Nevroprotektivni potencial izotiocianatov v in vitro modelu nevroinfamacije

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Prejeto: 10. julij 2020 / Sprejeto: 25. oktober 2020 / Objavljeno na spletu: 16. november 2020

© Avtor(ji) 2020

Delovanje zeliščnega prahu Cistanche: ima zelo dobronevroprotektivni učinek

Povzetek

Izotiocianati (ITC), prisotni kot predhodniki glukozinolatov v zelenjavi iz družine križnic, so pokazaliprotivnetno, antioksidativno in antikancerogeno delovanje. Tukaj smo primerjali učinke treh različnih ITC na proizvodnjo ROS in na izražanje matrične metaloproteinaze (MMP) -2 in -9, ki predstavljata pomembne patogenetske dejavnike različnih nevroloških bolezni. Primarne kulture podganjih astrocitov so bile aktivirane z LPS in sočasno obdelane z različnimi odmerki alilizotiocianata (AITC), 2-fenetil izotiocianata (PEITC) in 2-sulforafana (SFN). Rezultati so pokazali, da sta SFN in PEITC lahko preprečila proizvodnjo ROS, ki jo povzroča H2O2. Zimografska analiza supernatantov celične kulture je pokazala, da sta bila PEITC in SFN najučinkovitejša zaviralca MMP-9, medtem ko je samo SFN pomembno zaviral aktivnost MMP-2. Analiza PCR je pokazala, da so vsi uporabljeni ITC znatno zavirali izražanje MMP-2 in MMP-9. Preiskava signalne poti mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) je pokazala, da ITC modulirajo transkripcijo MMP z zaviranjem zunajcelično regulirane aktivnosti protein kinaze (ERK). Rezultati te študije kažejo, da bi lahko bili ITC obetavni prehranski agensi za preprečevanje in dopolnilno zdravljenje nevroloških bolezni, povezanih z vpletenostjo MMP.

Ključne besedeAntioksidant · Protivnetno · Izotiocianat · Matrične metaloproteinaze · Nevrodegenerativne bolezni

Uvod

Nevrovnetje je kompleksen odziv na možgansko poškodbo, ki vključuje kaskado biokemičnih dogodkov, ki vodijo do aktivacije rezidenčnih celic centralnega živčnega sistema (CNS). Nenormalna aktivacija astrocitov ogrozi njihovo nevroprotektivno vlogo, kar vodi do sproščanja vnetnih mediatorjev, kot so reaktivne kisikove vrste (ROS), dušikov oksid (NO), citokini, kemokini in matrične metaloproteinaze

(MMP).

MMP so velika družina nevtralnih, od Zn2 plus odvisnih endopeptidaz, ki imajo kot glavne tarče komponente zunajceličnega matriksa (ECM), kot so fibronektin, kolagen, elastin in laminin (Latronico in Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Oddelek za bioznanosti, biotehnologijo in biofarmacevtiko, Univerza v Bariju "Aldo Moro",

Bari, Italija

Oddelek za znanosti, Univerza v Basilicati, Potenza,

Italija

V osrednjem živčevju so MMP vključeni v različne fiziološke odzive, kot so morfogeneza, menjava in preoblikovanje ECM, embriogeneza in celjenje ran; ko pa MMP uidejo regulativnim mehanizmom, postanejo škodljivi (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

V zvezi s tem je znano, da so spremembe v izražanju in aktivnosti MMP ključni patogenetski dogodki pri več nevroloških motnjah (Latronico in Liuzzi 2017; Mastroianni in Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Eksperimentalni dokazi kažejo, da sta med MMP želatinazi A (MMP-2) in B (MMP-9) še posebej vpleteni v vnetje nevronov, saj lahko njihova regulacija ogrozi celovitost krvno-možganske pregrade (BBB). To vodi do povečanega pridobivanja in infiltracije imunskih perifernih krvnih celic v možganski parenhim, kar ohranja vnetni proces, ki je vzrok za progresivno izgubo nevronov in oslabljeno delovanje nevronov (Rivest 2009). Več študij in vitro in in vivo je pokazalo, da je proizvodnja ROS eden od dejavnikov, vključenih v povečano regulacijo ekspresije MMP-9 v možganskih celicah prek mehanizmov signalne poti, ki so odvisni od mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) (Hsieh in Yang 2013).

