Večkomponentni režimi cepljenja proti Chlamydia Trachomatis s prvim pospeševanjem inducirajo odzive protiteles in celic T ter pospešijo očiščenje okužbe v modelu primata, ki ni človek Ⅱ
Jul 10, 2023
Materiali in metode
Antigeni cepiva in adjuvansi
V tej študiji so bili uporabljeni različni antigeni cepiva in adjuvansi: antigen cepiva CTH522, ki temelji na MOMP (11), je bil dajan po intramuskularni poti (IM) z adjuvansom CAF01 (42) ali aluminijevim hidroksidom (AlOH) ali po intranazalni poti ( IN) brez adjuvansa. Plazmidno DNA cepivo, pcDNA3.1-MOMP, je bilo izdelano s kloniranjem konsenznega MOMP v plazmidni vektor pcDNA3.1 (14) in aplicirano po intradermalni (ID) poti z elektroporacijo (EP) v zadnji strani. Rekombinantno cepivo proti humanemu adenovirusu serotipa 5 (rHuAd5), ki izraža MOMP (HuAd5-MOMP), je bilo narejeno s homologno rekombinacijo konsenznega MOMP (AAC45154.1) v vektor plazmida pAL1112 HuAd5 z izbrisanim E1 in E2 in aplicirano po intramuskularni poti (14) . Modificirano cepivo vakcinije Ankara-MOMP, proizvajalecrekombinacijski konsenz MOMP(AAC45154.1) v plazmid p3186 in oslabljen vektor MVA (14) in ga dajemo skoziintramuskularna pot.
Kliknite tukaj, če želite dobiti protivnetno zdravilo Cistanche
C. trachomatis serovar D stalež
Chlamydia trachomatis serovar D (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) je bil pridobljen iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC, Manassas, VA) in razmnožen v HeLa{ {2}} celice, pobrane in očiščene, kot so opisali Caldwell et al. (43). Zalogo C. trachomatis SvD smo shranili pri -80 stopinjah v 0,2 M saharozi, 20 mM natrijevem fosfatu (pH 7,4) in 5 mM glutaminski kislini (SPG) in določili koncentracijo enot, ki tvorijo vključke (IFU). celice HeLa-229 in celice McCoy.
Primati razen človeka
Trideset makakov vrste Cynomolgus (Macaca fascicularis), težkih od 3 do 5 kg, je bilo vključenih v študijo, ki je bila izvedena v obratih NHP stopnje 3 (ABSL3) biološke varnosti IDMIT ("Modeli nalezljivih bolezni in inovativne terapije" pri CEA "Commissariat à l'Energie Atomique," Fontenay-aux-Roses, Francija; akreditacijska št. #D92- 032-02). Protokole je odobril institucionalni etični odbor "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) pod številko izjave A14-026. Študijo je odobrilo "Ministrstvo za raziskave, inovacije in izobraževanje" pod registrsko številko APAFIS#720-201505281237660. Vse živali so bile pred študijo negativne na SIV, SHIV, STLV (simian Tlymphotropic virus), virus herpesa B, filovirus, SRV-1, SRV-2 in potrjeno, da so seronegativne za okužbo s klamidijo. Vsi poskusni postopki so bili izvedeni v skladu z evropskimi smernicami za nego živali ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", direktiva 2010/63/UE, 22. september 2010).
Protokoli cepljenja
30 makaki so bili naključno razdeljeni v 6 skupin s 5 živalmi v vsaki. Različni režimi cepljenja za 6 skupin so podrobno prikazani na sliki 1. Med vsemi cepljenji so bili makaki sedirani s ketamin klorhidratom (10 mg/kg telesne teže intramuskularno). CTH522 (85 µg na žival) so dajali intramuskularno (IM) bodisi z adjuvansom CAF{{20}}1 (625 µg/125 µg) bodisi z adjuvansom AlOH (0.425 mg ), kot je prikazano na sliki 1. IM imunizacije so bile izvedene v volumnu 0,6 ml v desnem stegnu (M. quadriceps) živali. CTH522 Intranazalne (IN) imunizacije (30 µg na žival) so bile izvedene z napravo Vaxinator, povezano z 1 ml brizgo z dvema zaporednima dajanjema 0,25 ml, po eno v vsako nosnico. Cepivo DNA-MOMP smo aplicirali intradermalno (ID) z elektroporacijo (EP) v kožo hrbta. Vbrizganih je bilo 6 ponovljenih volumnov po 0,1 ml ID (skupaj 1 mg), čemur je sledilo EP z uporabo sistema Nepagen™ (nastavitve: 6 kvadratnih impulzov po 10 ms z intervali po 90 ms pri 110 V, (300- 700 mA)) . Cepivo hAd5-MOMP smo dajali IM z odmerkom 1011 virusnih delcev v 1 ml na žival. Cepivo MVA-MOMP smo dajali IM z odmerkom 4 x 108 PFU na žival v volumnu 0,5 ml **. Naivna skupina ni bila cepljena in je veljala za kontrolno skupino.
