Študija o mikrobnih encimih, ki nastanejo med kombinirano bakterijsko fermentacijo in njihovimi biološkimi aktivnostmi ⅲ

Poglavje 3 Študija o antioksidativni aktivnosti encimov

 

Dokazano je, da so številne človeške bolezni povezaneaktivni kisik in prosti radikali, kot jevnetje, Arterioskleroza,staranje, diabetes, rakitd.Prekomerni prosti radikaliV telesu lahko povzroči denaturacijo beljakovin, poškodbe celic in smrt ter celo patološke spremembe v telesu. Zato številne študije doma in v tujini iščejo živila, bogata z naravnimi antioksidativnimi sestavinami za preprečevanje in uravnavanje bolezni, ki jih povzročajo prosti radikali s prehrano. Danes z naraščajočim življenjskim standardom ljudje postopoma preusmerijo osredotočenost na svoja telesa, zato se v neskončnem toku pojavlja vedno več zdravstvenih izdelkov. Vendar ni enostavno biti resnično koristno. Encimi so nekakšna hrana, ki jo lahko naredite sami v življenju ljudi. Stroški niso zelo visoki in veliko je prednosti.
Mikrobni encimi imajo različne zdravstvene funkcije, kot so antibakterijska in protivnetna, spodbujajo metabolizem, izboljšanje imunosti, beljenje in proti staranju, razstrupljanje in protirakač. Trenutno je relativno malo raziskav o antioksidativnih lastnostih mikrobnih encimov doma in v tujini, zato nameravamo opraviti poglobljene raziskave o njih. V tem prispevku je Apple encim kot raziskovalni objekt in uporablja skupno vsebnost fenola, zmanjšuje moč, DPPH · prosti radikal, · OH prosti radikal, prosti radikal superoksida in ABTS proste radikalne sposobnosti čiščenja, saj določanje indeksira celovito in sistematično preiskavo jabolčnega encima za 3 mesece. Preučevali smo sestavo in vsebnost antioksidantnih aktivnih sestavin, njegovo antioksidativno delovanje pa smo razumeli.

Nova zelišča cistanča z veliko večjo antioksidacijsko močjo kot fermentacija bakterij

Podporna služba Wecistanche-največji Cistanche izvoznik na Kitajskem:
E -pošta: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Materiali in metode

3.1.1 Materiali

(1) Eksperimentalni materiali
V sterilni pogoji sperite sveža jabolka s sterilno vodo, jih naravno posušite v sterilni operacijski mizi, jih olupite in narežite za kasnejšo uporabo. Dodajte beli sladkor in jabolka v steriliziranem steklenem kozarcu v masnem razmerju 1: 1. Aktivirajte bakterije, potrebne za eksperiment, in jih inokulirajte v encim v skladu z optimalno shemo (ta korak delovanja je izpuščen v kontrolni skupini), jo zatesnite in postavite na hladen in suh. Po 3 mesecih fermentacije sobne temperature vzemite vzorec, da dobite celotno encimsko tekočino, ki vsebuje celulozo, in jo filtrirajte. Vzemite supernatant kot eksperimentalni vzorec in vzorec centrifuge 15 minut v centrifugi za visoke hitrosti centrifugirajte pri 10000 vrtljajih, preden določite ustrezne podatke. Omeniti velja, da se v procesu izdelave encimov, da bi se izognili nepotrebni kontaminaciji, vse naše operacije izvajajo v sterilnih pogojih.

(2) Glavni instrumenti
Spektrofotometer: V -1100, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory;
Konstantna temperaturna vodna kopel: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Drugi instrumenti so enaki 2.1.3.