Na podlagi teh dokazov je jasno, da znižanje nevrotoksičnih dejavnikov, kar ima za posledico zmanjšane nevrovnetne odzive, lahko predstavlja učinkovito terapevtsko strategijo za preprečevanje nastanka ali ublažitev napredovanja možganskih bolezni.

V zadnjih letih se biomedicinski interes na nevrološkem področju vse bolj osredotoča na raziskave naravnih spojin, ki lahko modulirajo procese, povezane z nevroinflamatornimi odzivi. V zvezi s tem je več študij pokazalo, da imajo fitokemične spojine, kot so polifenoli, izotiocianati (ITC) in druge, nevroprotektivni potencial, ki izhaja tudi iz njihove sposobnosti, da zavirajo izražanje MMP in preprečujejo proizvodnjo ROS (Dinkova-Kostova in Kostov). 2012; Liuzzi et al. 2007, 2011).

Izotiocianati so metaboliti, ki jih proizvaja več rastlin iz družine Brassicaceae kot obrambni sistem pred napadom patogenov (Bones in Rossiter 2006). Izvirajo iz encimske razgradnje glukozinolatov (GSL) z encimom mirozinazo. ITC so prisotni v pogosto zaužiti zelenjavi iz družine križnic, kot so brokoli, brstični ohrovt, zelje, repa, hren, koleraba, gorčica, redkev, vodna kreša in ohrovt. Njihove količine v hrani so zelo spremenljive in odvisne od predelave in priprave hrane.

Nedavno je bilo dokazano, da imajo ITC različne terapevtske učinke, vključno z antioksidativnim, antibakterijskim, protivnetnim in kemopreventivnim delovanjem (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

Zaščitna aktivnost ITC se izvaja z modulacijo različnih signalnih poti, ki sodelujejo pri razstrupljanju, vnetju, apoptozi in regulaciji celičnega cikla. Več dokazov kaže, da bi lahko antikancerogene in protivnetne lastnosti ITC pripisali predvsem njihovi sposobnosti aktiviranja poti faktorja 2 (Nrf2), povezanega z jedrskim faktorjem eritroidnega 2-. Nrf2 je transkripcijski faktor, občutljiv na redoks, ki se v prisotnosti elektrofilnih sredstev in pogojev oksidativnega stresa premakne v jedro, kjer veže elemente antioksidativnega odziva (ARE), inducira izražanje citoprotektivnih genov, ki sodelujejo pri razstrupljanju in modulaciji oksidativnih pogojev ter vnetni procesi (Heiss et al 2001). V zvezi s tem so poročali, da lahko ITC povečajo antioksidativno zmogljivost človeških celic z indukcijo ekspresije razstrupljevalnih encimov faze II in s povečano regulacijo proizvodnje GSH (Wagner et al 2010). Poleg tega so poročali o navzkrižnem pogovoru med Nrf2 in potjo jedrskega faktorja (NF)-κB, ki ima za posledico modulacijo vnetja (Sturm in Wagner 2017; Lee in Johnson 2004). V zvezi s tem so različni eksperimentalni in vitro in in vivo modeli nevroinflamacije pokazali, da lahko ITC znatno zmanjšajo translokacijo NF-κB s posledičnim zaviranjem vnetnih citokinov in MMP (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

V tem dokumentu smo raziskali učinek treh ITC, tj. alilizotiocianata (AITC), 2-fenetil izotiocianata (PEITC) in 2-sulforafana (SFN) na sproščanje MMP-2 in -9 kot tudi na produkcijo ROS z LPS-aktiviranimi astrociti. Naši rezultati so dokazali, da lahko PEITC, SFN in AITC in vitro inhibirajo izražanje MMP-9 in MMP-2 v astrocitih, aktiviranih z LPS, in preprečijo nastajanje ROS, ki ga povzroča H2O2. Poleg tega smo dokazali, da ITC modulirajo prekomerno izražanje MMP z mehanizmi, povezanimi z inhibicijo zunajcelično regulirane aktivnosti protein kinaze (ERK). Ti rezultati kažejo, da ima lahko prehrana, bogata z zelenjavo iz družine križnic, potencialne koristi za preprečevanje in dopolnilno zdravljenje nevroloških bolezni.