Zbirka vzorcev
Med vsemi postopki vzorčenja so bili makaki sedirani s ketamin klorhidratom (10 mg/kg telesne teže IM). Kri so zbrali s femoralno venepunkcijo v tednih 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Cervikovaginalno tekočino za odkrivanje protiteles so zbrali z Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL). , ZDA) v 4., 8., 16., 18., 20., 22. in 24. tednu. Cervikovaginalne vzorce za odkrivanje klamidijske obremenitve smo zbrali z običajnimi ploščatimi brisi (Mast Diagnostic - ref.: 552C/10). Po stiku z vaginalno-cervikalno sluznico smo bris dali v vialo z medijem UTM-RT (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) in hranili na ledu.
Vaginalna okužba s 5 x 107 IFU C. trachomatis SvD
Živali so bile pomirjene s ketamin klorhidratom (10 mg/kg IM), postavljene v ventralni položaj z dvignjenimi boki in 1 ml inokuluma je bil travmatično apliciran neposredno na vaginalno sluznico na vagino-cervikalnem prehodu z uporabo 1 ml brizge. Vsaki živali je bil dan odmerek 5 x 107 IFU. Po inokulaciji je bila žival kratek čas omogočena v ventralnem ležečem položaju z dvignjenimi boki.
Encimski imunosorbentni test
CTH522specifična protitelesav vzorcih seruma in brisa so bili odkriti z indirektno ELISA. Plošče Maxisorp® (NUNC A/S, Roskilde, Danska) so bile čez noč prevlečene s CTH522 (0.5 µg/ml) pri 4 stopinjah. Izotipa IgG in IgA smo odkrili s protitelesi, konjugiranimi s HRP, specifičnimi proti IgG primatov razen človeka (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, ZDA, 1:75.{{10 }}) in IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, ZDA, 1:50.000). Reakcije smo vizualizirali s substratom TMB PLUS (KemEnTec, Taastrup, Danska) in zaustavili z 0,5 M žveplovo kislino. Plošče smo odčitali na bralniku ELISA pri 450 nm s popravkom pri 650 nm. Pozitivna kontrola (serum iz prejšnje študije) je bila uporabljena kot interni standard za korekcijo variacije med ploščami. Dve vdolbinici sta bili izvedeni brez substrata kot negativna kontrola na vsaki plošči. Titri protiteles so bili izračunani kot recipročna vrednost največje razredčitve z vrednostjo optične gostote (OD), ki je višja od mejne vrednosti. Meja je bila določena iz povprečja vzorca dneva 0 plus 2*SD.
Peptidni niz in analiza
Niz peptidov CTH522 je bil zasnovan s trojniki imobiliziranih 15-mernih peptidov, ki se prekrivajo s 14 aminokislinami, ki so bili natisnjeni na funkcionalnih stekelcih in inkubirani z vzorci seruma s strani JPT Peptide Technologies, Berlin. Na kratko, niz je bil inkubiran z vzorci seruma, zbranimi v 24. tednu, peptidni kompleksi IgG pa so bili vizualizirani z uporabo biotiniliranega kozjega protiopicjega IgG in Alexa Fluor® 647 Streptavidina. Diapozitivi so bili skenirani s skenerjem visoke ločljivosti pri 635 nm in podatki so bili sporočeni kot poljubne fluorescenčne enote. Določeno je bilo povprečje trojnih vrednosti; če je bil koeficient variacije večji od 0.5, sta bili uporabljeni samo 2 najbližji vrednosti. 10 odstotkov signala največje jakosti (65.535) je bilo uporabljeno kot meja zapozitiven odgovor, srednjim signalom pod tem pragom pa je bila dodeljena vrednost, ki ustreza polovici vrednosti praga (3277).
