Morfofunkcionalna študija o učinkih pasivnega kajenja na ledvice podgan
Feb 19, 2022
UVODPo podatkih Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) je kajenje glavni vzrok smrti, ki jo je mogoče preprečiti na svetu, saj prizadene 8 milijonov posameznikov na leto, približno 1,2 milijona teh smrti pa je posledica izpostavljenosti pasivnemu kajenju. (1) Cigarete so sestavljene iz več tisoč kemičnih sestavin, nedavno ocenjenih na 5600. Med njimi jih ima 158 toksikološke lastnosti, ki lahko onesnažijo okolje z dimom, (2) ki ob vdihavanju pasivnega kadilca vsebuje šestkrat več nikotina, štirikrat več katrana, sedemkrat več ogljikovega monoksida in 73-krat več amoniaka kot ki jih vdihava aktivni kadilec. (3)
Primerjalna študija, ki so jo izvedli Dülger et al., (4) med skupino družinskih članov kadilcev in prostovoljcev, ki niso bili izpostavljeni cigaretnemu dimu, je pokazala,ledvične funkcije so ogroženi zaradi aktivnega kajenja. Vendar pa je Elihimas Júnior et al. (5) poudaril, da je lahko izpostavljenost cigaretnemu dimu tudi močnaledvicastrupeno sredstvo. Jain et al. (6) so dokazali, da je nikotin močan stimulans za proliferacijo človeških mezangialnih celic in proizvodnjo fibronektina, kar poslabša poškodbo glomerulov.
Tako kajenje in kroženje nikotina negativno vplivata na strukture, odgovorne za glomerulno filtracijo, vendar povezava med pasivnim kajenjem in morfofunkcionalnimi spremembami teh struktur zaradi te izpostavljenosti v literaturi še ni povsem pojasnjena, kar je glavni cilj raziskave. pričujočo študijo.
Ključne besede:onesnaženje s tobačnim dimom; Ledvična skorja; Ledvični glomerul; Mesangialne celice; Diabetične nefropatije; Hitrost glomerularne filtracije; Podgane, Wistar
CILJZa analizo morfoloških, strukturnih in funkcionalnih vidikov vledvicepodgan po pasivnem vdihavanju cigaretnega dima.
METODEOskrba in nastanitev živali sta bili v skladu z nacionalnimi in institucionalnimi smernicami za dobro počutje živali, ki sta jih določila Colégio Brasileiro de E xperimentação Animal (COBEA) [Brazilska šola za poskuse na živalih] in Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) [NationalSvet za nadzor nad poskusi na živalih]. Vso uporabo živali je pregledal in odobril Etični odbor za poskuse na živalih (proces 286/2015). Zato so si prizadevali čim bolj zmanjšati trpljenje, nelagodje in število uporabljenih živali ter z njimi ravnati humano.
Oblikovanje študijaEksperimentalna študija, sestavljena iz samcev podgan (Rattus norvegicus albinus), starih {{0}} tednov, s povprečno težo 260 g, razdeljenih v kontrolno skupino (CG) in skupino pasivnih kadilcev (SG). CG in SG sta bila razdeljena na CG 7 dni (n=10), SG 7 dni (n=10), CG 28 dni (n=10) in GT 28 dni (n{ {10}}). Živali obeh skupin so bile v vivariju Faculdade de Medicina de Jundiaí (FMJ) od novembra 2015 do januarja 2016 v ločenih prostorih, po dve na škatlo, pri sobni temperaturi med 22±2 stopinj in svetlo/temno. cikel 12 ur. Prirastek živali (g) in zaužitje filtrirane vode (mL) in krme (g) ad libitum (Nuvilab ® ; energijska vrednost: 339 kcal=1418kJ 100,0 %; ogljikovi hidrati 54 g ali 63,4 %; beljakovine 22 g ali 25,9 odstotka; in lipidov 4 g ali 10,6 odstotka - količine na porcijo 100 g in odstotek skupne energijske vrednosti) so spremljali med poskusom. Za izračun povprečnega vnosa so bile uporabljene razlike med ponujeno količino in količino, ki jo je žival zanemarila.