Materiali in metode

Kemikalije in reagenti

Dulbeccovo modificirano Eaglovo gojišče (DMEM), fetalni goveji serum (FBS), penicilin in streptomicin je zagotovil GIBCO (Paisley, Škotska). Želatina, DNaza 1, poli-L-lizin

(PLL), tripsin, lipopolisaharid (LPS), tripanovo modro in 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2.5-difeniltetrazolijev bromid (MTT ), alilizotiocianat (AITC) [kod. 377,430, čistost 95 odstotkov (HPLC)], 2-fenetil izotiocianat (PEITC) [kod. 253,731, čistost 99 odstotkov )], 2-Sulforafan (SFN) [cod. S6317, čistost večja ali enaka 95 odstotkom (HPLC)] je zagotovil Sigma (St. Louis, MO, ZDA). 2',7'-diklorofluorescein diacetat (DCFH-DA) je bil kupljen pri Calbiochemu. Standardne beljakovine in R-250 Coomassie Brilliant Blue so bili iz Bio-Rad (Hercules, CA, ZDA). Protitelesa proti glialnim fibrilarnim kislinskim proteinom (GFAP) (RRID: AB _2294571) so bila kupljena pri Serotecu (Oxford, Združeno kraljestvo). Protitelesa proti zunajcelično reguliranim protein kinazam (ERK) 1/2 in fosforilirani ERK 1/2 (p-ERK 1/2) so bila iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Membrane Hybond-P PVDF, Western Blotting Analysis System z izboljšano kemiluminiscenco (ECL) in sekundarno protitelo proti mišjim HRP so bili iz GE.

Healthcare Life Sciences (Little Chalfont, Buckinghamshire,

Združeno Kraljestvo). Pari primerjev, specifični za MMP-2, MMP-9 in 18S rRNA, so bili iz Sigma Genosys (Cambs, Združeno kraljestvo). RNeasy mini kit in QuantiTect Reverse Transcription kit sta bila kupljena pri Qiagenu (Valencia, CA, ZDA). Reagenti Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix za PCR so bili kupljeni pri Lucigen Corporation (Middleton, WI, ZDA).

Etična izjava

Poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s priporočili v Priročniku NIH za nego in uporabo laboratorijskih živali in z odobritvijo Odbora za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze v Bariju v Italiji (številka dovoljenja: 23-98- A).

Priprava kultur astrocitov

Astrocite smo pripravili iz neokortikalnih tkiv {{0}}dnevno starih podgan Wistar (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Italija). Za pripravo astrocitov smo uporabili 6 legel po 12 mladičev obeh spolov. Živali so bile evtanazirane z izpostavljenostjo ogljikovemu dioksidu (CO2) in ubite s hitrim obglavljenjem. Neokortikalna tkiva so secirali in uporabili za čiščenje primarnih kultur glialnih celic po metodi, ki so jo poročali Latronico et al. (2018). Na kratko, po disekciji so bili podganji možgani osiromašeni možganskih ovojnic in krvnih žil, mehansko mleti in prebavljeni z 0.25 odstotki tripsina v prisotnosti 0.01 odstotka DNaze. Po centrifugiranju in oceni viabilnosti celic smo celice nanesli v bučke, prevlečene s PLL (75 cm2) pri gostoti 1,5 × 107 celic/bučko v DMEM, 10 % FBS, 100 i.e. ml -1 penicilina, 100 µg ml -1 streptomicina , in vzdržujemo pri 37 stopinjah v 5-odstotnem CO2. Po 7 dneh smo bučke pretresli, da smo odstranili oligodendrocite in mikroglijo. Čistost astrocitov, pridobljenih s tripsinizacijo (0,25 odstotka tripsina/0,02 odstotka EDTA), smo ocenili z imunskim barvanjem za GFAP.

