevo ustreznega avtorja.
Zahvala: Avtorji se zahvaljujejo Zehavi Shabtai za njeno odlično tehnično podporo in Michaelu Kanovskemu za njegove uredniške storitve.
Nasprotje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.
Reference
1. Olsen, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Burger, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP; Hering, D.; et al. Poziv k ukrepanju in strategija življenjskega poteka za obravnavo globalnega bremena povišanega krvnega tlaka za sedanje in prihodnje generacije: Lancetova komisija o hipertenziji. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [CrossRef]
2. O'Brien, E. Komisija Lancet o hipertenziji: obravnava globalnega bremena povišanega krvnega tlaka za sedanje in prihodnje generacije. J. Clin. Hypertens 2017, 19, 564–568. [CrossRef]
3. O'Donnell, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Vnos natrija in zdravje srca in ožilja. Circ. Res. 2015, 116, 1046–1057. [CrossRef]
4. Schiffrin, EL Mehanizmi preoblikovanja majhnih arterij, antihipertenzivna terapija in imunski sistem pri hipertenziji. Clin. Raziskati. Med. 2015, 38, E394–E402. [CrossRef]
5. Guzik, TJ; Hoch, NE; Brown, KA; McCann, LA; Rahman, A.; Dikalov, S.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, DG Vloga celice T pri nastanku hipertenzije, ki jo povzroča angiotenzin II, in vaskularne disfunkcije. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449–2460. [CrossRef][PubMed]
6. Kleinewietfeld, M.; Manzel, A.; Titze, J.; Kvakan, H.; Yosef, N.; Linker, RA; Muller, DN; Hafler, DA Natrijev klorid poganja avtoimunsko bolezen z indukcijo patogenih celic TH17. Narava 2013, 496, 518–522. [CrossRef]
7. Mattson, DL; Lund, H.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Genetska mutacija rekombinacijskega aktiviranja gena 1 pri podganah, občutljivih na sol Dahl, zmanjša hipertenzijo in poškodbo ledvic. Am. J. Physiol. Regul. Celo število. Comp. Physiol. 2013, 304, 407–414.[CrossRef]
8. Mattson, DL Infiltriranje imunskih celic vledvicapri hipertenziji, občutljivi na sol, in okvari ledvic. Am. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]
9. Lu, X.; Crowley, SD Vnetje pri hipertenziji, občutljivi na sol, in poškodbi ledvic. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]
10. Baker, J.; Kempinski, K. Vlogamelatoninpri uravnavanju krvnega tlaka: Dodatno antihipertenzivno sredstvo. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [CrossRef] [PubMed]
11. Grossman, E.; Laudon, M.; Zisapel, N. Vpliv melatonina na nočni krvni tlak: Meta-analiza randomiziranih kontroliranih preskušanj. Vasc. Upravljanje zdravstvenih tveganj. 2011, 7, 577–584. [CrossRef] [PubMed]
12. Požo, D.; Delgado, M.; Fernandez-Santos, JM; Calvo, JR; Gomariz, RP; Martin-Lacave, I.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Ekspresija mRNA receptorja Mel1a-melatonina v T in B podskupinah limfocitov iz podganjega timusa in vranice. Faseb J. Off. Publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466–473. [CrossRef]
13. Guerrero, JM; Požo, D.; García-Mauriño, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR Vključevanje jedrskih receptorjev v povečano proizvodnjo IL-2 z melatoninom v celicah Jurkat. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 917, 397–403. [CrossRef] [PubMed]