Da bi se prilagodile cigaretnemu dimu, so bile živali SG postopoma izpostavljene gorečim cigaretam, kar se je zgodilo v dveh, do 40 cigaret na dan (visok izkoristek; katran: 10 mg; nikotin: 0,8 mg; ogljikov monoksid: 10 mg) za obdobja od sedem do 28 dni. Do gorenja je prišlo v avtomatizirani kadilnici (SM-MC-01), ki je bila programirana tako, da začne kuriti cigarete vsakih 6 ur, pri čemer zažge 10 cigaret na cikel. Cigaretni dim je bil aspiriran z dovodnim sistemom prezračevalne stojala, tako imenovane "kadilnice" (slika 1), in enakomerno porazdeljen znotraj zapečatenih boksov živali. Ogljikov dioksid smo merili znotraj boksov in v okolju, kjer so bile živali CG in SG, s kalibriranim merilnikom ogljikovega dioksida (AZ Instruments, model AZ 77535, serijska številka 10109975) (certifikat 00948/2016).
Količina urina in analiza biokemičnih parametrov6. in 27. dan so bile živali postavljene v presnovne kletke za zbiranje 24--urnega urina. Kmalu zatem so jih stehtali, anestezirali, evtanazirali z dolgotrajno anestezijo inledvicein kri so zbrali. Mikroalbuminurijo smo merili z imunoturbidimetrijo s spektrofotometrično analizo. Izvedena je bila meritev plazemskega očistka kreatinina (referenčna vrednost: {{0}}.58±0,24mg/dL) (7) in očistka kreatinina v urinu (referenčna vrednost: 67,2±12,8mg/dL) (7). po Jafféjevi metodi. (8) Za analize kreatinina in glukoze (referenčna vrednost: 108±17,4 mg/dL) so (7) vzorce centrifugirali pri 3,000rpm deset minut pri 4 stopinjah, da smo dobili serum. Encimske komplete so nato uporabili za meritve v Laborlabu za kreatinin, Bioclin za glukozo in Analisa za mikroalbuminurijo.
Teža, mere in histologija ledvicTheledvicepridobljene iz živali, so secirali in stehtali na analitični tehtnici (model AB204, Mettler Toledo, Barueri, SP, Brazilija). Theledvicadimenzije (dolžina, širina in višina) so bile pridobljene s pahimetrom, njihovi radiji (r) pa so bili uporabljeni za določitevledvicaprostornina v kubičnih centimetrih z uporabo formule vol=4/3π (r1.r2.r3), ki se uporablja za izračun prostornine elipse. (9) Za histološko analizo desnoledvica(RK) je bil vodoravno odrezan medledvičnapoli, in levledvica(LK) je imela prečni prerez, kranialno in kavdalnoledvicaodseki hiluma, pri čemer je bil osrednji del uporabljen za analize. Odseki tkiva so bili vdelani v parafin, razrezani na debelino približno 4 μm in obarvani s hematoksilin-eozinom (HE) in periodično kislino Schiff (PAS).
Morfometrija in stereologija Meritveledvičnakorteksa so bili pridobljeni s kalibriranim milimetrskim okularjem, pritrjenim na optični mikroskop Motic s 4X lečo objektiva, na histoloških preparatih RK in LK, obarvanih v HE.
Celotno morfokvantitativno študijo tkiv na strukturni ravni smo izvedli s programsko opremo Motic Images Plus 2.0 za analize in digitalizacijo histoloških rezov. Za kvantifikacijo glomerularne gostote skupin so potrebne slikeledvičnakorteksa so bili zajeti s 4X objektivom na histoloških preparatih, obarvanih v HE. Na sliki je bil v 15 polj LK in 20 polj RK vstavljen testni sistem, ki ga tvorita retikulum in referenčna presečišča, kar je skupaj znašalo 100 točk, pri čemer štejemo tiste, ki se osredotočajo na glomerule, in izključujemo tiste, ki se osredotočajo na črtkane črte (slika 2). Glomerulna gostota glede na testni sistem je bila izračunana na naslednji način: Vv[glom] =p/P (Vv[glom]), z glomerulno gostoto v odstotkih; p so točke na glomerulih, P pa skupno število točk v testnem sistemu. (10)
Za izračun glomerulnega in kapsularnega premera na slikah, posnetih s 40-kratnim objektivom na diapozitivih
obarvane s PAS, so bile med koncema teh struktur narisane črte z vrednostjo, izračunano s programom (v μm). Povprečni premer je bil dobljen po povprečenju največjega in najmanjšega premera omenjenih struktur v 40ledvičnatelesc v RK in 30 v LK, v katerih so opazili žilne in/ali urinske pole (slika 3A). Kapsularne prostore smo dobili z razliko med njihovimi vrednostmi.