Zdravljenje LPS-aktiviranih astrocitov z alilizotiocianatom, fenetil izotiocianatom ali 2-sulforafanom

Konfluentne astrocite, posejane v plošče s 96 jamicami, smo stimulirali z 10 µg mL -1 LPS in sočasno obdelali z različnimi koncentracijami alilizotiocianata (AITC), 2-fenetil izotiocianata (PEITC) ali 2-sulforafana (SFN) v DMEM brez seruma. Astrociti v DMEM brez seruma in LPS-aktiviranih astrocitih so predstavljali negativno oziroma pozitivno kontrolo. Poleg tega, ker so bile osnovne raztopine AITC (100 µM), PEITC (67 µM) in SFN (56,4 µM) izdelane v DMSO, krivulja odmerek-odziv na DMSO, razredčen v gojišču pri isti koncentraciji topila, ki je prisotna v analiziranih vzorcev za oceno toksičnosti spojine. Po 20 urah inkubacije pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2 so bili supernatanti zbrani in shranjeni pri -20 stopinjah do uporabe, medtem ko so bile celice podvržene MTT testu za oceno sposobnosti preživetja celic.

Test viabilnosti celic MTT

Citotoksičnost AITC, PEITC in SFN na astrocitih je bila odkrita z uporabo MTT [{{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,{{5 }}difenil tetrazolijev bromid] test. Ta test temelji na redukciji MTT z mitohondrijsko sukcinat dehidrogenazo v živih celicah v netopen produkt modrega formazana, ki ga je mogoče spektrofotometrično izmeriti. Na kratko, po 20-urnem zdravljenju z AITC, PEITC ali SFN smo gojišče odstranili in celice naložili z 0, 5 mg mL-1 MTT. Po inkubaciji 2 uri pri 37 stopinjah smo odstranili 5-odstotni CO2 medij in raztopili kristale formazana v celicah z 90-odstotnim etanolom. Po 15-minutnem stresanju plošč, da se doseže popolna solubilizacija kristalov, je bila količina produkta formazana določena z optično absorbanco pri 560 nm z referenčno valovno dolžino 690 nm. Viabilnost celic je bila izražena kot odstotek kontrole (CTRL), predstavljen z neobdelanimi celicami, ki je bil nastavljen na 100 odstotkov. Za vsako spojino smo dobili krivuljo viabilnosti celic glede na odmerek.

Detekcija reaktivnih kisikovih vrst

Detekcija reaktivnih kisikovih vrst (ROS) je bila izvedena z nalaganjem astrocitov z 10 μM 2',7'-diklorofluorescein diacetata (DCFH-DA) v DMEM brez fenolnega rdečega pri 37 stopinjah za 30 minut. Nato smo DCFH-DA odstranili iz vdolbinic in celice 1 uro obdelali z AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ali SFN (25 μM) v DMEM brez fenolnega rdečega v prisotnosti H2O2 pri končni koncentraciji 100 μM . Celice, obdelane samo z DCFH-DA ali s H2O2, so predstavljale negativno (CTRL) oziroma pozitivno kontrolo (H2O2). Po inkubaciji celice speremo s PBS in jih liziramo

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0.5 odstotkov, pH 7,5,

nato centrifugiramo pri 10,000×g, 4 stopinje 10 minut. Supernatante smo zbrali in njihovo spektrofluorimetrično analizo izvedli pri 525 nm pod vzbujanjem pri 485 nm. Rezultati so bili normalizirani na skupno vsebnost beljakovin in proizvodnja ROS je bila izražena kot relativni odstotek intenzivnosti fotoluminiscence (PL) v primerjavi s pozitivno kontrolo.

Odkrivanje želatinaz

Aktivnost želatinaze v celičnih supernatantih (SN) je bila odkrita z zimografsko analizo, kot so poročali Latronico et al. (2013). Na kratko, količino SN, ki ustreza približno 10 µg skupnih proteinov, smo raztopili s 30 µl vzorčnega pufra Laemmli brez -merkaptoetanola. Vzorci so bili obdelani v 7,5-odstotnem poliakrilamidnem gelu, kopolimeriziranem z 0,1-odstotnim (m/v) želatino. Po elektroforetskem postopku smo gele dvakrat splaknili z 2,5-odstotnim Tritonom X-100/10 mM CaCl2 v 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 in inkubirali 24 ur pri 37 stopinjah v 1-odstotnem Tritonu X-100 /50 mM Tris–HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Geli so bili obarvani s Coomassie briljantno modro R-250 in razbarvani v metanolu/ocetni kislini/H2O (4:1:5 v/v). Aktivnost želatinaze je bila vizualizirana kot jasen pas prebave na modrem ozadju gela in je bila kvantificirana z računalniško denzitometrično slikovno analizo z uporabo programske opreme Image LabTM (Bio-Rad Laboratories). Želatinaza