14. Farez, MF; Mascanfroni, ID; Méndez-Huergo, SP; Yeste, A.; Murugaiyan, G.; Garo, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patel, B.; Ysrraelit, MC; Zhu, C.; et al.MelatoninPrispeva k sezonskosti recidivov multiple skleroze. Cell 2015, 162, 1338–1352 [CrossRef] [PubMed]
15. Kirabo, A.; Fontana, V.; de Faria, APC; Loperena, R.; Galindo, CL; Wu, J.; Bikinejeva, AT; Dikalov, S.; Xiao, L.; Chen, W.; et al. DC izoketal-modificirani proteini aktivirajo celice T in spodbujajo hipertenzijo. J. Clin. Raziskati. 2014, 124, 4642–4656. [CrossRef][PubMed]
16. Leibowitz, A.; Volkov, A.; Vološin, K.; Shemesh, C.; Barshack, I.; Grossman, E. Melatonin preprečujeledvicapoškodbe v modelu hipertenzije, ki jo povzroča dieta z veliko soli, z zmanjšanjem oksidativnega stresa. J. Pineal Res. 2016, 60, 48–54. [CrossRef] [PubMed]
17. Hawkins, P.; Morton, DB; Burman, O.; Dennison, N.; Poštenost, P.; Jennings, M.; Lane, S.; Middleton, V.; Roughan, JV; Wells, S.; et al. Vodnik za definiranje in izvajanje protokolov za oceno dobrega počutja laboratorijskih živali: enajsto poročilo skupne delovne skupine BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW za izboljšanje. Lab. Anim. 2011, 45, 1–13. [CrossRef]
19. Simko, F.; Reiter, RJ; Paulis, L.Melatoninkot racionalna alternativa pri konzervativnem zdravljenju rezistentne hipertenzije.Hypertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [CrossRef] [PubMed]
19. Rapp, JP Dahl Podgane, občutljive na sol in odporne na sol. Hipertenzija 1982, 4, 753–763. [CrossRef]
20. Dahl, LK; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Učinki kroničnega prekomernega uživanja soli. Modifikacija eksperimentalne hipertenzije pri podganah z variacijami v prehrani. Circ. Res. 1968, 22, 11–18. [CrossRef] [PubMed]
21. Rapp, JP; Dene, H. Razvoj in značilnosti sorodnih sevov Dahlovih podgan, občutljivih na sol in odpornih na sol. Hypertens 1985, 7, 340–349. [CrossRef]
22. Brower, M.; Grace, M.; Kotz, CM; Koya, V. Primerjalna analiza značilnosti rasti podgan Sprague Dawley, pridobljenih iz različnih virov. Lab. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [CrossRef]
23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; van Dijk, RM; Ernst, L.; Häger, C.; Hilgers, SOA; Koegel, B.; Koska, I.; Kuhla, A.; et al. Opredelitev zmanjšanja telesne teže kot humane končne točke: kritična ocena. Lab. Anim 2020, 54, 99–110. [CrossRef] [PubMed]
24. Geschka, S.; Kretschmer, A.; Šarkovska, Y.; Evgenov, OV; Lawrenz, B.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. Stimulacija topne gvanilatciklaze preprečuje preoblikovanje fibrotičnega tkiva in izboljša preživetje pri podganah Dahl, občutljivih na sol. PLoS ONE 2011, 6,e21853. [CrossRef] [PubMed]
25. Wang, Y.; Mu, JJ; Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Yang, Z.; Yuan, ZY Prehod epitelija v mezenhim pri podganah, občutljivih na Dahlsalt, ki ga povzroči sol, je odvisen od povišanega krvnega tlaka. Braz. J. Med. Biol. Res. Nedrčki Rev. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230.[CrossRef]
26. Holmes, JZ; Sugden, D. Zbornik: Učinek melatonina na hipertenzijo, povzročeno s pinealektomijo pri podganah. Br. J. Pharm. 1976, 56, 360P–361P.
27. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Eksperimentalna hipertenzija pri pinealektomiziranih podganah. Life Sci. 1967, 6, 2327–2331. [CrossRef]
28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Vpliv pinealektomije na arterijski krvni tlak ter vnos hrane in vode pri podganah. J. Endocrinol. Raziskati. 1978, 1, 125–130. [CrossRef] [PubMed]
29. Pechánová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Dobesová, Z.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Sládková, M.; Dovinová, I.; Simko, F.; et al. Učinek N-acetilcisteina in melatonina pri odraslih spontano hipertenzivnih podganah z ugotovljeno hipertenzijo. EUR. J. Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [CrossRef] [PubMed]
30. Leibowitz, A.; Peleg, E.; Sharabi, Y.; Šabtaj, Z.; Shamiss, A.; Grossman, E. Vlogamelatoninv patogenezi hipertenzije pri podganah s presnovnim sindromom. Am. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]
31. De Miguel, C.; Das, S.; Lund, H.; Mattson, limfociti DL T posredujejo hipertenzijo inledvicapoškodbe pri Dahlovih občutljivih na sol. Am. J. Physiol. Regul. Celo število. Comp. Physiol. 2010, 298, R1136–R1142. [CrossRef] [PubMed]
32. Evans, LC; Petrova, G.; Kurth, T.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW Povečan perfuzijski tlak poganja ledvično infiltracijo T-celic pri Dahlovi podgani, občutljivi na sol. Hipertenzija 2017, 70, 543–551. [CrossRef]
33. Abais-Battad, JM; Alsheikh, AJ; Pan, X.; Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Roberts, ML; Kriegel, AJ; Cowley, AWJ;Kidambi, S.; et al. Prehranski učinki na hipertenzijo, občutljivo na Dahlovo sol, poškodbo ledvic in transkriptom limfocitov T. Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]
34. Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL Prenos splenocitov poslabša hipertenzijo, občutljivo na sol, pri podganah. Exp. Physiol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]
35. Ren, W.; Liu, G.; Chen, S.; Yin, J.; Wang, J.; Tan, B.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Li, T.; et al. Signalizacija melatonina v celicah T: funkcije in aplikacije. J. Pineal Res. 2017, 62. [CrossRef]
36. Álvarez-Sánchez, N.; Cruz-Chamorro, I.; López-González, A.; Utrilla, JC; Fernández-Santos, JM; Martínez-López, A.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Melatonin nadzira eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis s spreminjanjem T efektorskega/regulativnega ravnovesja. Vedenje možganov. Imun. 2015, 50, 101–114. [CrossRef]
37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.Melatoninpoveča izražanje interlevkina 10 in zavira kemotakso, da zavira vnetje in situ in zmanjša resnost eksperimentalnega avtoimunskega encefalomielitisa. Int. Imunofarmakol. 2016, 31, 169–177. [CrossRef] [PubMed]
38. Griffith, JW; Sokol, CL; Luster, ADKemokiniin kemokinski receptorji: pozicioniranje celic za obrambo in imunost gostitelja. Annu. Rev. Immunol. 2014, 32, 659–702. [CrossRef] [PubMed]
39. Alsheikh, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fehrenbach, DJ; Yang, C.; Cowley, AWJ; Mattson, DL CCL2 posreduje zgodnjo ledvično infiltracijo levkocitov med hipertenzijo, občutljivo na sol. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F982–F993. [CrossRef][PubMed]
40. Liu, L.; Callahan, MK; Huang, D.; Ransohoff, RM Kemokinski receptor CXCR3: Nepričakovana uganka. Curr. Vrh. Dev. Biol.2005, 68, 149–181. [CrossRef] [PubMed]
41. Groom, JR; Luster, AD CXCR3 ligandi: redundantne, kolaborativne in antagonistične funkcije. Immunol. Cell Biol. 2011, 89,207–215. [CrossRef] [PubMed]
42. Van Raemdonck, K.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. CXCR3 ligandi pri boleznih in terapiji. CytokineGrowth Factor Rev. 2015, 26, 311–327. [CrossRef] [PubMed]
43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lim, BJ; Koh, MJ; Lee, J.; Chang, D.-Y.; Choi, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; et al. Imunosenecentne celice CD8 plus T in CXC kemokinski receptor tipa 3kemokinise povečajo pri hipertenziji pri ljudeh. Hypertens 2013, 62, 126–133 [CrossRef] [PubMed]
44. Stumpf, C.; Auer, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Šnajder, M.; Daniel, WG; Schmieder, RE; Garlichs, CD Serumske ravni kemoatraktanta Th1 interferon-gama-inducibilnega proteina (IP) 10 so povišane pri bolnikih z esencialno hipertenzijo. Hypertens Res. 2011, 34, 484–488. [CrossRef] [PubMed]
45. Rudemiller, NP; Lund, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jakob, HJ; Geurts, AM; Cohen, EP; Mattson, DL. Mutacija SH2B3 (LNK), kandidata za študijo asociacij na celotnem genomu za hipertenzijo, zmanjša hipertenzijo, občutljivo na Dahlovo sol, z modulacijo vnetja. Hypertens 2015, 65, 1111–1117. [CrossRef] [PubMed]
46. Wade, B.; Petrova, G.; Mattson, DL Vloga imunskih dejavnikov pri hipertenziji, ki jo povzroča angiotenzin II, in poškodbi ledvic pri podganah, občutljivih na Dahlsalt. Am. J. Physiol. Regul. Celo število. Comp. Physiol. 2018, 314, R323–R333. [CrossRef] [PubMed]