V te iste glomerule, zdaj s 60-kratnim objektivom, smo ponovno vstavili testni sistem in prešteli točke, ki so se pojavile na glomerulih. Takoj zatem so bile preštete točke, ki so vpadle na jedra mezangialne celice; (9) ti so bili združeni znotraj mezangialnega prostora, obdanega z mezangialnim matriksom med glomerularnimi kapilarnimi zankami (11) (slika 3B). Volumski deleži, ki jih zaseda mezangialna celica
glede na testni sistem (glomerul) so izračunali na naslednji način: Vv[mesg]=p/P (Vv[mesg], pri čemer je mezangialna volumska gostota podana kot odstotek, p označuje točke na jedrih mezangialne celice in P, ki ustreza skupnemu številu točk v testnem sistemu. (8)
Statistična analizaStatistična analiza je bila izvedena s ciljem primerjave med CG in SG ter primerjave znotraj skupine za vsako od proučevanih spremenljivk z uporabo povprečij in standardnih odklonov. Podatki so bili predloženi v analizo variance (ANOVA). Predpostavko o homogenosti varianc smo preverili z uporabo Tukeyjevega testa večkratnih primerjav. Stopnja pomembnosti, sprejeta za vse teste, je bila p manjša ali enaka 0,05. Za analizo je bila uporabljena programska oprema Biostat 5.3 (Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, Belém, PA, Brazilija) in primerjave so bile narejene med CG in SG ter znotraj skupine.
REZULTATI
Ravni ogljikovega dioksida (del na milijon)Učinkovitost opreme kadilnice pri ustvarjanju in vdihavanju dima je bila potrjena z detekcijo ravni ogljikovega dioksida. Začetna povprečna vrednost pred sežigom cigaret je bila 620,8 delcev na milijon (ppm) v okolju SG, kar je bilo blizu srednje vrednosti, pridobljene v okolju CG (571,8ppm). Ko so bile cigarete prižgane in se je dim vdihnil v škatle, so se ravni ogljikovega dioksida progresivno povečale od najmanjše srednje vrednosti 616,6 ppm do največje srednje vrednosti 1.267.0ppm (p manj kot ali enako 0,01).
Povečanje telesne teže in vnos Živali SG so v preučevanih obdobjih pokazale nižji porast telesne teže ter nižji vnos krme in vode (tabela 1).
Morfometrija: teža in dimenzije ledvicPrišlo je do pomembnih znižanj povprečnih vrednosti zaledvicautež,ledvicadimenzije (dolžina, širina in višina),ledvicavolumen in debelina skorje pri živalih SG v preučevanih obdobjih. V obeh obdobjih ni bilo razlik v dolžini RK, v sedemdnevnem obdobju pa v višini LK (tabela 2).
Morfometrija in stereologija ledvičnih telescKar zadeva glomerulno volumsko gostoto ter glomerularne in kapsularne premere, so srednje vrednosti, opažene v SGledvicebile bistveno nižje. Kar zadeva kapsularne prostore, so bile povprečne vrednosti, opažene v SG, bistveno višje v obdobju 28 dni. Kar zadeva gostoto mezangialnega volumna, ki ga zasedajo mezangialne celice v glomerulih, so bile srednje vrednosti v SG bistveno višje (tabela 3 in slika 4).
Volumen urina in analiza biokemičnih parametrov
Volumen urina živali SG je bil znatno nižji po sedmih dneh, po 28 dneh pa ni bilo razlike. Ravni glukoze, kreatinina in mikroalbuminurije pri živalih SG so bile znatno višje, ravni kreatinina v urinu in stopnja očistka kreatinina pri živalih SG pa so bile v preučevanih obdobjih bistveno nižje (tabela 4).
DISKUSIJA
V tej študiji je bil ogljikov dioksid uporabljen za preverjanje stopnje onesnaženosti okolja zaradi cigaretnega dima. Raven tega plina v škatlah živali SG je bila podobna tistim, ki so jih ugotovili Colli Neto et al. (12), ki so opazovali koncentracijo ogljikovega dioksida nad 999 ppm. To kaže, da so komponente, prisotne v cigaretnem dimu, krožile in da so jih živali vdihavale. Poleg tega je Robello (13) s podobno metodo izpostavljenosti odkril visoke ravni kotinina (nikotinskega metabolita) v serumu živali iz SG.