aktivnost je bila izražena kot optična gostota (OD) × mm2, ki predstavlja območje skeniranja pod krivuljami, ki upošteva tako svetlost kot širino območja lize substrata. Podatki so bili izraženi z naslednjo enačbo: odstotek inhibicije=[100 − (OD vzorec/OD pozitivna kontrola) × 100].

Verižna reakcija s polimerazo reverzne transkripcije (RT-PCR)

Astrocite, posejane v plošče s 6 vdolbinicami, smo aktivirali z LPS (10 µg mL-1) in sočasno obdelali z ITC pri najvišji netoksični koncentraciji. Po 20 urah inkubacije smo celotno RNA ekstrahirali iz astrocitov z uporabo mini kompleta Qiagen RNeasy v skladu z navodili proizvajalca. Komplementarna DNA (cDNA) je bila sintetizirana iz 500 ng RNA z uporabo kompleta QuantiTect Reverse Transcription v skladu z navodili proizvajalca. Uporabili smo skupno 25 ng produktov reverzne transkripcije za pomnoževanje fragmenta 591 bp z uporabo specifičnih primerjev (smiselni 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; protismiselni 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) za sekvenco MMP-2 podgane in 541 bp fragment z uporabo specifičnih primerjev (smiselni 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; antismiselni 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) za zaporedje MMP-9 podgan. Vzporedno je bilo izvedeno pomnoževanje 308 bp fragmenta podganje 18S rRNA (smiselni 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; protismiselni 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), relativno invariantnega notranjega referenčnega gena. . Kompleti primerjev, potrjeni že v drugih študijah (Latronico in sod. 2013; Liuzzi in sod. 2004; Gramegna in sod. 2011), posebej prepoznajo samo gene, ki nas zanimajo, kot kaže pomnoževanje enega pasu pričakovane velikosti PCR. izdelkov. PCR pomnoževanje je bilo izvedeno v 25 ciklih, od katerih je bil vsak sestavljen iz denaturacije pri 94 stopinjah, žarjenja pri 59 stopinjah in podaljšanja pri 72 stopinjah. Po pomnoževanju smo produkte analizirali v 1,5-odstotnem agaroznem gelu. Po denzitometrični analizi gelov je bilo pomnoževanje ciljnih genov normalizirano na izražanje 18S rRNA, rezultati pa so bili izraženi kot odstotek inhibicije v primerjavi s pozitivno kontrolo, kot je bilo navedeno za kvantifikacijo želatinaze.

Odkrivanje fosforilacije ERK 1/2 z Western blot analizo

ERK 1/2 so odkrili z imunoblot analizo, kot je navedeno v Latronico et al. (2018). Na kratko, sotočna primarna

astrocite, nanesene v {{0}}plošče z vdolbinicami, ki so 24 ur mirovale v mediju brez seruma, so bile 1 uro predhodno obdelane z AITC (400 μM), PEITC (10 μM), ali SFN (25 μM) v DMEM brez fenolnega rdečega. Po 2-urni stimulaciji z 10 ug mL-1 LPS smo celice lizirali z 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM Na-pirofosfata, 1 mM -glicerofosfata, 1 odstotkom Tritona X-100, 1 mM fenilmetilsulfonil fuorid, 20 ug/mL aprotinina, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fluorid, 1 mM Na3VO4, pH 7,5. Šestdeset ug skupnih beljakovin vsakega vzorca smo ločili z elektroforezo v 10-odstotnem SDS-poliakrilamidnem gelu in proteine ​​nato imunoblotirali na membrane iz poliviniliden difluorida. Po blokadi čez noč pri 4 stopinjah z 0,05 odstotki Tween 20, 1 odstotkom mleka, 1 odstotkom govejega serumskega albumina v 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,5) so bile membrane preko noči testirane pri 4 stopinjah z monoklonskim anti-p- ERK 1/2 protitelesa (1:500). Nato so bile membrane trikrat sprane z 0,05-odstotnim Tweenom 20 v tris-pufrani fiziološki raztopini, testirane s sekundarnim protitelesom proti peroksidazi mišjega hrena (1:20,000) 2-h pri 24 stopinjah in detektirane z okrepljeno kemiluminiscenco. Za oceno skupne količine ERK so membrane odstranili in inkubirali s protitelesom, specifičnim za nefosforilirano ERK 1/2 (1:500). Intenzivnost pasov je bila kvantificirana z denzitometričnim skeniranjem madežev in ravni fosforilacije ERK 1/2 so bile normalizirane na nefosforilirano ERK 1/2 in izražene kot odstotek v primerjavi s pozitivno kontrolo (astrociti, obdelani z LPS), glede na naslednja enačba:

odstotek pERK 1/2=(vzorec OD/pozitivna kontrola OD) × 100.

Statistična analiza

Analiza podatkov je bila izvedena z uporabo GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ZDA). Podatki so bili izraženi kot srednje vrednosti ± SD. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo enosmerne analize variance (ANOVA), ki ji je sledil post hoc test Dunnettove večkratne primerjave.

Rezultati

Vpliv izotiocianatnih spojin na viabilnost astrocitov

Izvedeni so bili predhodni poskusi za oceno citotoksičnosti AITC, PEITC ali SFN. V ta namen smo očiščene astrocite 20 ur obdelovali s spojinami ITC v koncentracijah med 5 in 400 µM ali z DMSO, razredčenim v gojišču, kot je opisano v razdelku o metodah. Kot je prikazano na sliki 1, DMSO ni bil toksičen pri vseh uporabljenih koncentracijah, ki se ujemajo s koncentracijami testiranih raztopin ITC. Med raziskanimi ITC je AITC

Slika 1 Preživetje celic astrocitov, obdelanih z izotiocianatnimi spojinami. Konfluentne primarne astrocite smo 20 ur obdelovali z alilizotiocianatom (AITC), 2-fenetil izotiocianatom (PEITC) ali 2-sulforafanom (SFN) v navedenih koncentracijah, nato pa jih podvržemo testu MTT. Poleg tega, ker je bil v osnovnih raztopinah raztopljen v dimetil sulfoksidu (DMSO), je bila v vsakem poskusu izvedena krivulja odmerek-odziv za DMSO, razredčen v gojišču pri isti koncentraciji topila (v odstotkih), prisoten v vzorcih ITC, da bi dobili zanesljivo oceno toksičnosti ITC. Kontrola (CTRL) je bila predstavljena

odišavljena iz neobdelanih astrocitov v DMEM brez seruma. Grafi predstavljajo krivulje odziva na odmerek za viabilnost celic, izražene kot odstotek preživetja celic v primerjavi s kontrolo. Odmerki spojin, ki so določali viabilnost celic nad 60 odstotkov, so bili izbrani kot največje nestrupene koncentracije. Vrednosti so povprečje ± SD od n=3 poskusov, izvedenih na različnih celičnih populacijah. Mikrografije prikazujejo reprezentativne rezultate celične morfologije, opazovane pod mikroskopom s faznim kontrastom (50-kratna povečava) po obdelavi z različnimi spojinami

je bil manj toksičen za astrocite. Zlasti AITC ni bil toksičen za celice do 400 µM, medtem ko sta bila PEITC in SFN toksična pri koncentracijah nad 10 oziroma 25 µM. Mikroskopsko opazovanje je potrdilo rezultate testa MTT, ki je pokazal, da se je pri toksičnih koncentracijah PEITC in SFN število astrocitov zmanjšalo, tisti, ki so ostali, pa so pokazali citotoksične spremembe v citoplazmi.