3.1.2 Metode

(1) Določitev celotne vsebnosti fenola [53]
① Priprava standardne krivulje:
Natančno tehtamo {{0}}. 123 g galne kisline, ga raztopimo v majhni količini destilirane vode in ga prenesete na 5 0 0 ml volumetrične bučke, da sestavim volumen. Take 8 clean 1{{10}} mL volumetric flasks, add 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, and 1.4 mL of gallic acid standard solution, respectively, dilute to the mark with distilled water, add 1 mL of Folin reagent and 2 mL of 20% NaCO3 to each, heat in a boiling water bath 1 min hladno in razredčeno do 20 ml in postavite pri sobni temperaturi 30 minut. Uporabite spektrofotometer za merjenje absorbance A pri valovni dolžini 650 nm in narišite standardno krivuljo z absorbanco A kot vodoravno os in koncentracijo vzorca kot navpično os. ② odkrivanje
Add distilled water to 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL sample solutions to 46mL, then add 1mL of Folin-phenol reagent, mix evenly, react for 3min, then add 3mL of 20% NaCO3, shake in a 25 degree constant temperature water bath for 2h, use distilled water as blank control, and measure its absorbance A at a wavelength of 760nm s spektrofotometrom. Skupna vsebnost fenola je izražena kot ekvivalenti galne kisline, celotna vsebnost fenola pa se izračuna po standardni enačbi krivulje.

(2) test zmanjšanja [54]
Dodajte 1 0 0 μl, 2 0 0μL, 300 μl, 400 μl in 500 μl vzorca na 2,5 ml fosfatnega pufra s koncentracijo 0,2Mol/L in pH vrednost 6,6, nato pa dodate 2.5 ml, nato pa dodate 2.5 ml od 2,5 ml iz kamnacije, nato pa dodate 2,5 ml od 2,5 ml od 1,5 ml. 50 stopinj 30 minut. Nato dodajte 2,5 ml trikloroocetne kisline (m/v) z masno koncentracijo 10%in 10 minut centrifuge pri 3000 vrtljajih v centrifugi. Takoj po odhodu vzemite 2,5 ml supernatanta v volumetrično bučko, dodajte 2,5 ml destilirane vode in 0,5 ml železovega klorida (m/v) z masno koncentracijo 0,1%. Uporabite destilirano vodo kot prazno krmiljenje in z uporabo spektrofotometra izmerite absorbanco A pri valovni dolžini 700nm. Moč zmanjšanja moči lahko presodimo z vrednostjo absorbance. Višja kot je vrednost absorbance, močnejša je reducirajoča moč.

 

(3) Določitev učinka čiščenja prostega radikala superoksida [55]

Vzemite 4,5 ml 0. 0 5 mol/l pH 8.2 Tris-hcl pufer in ga predhodno segrejte v 25-stopinjski vodni kopeli za 2 0 min. Dodajte 1 ml raztopine encimskega vzorca s koncentracijami 10%, 20%, 30%, 40%in 50%in 0,4 ml 25 mmol/L raztopine pirogalola. Dobro premešamo in reagiramo v 25 -stopinjski vodni kopeli 5 minut. Za prekinitev reakcije dodajte 1,0 ml 8 mol/L HCl. Uporabite Tris-HCl pufer kot referenco in za izračun hitrosti čiščenja uporabite spektrofotometer za merjenje absorbance A pri valovni dolžini 299 nm. Za prazno kontrolno skupino smo namesto vzorca uporabili 1 ml topila. Hitrost čiščenja O 2- je bila izračunana v skladu s formulo 3.1: o 2- hitrost čiščenja (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1), kjer: a1 je absorbanca prazne epruvete; A2 je absorbanca vzorca.

(4) Določitev učinka čiščenja na hidroksilne radikale [56]

1 0 0μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 400 μl raztopine vzorca 500 μl z vodo v 2 ml, nato dodali 1,4 ml vodikovega peroksida z molarno maso 6mmol/L, nato pa dodali z 0,6Ml in 2 ml in 2 mlijsko maso z molarno maso z molarno maso z molarno maso z molasto maso Masna koncentracija 1,5 mmol/L in segreva v konstantni temperaturni vodni kopeli pri 37 stopinjah za 1H. Prilagodite se na nič z destilirano vodo in izmerite absorbanco A pri valovni dolžini 562nm s spektrofotometrom. Izvedite 3 ponovitve za vsako zdravljenje. Izračunajte hitrost čiščenja hidroksilnih radikalov v skladu s formulo 3.2: hitrost čiščenja hidroksilnih radikalov (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.2), kjer je: a1 povprečna absorbanca praznega; A2 je povprečna absorbanca raztopine vzorca. (5) Določitev učinka čiščenja prostih radikalov DPPH [57]