In vitro nevtralizacijski test
In vitro nevtralizacijski test je bil izveden za testiranje sposobnosti serumskih protiteles, ki jih povzroči cepivo, da nevtralizirajo okužbo s klamidijo celic HaK in vitro. Test je načeloma sledil prej opisanemu protokolu (44). Najprej smo vzorce seruma posameznih živali inkubirali pri 56 stopinjah 30 minut, da smo inaktivirali komplement. Zalogo klamidije (SvD, SvE in SvF) smo zmešali in inkubirali s serijskimi razredčinami inaktiviranega seruma vsake od cepljenih živali 30 minut in nato cepili na enoplast celic HaK v 96-ploščah z ravnim dnom vdolbinic v dvojniki. Po 30 urah inkubacije smo celice in vključke fiksirali in vizualizirali s poliklonskim zajčjim serumom anti-Ct043 in fluorescenčno označenim sekundarnim protitelesom (Alexa Flour 488, kozji protizajčji IgG, A11008, Life Technologies) v razredčitvi 1:500 . Štetje vključkov je bilo izvedeno ročno v 20 vidnih poljih pri 40-kratni povečavi (obrnjeni fluorescenčni mikroskop Olympus IX71). Nevtralizacija je bila izračunana kot odstotek zmanjšanja povprečnega števila IFU v primerjavi z zbiranjem serumov živali iz kontrolne skupine (naivnih).
Intracelularno obarvanje citokinov PBMC in sorodna citometrija
PBMC smo izolirali in ({{0}} x 106) resuspendirali v 150 µl popolnega medija, ki je vseboval 0,2 µg vsakega kostimulatornega protitelesa CD28 in CD49b. Stimulacijo smo izvedli v 96 vdolbinicah/ploščah z uporabo 2 µM vsakega peptidnega bazena ali SEB (kot pozitivna kontrola) ali samega medija (kot negativna kontrola). V vsako vdolbinico smo dodali Brefeldin A pri končni koncentraciji 10 µg/ml in ploščo inkubirali pri 37 stopinjah C, 5 odstotkih CO2 čez noč. Celice so bile nato sprane, obarvane z barvilom za sposobnost preživetja (vijolično, fluorescentno reaktivno barvilo, Invitrogen), fiksirane in permeabilizirane z reagentom BD Cytofifix/Cytoperm. Vzorce permeabiliziranih celic smo nato pred postopkom obarvanja shranili pri -80 stopinjah. Barvanje protiteles je bilo izvedeno v enem koraku po permeabilizaciji. Vse rabljenoprotitelesaso navedene v tabeli 1. Po 30 minutah inkubacije na ledu v temi smo celice sprali v pufru BD Perm/Wash. Celice so bile preštete z LSR II (BD) takoj po postopku obarvanja, za analizo podatkov pa je bila uporabljena programska oprema FlowJo.
TABELA 1 Protitelesa, ki se uporabljajo za barvanje markerjev imunskih celic in znotrajceličnih citokinov
Odkrivanje vaginalne klamidijske DNA s kvalitativno PCR
Abbott RealTime CT/NG test (ABBOTT, Rungis, Francija) je in vitro test verižne reakcije s polimerazo (PCR) za neposredno, kvalitativno odkrivanje plazmidne DNA za genome CT (C.trachomatis) in NG (N. gonorrhoeae). . Nukleinsko kislino smo ekstrahirali iz vzorcev UTM (univerzalni transportni medij) na M2000SP in pomnoževanje izvedli na M2000SP v skladu z navodili proizvajalca. Rezultati so bili izraženi kot prag cikla (Ct).
Statistična analiza
Vse statistike so bile izvedene s programsko opremo GraphPad Prism (različica 8.1.2). Nenormalno porazdeljeni podatki so bili analizirani z neparametričnimi testi; Kruskal–Wallisov test in Dunnov test večkratne primerjave za ugotavljanje pomembnosti razlike med skupinami. Krivulje, ki prikazujejo odstotek PCR negativnih živali, so primerjali s statističnim testom Log-rank (Mantel-Cox). Primerjave so veljale za statistično pomembne, če je bila vrednost P < 0.05 (P < 0.05). Nadaljnje stopnje pomembnosti so označene z zvezdicami *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
Izjava o razpoložljivosti podatkov
Izvirni prispevki, predstavljeni v študiji, so vključeni v članek/dodatno gradivo. Nadaljnja vprašanja lahko naslovite na ustreznega avtorja.
Etična izjava
Študijo na živalih je pregledal in odobril "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) pod številko izjave A14-026. Študijo je odobrilo "Ministrstvo za raziskave, inovacije in izobraževanje" pod registrsko številko APAFIS#720-201505281237660.