Zaščitni učinek spojin ITC na proizvodnjo ROS v astrocitih, obdelanih z vodikovim peroksidom

Za ovrednotenje zaščitnega učinka ITC proti oksidativnemu stresu so bili astrociti predhodno obdelani s PEITC, AITC in SFN pri najvišji netoksični koncentraciji, nato stimulirani s H2O2. Znotrajcelična produkcija ROS, inducirana s H2O2, je bila testirana z DCFH-DA. Kot je prikazano na sliki 2, je izpostavljenost H2O2 povečala fluorescenčni signal v

Slika 2 Proizvodnja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) v astrocitih, obdelanih z ITC. Prisotnost ROS je bila testirana z merjenjem sprememb fluorescenčnega signala 2',7'-diklorofluoresceina (DCFA), kot je navedeno v razdelku Materiali in metode. Astrociti, posejani v plošče s 6 vdolbinicami, so bili predhodno obdelani 30 min z DCFA, nato pa 1 uro obdelani z 10 μM PEITC, 400 μM AITC ali 25 μM SFN v prisotnosti H2O2 pri končni koncentraciji 100 μM . Astrociti, obdelani samo z DCFA (CTRL) ali s 100 μM H2O2, so predstavljali negativno oziroma pozitivno kontrolo. Fluorescenčni signal, zaznan v celičnih lizatih, je bil izmerjen s fluorometrom pri 525 nm pri vzbujanju pri 485 nm. Proizvodnja ROS je bila izražena kot odstotek (odstotki) intenzivnosti fotoluminiscence (PL) v primerjavi s pozitivno kontrolo. Vrednosti so povprečje ± SD n=3 poskusov, izvedenih na različnih celičnih populacijah. Statistično pomembno zmanjšanje v primerjavi s H2O2 je označeno z zvezdicami (enosmerna ANOVA, ki ji sledi Dunnetov post hoc test; *p <>

astrocitov v primerjavi s kontrolo (CTRL). Kot dokazuje zmanjšanje intenzivnosti fluorescence DCF, je predhodna obdelava astrocitov s spojinami ITC preprečila nastajanje ROS, ki ga povzroča H2O2. Med testiranimi ITC sta samo PEITC in SFN lahko znatno zmanjšala proizvodnjo ROS za približno 20 oziroma 24 odstotkov v primerjavi s pozitivno kontrolo (H2O2).

Izotiocianatne spojine zavirajo ravni MMP-2 in MMP-9 v LPS-aktiviranih astrocitih

Učinek spojin ITC na ravni MMP-2 in MMP-9 so ovrednotili na astrocitih, aktiviranih z LPS, za katerega je znano, da inducira izražanje želatinaz (Gottschall in Deb 1996), in sočasno obdelani z AITC, PEITC ali SFN v območju koncentracij, ki niso bile toksične za celice. Kot je prikazano na sliki 3a, sta bila na gelu prisotna dva jasna pasova razgradnje 72 in 92 kDa, ki ustrezata MMP-2 oziroma MMP-9. Aktivacija astrocitov z LPS je povečala ravni MMP-2 in inducirala sintezo MMP-9. Zdravljenje z AITC (slika 3b), PEITC (slika 3c) ali SFN (slika 3d) je določilo odvisno od odmerka

zmanjšanje ravni MMP-9, ki je bilo odvisno od uporabljene spojine. Zlasti med uporabljenimi ITC je bil SFN najučinkovitejši pri zaviranju MMP-9, saj je določil 70-odstotno inhibicijo pri odmerku 10 μM in 100-odstotno inhibicijo pri odmerku 25 μM. Poleg tega je samo SFN pri najvišji netoksični koncentraciji lahko pomembno zaviral MMP-2 (slika 2d).

Izotiocianatne spojine zavirajo izražanje genov MMP-2 in MMP-9 v LPS-aktiviranih astrocitih

Da bi ugotovili, ali so proučevane spojine ITC lahko zavirale ekspresijo MMP-2 in MMP-9, je bila izvedena RT-PCR na LPS-aktiviranih astrocitih, obdelanih z največjo netoksično koncentracijo ITC. Kot je prikazano v reprezentativnih gelih na sliki 4a, je bilo zdravljenje LPS-aktiviranih astrocitov s posameznimi ITC sposobno preprečiti povečano izražanje MMP-2 in MMP-9 mRNA. Kot je prikazano na sliki 4b, je kvantitativna analiza rezultatov pokazala, da so pri najvišji netoksični koncentraciji spojine ITC določile statistično značilno inhibicijo izražanja MMP-2 in MMP-9 v primerjavi na pozitivno kontrolo (LPS). Zlasti PEITC in SFN izvajata enak odstotek inhibicije MMP-2 (85 odstotkov ) in MMP-9 (100 odstotkov), medtem ko je bil AITC pri zaviranju MMP manj učinkovit kot PEITC in SFN{{17} } (65 odstotkov ) in MMP-9 (90 odstotkov ).