Zaradi te izpostavljenosti so bile živali SG v preučevanih obdobjih manjše pridobivanje teže zaradi manjšega vnosa vode in krme. Vdihavanje nikotina s cigaretnim dimom spremeni metabolizem, spodbuja povečano proizvodnjo toplote in porabo kisika, kar stimulira ščitnično stimulirajoči hormon (TSH) s posledično povečano presnovo in višjo raven glukoze in holesterola v krvi. (14) Povzroča tudi akutno zvišanje koncentracije dopamina in serotonina v možganih, kar zavira vnos hrane. (15) Ena od predlaganih hipotez za to je zmerna hiperglikemična raven pri kadilcih, (16) dejstvo, opaženo v sedanjosti in v študijah Sinzato et al. (17)
V študiji s podganami, ki so bile izpostavljene kajenju že od intrauterinega obdobja, je Schiffner (18) opazil, da je analiza testa tolerance za glukozo pokazala odpornost na delovanje insulina in višje vrhove glukoze v tej skupini v primerjavi s kontrolno skupino, kar nakazuje, da imajo kadilci večje težave pri privzem glukoze zaradi manjše razpoložljivosti insulina, manjšega števila in/ali delovanja insulinskih receptorjev ali manjše sposobnosti indukcije znotrajcelične signalne kaskade, ki olajša privzem glukoze.
Zaradi teh dejavnikov seledvicateže in dimenzij v tej študiji, kar je doseglo vrhunec v manjšihvolumni ledvic, dejstvo, ki so ga opazili tudi v eksperimentalni študiji Dündarja et al. (19) Čeprav nekatere morfološke spremembe morda ne pomenijo okvaredelovanje ledvic, se zdi, da ta povezava sledi na premosorazmeren način pri kajenju, saj so pri ocenjevanju kortikalne debeline v SG opazili pomembno atrofijo. Pravzaprav je razmerje med debelino skorje indelovanje ledvicje bilo predlagano, zlasti kadar gre za sorazmerno zmanjšanje glomerulov, (20) opaženo tudi v tej študiji, s pomembnim zmanjšanjem dimenzij glomerulovledvičnapremer korpuskule. Vendar pa se je kapsularni prostor povečal v SG z daljšim časom izpostavljenosti, verjetno zaradi zmanjšanja premera glomerulov, kar je omogočilo posledično zmanjšanje hitrosti glomerularne filtracije (GFR). (19)
Pri vrednotenju mezangialne volumske gostote je prišlo do pomembnega povečanja pri živalih SG. Mezangialne celice, ki pomagajo in modulirajo GFR in površino glomerulusa, zahvaljujoč svoji sposobnosti
za krčenje in sprostitev kot odziv na vazoaktivna zdravila, lahko utrpi znatno proliferacijo, z glomerularno sklerozo in tubulo-intersticijsko fibrozo pri živalih kot odziv na glomerularne endotelne lezije, ki jih povzroča kajenje. (21,22)
Zaradi opaženih morfoloških sprememb in manjše porabe vode pri živalih SG, ki so jih opazili tudi v študijah Gonçalves-Silva et al., (23) so se v SG spremenili tudi biokemični parametri analize krvi in urina, kar zagotavlja subvencije razumeti možno škodo zadelovanje ledvic, saj so bile ravni kreatinina, kreatinina v urinu in volumna urina, uporabljene za določanje stopnje očistka kreatinina za oceno GFR, bistveno nižje. Kajenje spodbuja znatno povečanje razmerja med albuminom in kreatininom, s spremembami v glomerularnem kapilarnem tlaku in delovanju ledvic (24) in malo je študij, ki povezujejo nikotin, prisoten v krvnem obtoku pasivnih kadilcev, zbolezni ledvic, zlasti glede akutne izpostavljenosti. (25)
Tako je lahko akutno delovanje nikotina v obtoku povezano z glomerulno endotelijsko disfunkcijo, saj vztrajne ravni mikroalbuminurije, znatno povišane v tej študiji, določajo in razvrščajo nastanek in napredovanje nefropatije ter izražajo dejavnik tveganja za endotelijsko disfunkcijo in poškodbe v makro- in mikrocirkulacija. (26) Cooper (27) je dokazal, da nikotin pospešuje nefropatije, ki se odkrijejo s povečanjem mikroalbuminurije z napredovanjem v proteinurijo, pri čemer je zaključil, da sta aktivno in pasivno kajenje strupena zadelovanje ledvic.
ZAKLJUČEKIzpostavljenost in pasivno vdihavanje cigaretnega dima pri živalih je povzročilo morfološke in strukturne spremembe v njihovih ledvicah. Skupaj s spremembami biokemijskih parametrov zaradi izpostavljenosti je bil rezultat zmanjšana hitrost glomerulne filtracije, kar dokazuje, da lahko izpostavljenost pasivnemu kajenju ogrozidelovanje ledvic, s podobnimi učinki kot pri aktivnem kajenju.