Avtorski prispevki
Zasnovani in zasnovani poskusi: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Izvedeni poskusi: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Proizvedena cepiva in antigenski konstrukti: IR, PM, AO. Analizirali podatke: JD, EL, FF, IR, HJ. Prispevek pripravil in uredil: JD, EL, FF. Vsak od naštetih soavtorjev je pomembno prispeval k delu z zasnovo in zasnovo ter/ali pridobitvijo, analizo in interpretacijo podatkov. Vsi avtorji so prispevali k članku in potrdili predloženo različico.
Zahvala
Zahvaljujemo se Fundation Dormeur, Vaduz za donacijo Viral Evolution and Transmission Unit za laboratorijske instrumente, pomembne za ta projekt.
Navzkrižje interesov FF, IR, PA in AWO so soizumitelji patentne prijave za cepiva proti klamidiji [WO2014146663A1]. Vse pravice so bile dodeljene Statens Serum Institutu, danskemu neprofitnemu vladnemu inštitutu. Preostali avtorji izjavljajo, da je bila raziskava izvedena v odsotnosti kakršnih koli komercialnih ali finančnih odnosov, ki bi jih bilo mogoče razlagati kot potencialno navzkrižje interesov.
Opomba založnika Vse trditve, izražene v tem članku, so izključno trditve avtorjev in ne predstavljajo nujno trditev njihovih povezanih organizacij ali trditev založnika, urednikov in recenzentov. Založnik ne jamči in ne podpira nobenega izdelka, ki je lahko ocenjen v tem članku, ali trditve, ki bi jo uvedel njegov proizvajalec.
Reference
1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N, et al. Globalne ocene razširjenosti in incidence štirih ozdravljivih spolno prenosljivih okužb v letu 2012 na podlagi sistematičnega pregleda in globalnega poročanja. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304
2. Longbottom D, Coulter LJ. Živalske klamidioze in zoonotske posledice. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629
3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Tveganje za posledice po genitalni okužbi s klamidijo trahomatis pri ženskah. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2: S134–55. doi: 10.1086/652395
4. Dodet B. Trenutne ovire, izzivi in priložnosti za razvoj učinkovitih cepiv proti SPO: pogled proizvajalcev cepiv, biotehnoloških podjetij in agencij za financiranje. Vaccine (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032
5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Korelacija imunskega odziva gostitelja s kvantitativnim okrevanjem Chlamydia trachomatis iz človeškega endocerviksa. Infect Immun (1983) 39(3):1491–4. doi: 10.1128/iai.39.3.1491- 1494.1983
6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Zaščitna učinkovitost imunoglobulina a (IgA) in monoklonskih protiteles IgG, specifičnih za beljakovine glavne zunanje membrane, v mišjem modelu okužbe genitalnega trakta s klamidijo trachomatis. Infect Immun (1995) 63(12):4704–14. doi: 10.1128/iai.63.12.4704-4714.1995
7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Študije na izločenih miših kažejo, da so za zaščito pred klamidijo potrebne celice TH1, ki proizvajajo IFN-gama: ali to velja za ljudi? Scand J Immunol (1997) 46(6):546–52. doi: 10.1046/j.1365- 3083.1997.d01-167.x
8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. Celice CD4 plus T so potrebne in zadostne za zaščito pred okužbo s Chlamydia trachomatis v zgornjem genitalnem traktu miši. J Immunol (2012) 189(5):2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032
9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Vrednotenje intra- in ekstra-epitelnega sekretornega IgA pri klamidijskih okužbah. Imunologija (2014) 143 (4): 520–30. doi: 10.1111/imm.12317
10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Različni rezultati po transcitozi IgG, ki cilja na intracelularne in zunajcelične klamidijske antigene. Immunol Cell Biol (2014) 92(5):417–26. doi: 10.1038/icb.2013.110
11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Zaščita pred okužbo s Chlamydia trachomatis in patološkimi spremembami zgornjega genitalnega trakta z nevtralizirajočimi protitelesi, ki jih spodbuja cepivo in so usmerjena na VD4 glavnega proteina zunanje membrane. J Infect Dis (2015) 212(6):978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137
12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 T-celična imunost v tkivu poveča zaščito, vendar ni potrebna v strategiji cepljenja proti genitalni okužbi s klamidijo trahomatis. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463
Vprašaj za več:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950
Dodajte dodatek cistanche v košarico:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