Nova zelišča cistanča z veliko večjo antioksidacijsko močjo kot fermentacija bakterij

 

Natančno pipeto 2 ml raztopine encimskega vzorca s koncentracijami 1 0%, 20%, 30%, 40%in 50%v 10 ml volumetrične bučke, nato dodajte 2 ml 80%DPPH etanol vodne raztopine v volumetrični buč. Koncentracija molarne mase je 2 × 10-4 mol/l. Po mešanju pustite, da stoji pri sobni temperaturi 30 minut. Z uporabo 80% raztopine etanola kot reference izmerite absorbanco vzorca pri valovni dolžini 517 nm, ki je zapisana kot A1. Zmešajte 2 ml raztopine DPPH in 2 ml raztopine etanola z masno koncentracijo 80% in izmerite njihovo absorbanco na isti valovni dolžini, ki je zabeležena kot A0. Zmešajte 2 ml encimske raztopine in 2 ml raztopine etanola z masno koncentracijo 80% in izmerite njihovo absorbanco na isti valovni dolžini, ki je zabeležena kot A2. Izračunajte hitrost čiščenja prostega radikala DPPH v skladu s formulo 3.3:
DPPH prosta hitrost čiščenja radikala (%) {0}}} [1- (a 1- a2)/a {{16}] × 100 (3.3), kjer: a1 je absorbanca 2 ml dpph 80% ethanol volan; A2 je absorbanca mešane raztopine 2 ml encimske raztopine in 2 ml 80% etanola s koncentracijo mase; A0 je absorbanca mešane raztopine 2 ml raztopine DPPH in 2 ml 80% etanola s koncentracijo mase.

(6) ABTS sposobnost čiščenja prostih radikalov [58]
Dodajte določeno količino kalijevega sulfata v 7 mmol/L ABTS raztopino, dokler končna koncentracija mešane raztopine ni 2,45 mmol/L. Mešano raztopino postavite na hladno in suho mesto pri sobni temperaturi 12 do 16 ur. 1 μl, 3 μl, 5 μl, 7 μl in 9 μl raztopine vzorca smo dopolnjevali na 10 μl s 5mmol/L pH7.4 fosfatnim puferjem in nato enakomerno pomešali z 10 ml zgornje kalijevega sulfata in ABTS mešani raztopini in reagirali pri reakcijski temperaturi 30 stopinj in reakcije 5mina. Nič z destilirano vodo in z uporabo spektrofotometra izmerite absorbanco A pri valovni dolžini 734nm. Izračunajte hitrost čiščenja prostih radikalov ABTS v skladu s formulo 3.4:
ABTS hitrost odstranjevanja radikalov (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4), kjer: a1 je absorbanca prazne kontrolne skupine; A2 je absorbanca eksperimentalne skupine

 

3.2 Rezultati in analiza

3.2.1 Skupna vsebnost fenola

(1) Standardna krivulja
Standardna krivulja celotne vsebnosti fenola je bila narisana s koncentracijo galenske kisline kot vodoravne os in absorbanco A kot navpične os, kot je prikazano na sliki 3.1.

 

Slika 3.1 Standardna krivulja celotne vsebnosti fenola

Na sliki 3.1 lahko vidimo, da je standardna enačba krivulje y =11. 375x +0. 2593 (x je koncentracija vzorca, y je absorbanca), r 2=0. 9981.

(2) Določitev vzorcev

Rezultati skupne vsebnosti fenola v jabolčnih encimih v kontrolni skupini in eksperimentalne skupine v različnih koncentracijah so prikazani na sliki 3.2.

 

 

 

Slika 3.2 Krivulja celotne vsebnosti fenola

Kot je prikazano na sliki 3.2, imajo jabolčni encimi tako v kontrolni in eksperimentalni skupini visoko skupno fenolno vsebnost in oba se povečata s povečanjem dodane količine dodane vzorčne raztopine. V istem gradientu koncentracije se je skupna fenolna vsebnost jabolčnega encima v kontrolni skupini povečala od 0. 673mg na 2,8 0 7mg, skupna fenolna vsebnost eksperimentalne skupine pa se je povečala z 0,961 mg na 4,185 mg. Skupna fenolna vsebnost eksperimentalne skupine je veliko višja od vsebine kontrolne skupine, trend naraščanja pa je bolj očiten. Glede na skupno fenolno vsebnost je celotna antioksidantna aktivnost eksperimentalne skupine večja kot pri kontrolni skupini.

 

3.2.2 Zmanjšanje moči

Rezultati zmanjšanja določitve moči jabolčnih encimov v kontrolni skupini in eksperimentalni skupini v različnih koncentracijah so prikazani na sliki 3.3.

 

Kot je prikazano na sliki 3.3, je spreminjajoči se trend zmanjšanja moči jabolčnih encimov podoben spreminjajočemu se trendu celotne vsebnosti fenola. Zmanjšana moč eksperimentalne skupine je višja od moči kontrolne skupine in ali gre za eksperimentalno ali kontrolno skupino v območju koncentracije, predstavljenega v poskusu, zmanjšana moč kaže naraščajoči trend s povečanjem dodane količine dodane vzorčne raztopine. Eksperimentalni podatki so tudi potrdili, da je v smislu zmanjšanja moči antioksidativna aktivnost eksperimentalne skupine večja kot pri kontrolni skupini.

 

 

3.2.3 Sposobnost prostega radikala Superoksida Anion

Rezultati sposobnosti čiščenja jabolčnih encimov v kontrolni skupini in eksperimentalni skupini v različnih koncentracijah so prikazani na sliki 3.4.

Kot je prikazano na sliki 3.4, obstaja velika razlika v sposobnosti odstranjevanja superoksida aniona prostega radikala med eksperimentalno skupino in kontrolno skupino. Znotraj koncentracijskega območja, predstavljenega v poskusu, se sposobnost čiščenja prostega radikala superoksida aniona v eksperimentalni skupini najpomembneje spremeni, kadar je koncentracija vzorca od 10 do 20%, sprememba pa ni očitna, ko je koncentracija večja od 20%; Ko je koncentracija 50%, je sposobnost odstranjevanja prostega radikala superoksida aniona kar 85,4%. Sposobnost čiščenja prostega radikala na superoksidu, ki jo prikazuje kontrolna skupina, je jasno razvidno iz trendne lestvice. Ko se koncentracija encimov povečuje, se ta sposobnost čiščenja prostih radikalov poveča tudi, počasi se spreminja in postopoma nagiba v stabilno stanje. Sposobnost čiščenja doseže največ 42,6%. Eksperimentalna skupina je skoraj dvakrat višja od kontrolne skupine.

 

 

3.2.4 Sposobnost čiščenja prostih radikalov hidroksil

Spremembe sposobnosti čiščenja jabolčnih encimov v kontrolni skupini in eksperimentalne skupine pri različnih koncentracijah so prikazane na sliki 3.5.

 

 

Slika 3.5 Krivulja čiščenja hidroksilnega prostega radikala

 

Na sliki 3.5 je razvidno, da je znotraj koncentracijskega območja, predstavljenega v poskusu, sposobnost čiščenja encimov v eksperimentalni skupini in kontrolna skupina povečala s povečanjem dodane količine. Sposobnost čiščenja hidroksilnih radikalov eksperimentalne skupine je bila nižja kot v kontrolni skupini in je pri nizkih koncentracijah delovala zelo slabo. Pri visokih koncentracijah se je sposobnost čiščenja hidroksilnih radikalov znatno povečala. Razlog je v tem, da so bile med postopkom fermentacije vrste in vsebine mikroorganizmov v jabolčnih encimih v eksperimentalni skupini in kontrolni skupini drugačne, vsebina sekundarnih presnovkov in sestavnih delov vsakega izdelka, ki jih proizvaja fermentacija, pa je bila drugačna, zato je bila prikazana antioksidativna zmogljivost drugačna.

 

3.2.5 DPPH · Sposobnost prostega radikala

V primerjavi z drugimi metodami odkrivanja se DPPH · sposobnost čiščenja prostih radikalov pogosto uporablja za oceno aktivnosti antioksidantov v kratkem času [59]. Sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH · pri različnih koncentracijah je bila prikazana glede na rezultate kontrolne skupine in eksperimentalne skupine Apple encime, kot je prikazano na sliki 3.6.

Kot je prikazano na sliki 3.6, ko je bila koncentracija encima jabolčne kontrolne skupine nižja od 30%, je bila sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH · manjša od 50%, vendar je eksperimentalna skupina Apple encim pokazala tudi večjo sposobnost čiščenja prostega radikala DPPH · pri nizkih koncentracijah. Eksperimentalni rezultati kažejo, da je dodajanje Aspergillus oryzae, kvasa, termofilnega streptokoka in bolgarskega laktobacila koristno za sposobnost čiščenja prostega radikala DPPH ·. Kadar je koncentracija encima 50%, je ta sposobnost kar 91,4%, kar je veliko večje od 69,8%kontrolne skupine pri isti koncentraciji.

 

3.2.6 ABTS Radikalna zmogljivost čiščenja

Rezultati ABTS radikalne zmogljivosti čiščenja jabolčnih encimov v kontrolni skupini in eksperimentalne skupine v različnih koncentracijah so prikazani na sliki 3.7.

Slika 3.7 Krivulja ABTS radikalne zmogljivosti za odstranjevanje
Na sliki 3.7 je razvidno, da je hitrost čiščenja jabolčnih encimov v eksperimentalni skupini višja, če je količina dodajanja encimov večja od 5 μl. Študija Erel in sod. pokazala, da je sposobnost čiščenja radikalov ABTS v veliki meri odvisna od večje koncentracije fenolnih snovi [60]. Rezultati celotne določitve vsebnosti fenola so pokazali, da je bila skupna vsebnost fenola eksperimentalne skupine višja od vsebine kontrolne skupine. Eksperimentalni rezultat na sliki 3.7 je pravkar preveril, da je zmogljivost čiščenja radikalov ABTS večja kot v kontrolni skupini.

 

3.3 Povzetek tega poglavja

To poglavje preučuje razmerje med antioksidativno aktivnostjo jabolčnih encimov, ki nastane s fermentacijo s štirimi izbranimi sevi jabolk, koncentracijo encimskih vzorcev in primerjavo antioksidantnih aktivnih komponent in sposobnost prostega radikala med eksperimentalno skupino in kontrolno skupino. Eksperimentalni rezultati kažejo, da je skupna vsebnost fenola v jabolčnem encimu v kontrolni skupini nižja kot v eksperimentalni skupini, in njena redukcijska moč, superoksidni anion prosti radikal, prosti radikal DPPH in sposobnost čiščenja prostega radikala ABTS je boljša od tistih v kontrolni skupini; Encim v kontrolni skupini ima še posebej dobro sposobnost čiščenja za hidroksilne radikale.
Na splošno je eksperimentalna skupina pokazala večjo aktivnost antioksidantov, ki je še dodatno potrdila izvedljivost umetno dodajanja sevov za izdelavo mikrobnih encimov. Na ta način ima mikrobna encimska hrana več snovi, ki so koristne za zdravje ljudi na podlagi prvotne naravne fermentacije in se lahko bolje razvijejo v smeri, ki jo pričakujejo ljudje.