ERK 1/2 sodeluje pri zaviranju izražanja MMP z ITC

Ker je ERK 1/2 glavna signalna transdukcijska pot, vključena v regulacijo ekspresije MMP-2 in MMP-9 v LPS-aktiviranih astrocitih (Lee et al. 2003), je učinek spojin ITC na testirali smo aktivacijo zunajcelično reguliranih protein kinaz (ERK) 1/2.

Kot je prikazano na sliki 5, je LPS povzročil statistično značilno povečanje ravni fosforiliranega ERK 1/2 (p-ERK), ki je bilo uničeno s predhodno obdelavo s spojinami ITC.

Diskusija

Splošno prepričanje je, da sta glavni obrambni strategiji pred številnimi boleznimi predvsem izogibanje dejavnikom tveganja in pravilen življenjski slog. Obstajajo številni znanstveni dokazi, ki podpirajo hipotezo, da lahko nekateri naravni metaboliti, ki jih običajno proizvajajo različne vrste sadja in zelenjave, modulirajo patološke pojave, kot so rak, nevrološke bolezni in druge večfaktorske bolezni. V tem scenariju so izotiocianati (ITC) vzbudili veliko zanimanje zaradi svojih protiglivičnih, antibakterijskih,

Slika 3 Učinek izotiocianatnih spojin na ravni MMP-2 in MMP-9 v LPS-aktiviranih astrocitih. V a je predstavljen reprezentativni zimografski gel analize supernatantov kulture iz astrocitov, aktiviranih z LPS (10 ug mL-1) in sočasno 20 ur obdelanih z AITC, PEITC ali SFN pri navedenih koncentracijah (μM). Negativne in pozitivne kontrole so bile pridobljene iz nestimuliranih in neobdelanih astrocitov v mediju brez seruma (CTRL) in LPS-

aktiviranih celic (LPS) oz. Histogrami b–d predstavljajo rezultate (povprečje ± SD) n {{0}} poskusov, izvedenih na različnih celičnih populacijah, izraženo kot odstotek inhibicije MMP v primerjavi z LPS, izračunano po skeniranju denzitometrije in računalniški analizi gelov . Statistično pomembno zmanjšanje v primerjavi z LPS je označeno z zvezdicami (enosmerna ANOVA, ki ji sledi Dunnetov post hoc test; *p < 0.05,="" **p=""><>

antikancerogene, antimutagene, antioksidativne in protivnetne biološke lastnosti (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay in Fahey 2001). Izotiocianati izvirajo iz encimske razgradnje glukozinolatov (GSL), ki so sekundarni metaboliti, prisotni v 15 botaničnih družinah reda Capparales in jih je zelo veliko v družini Brassicaceae (Fahey et al. 2001). GSL hidrolizira mirozinaza (-tioglukozid glukohidrolaza e; EC 3.2.3.147) v različnih komponentah, kot so ITC, nitriti, tiocianati, epitionitrili, SFGate, glukoza in oksazolidini (Li in Kushad 2005). Čeprav so ITC obsežno preučevali na kemoterapevtskem področju (Grundemann in Huber 2018), je bilo opravljenih le malo raziskav o njihovem terapevtskem potencialu pri nevroloških boleznih, čeprav je bila dokazana sposobnost SFN in AITC, da prehajajo BBB in se kopičijo v možganskem parenhimu. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). V tem članku smo primerjali učinke treh ITC,

prisoten v več pogosto zaužiti zelenjavi iz družine križnic, na proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst (ROS) in izražanje matrične metaloproteinaze (MMP) v in vitro modelu nevrovnetja, ki ga predstavljajo astrociti, aktivirani z lipopolisaharidom (LPS) ali obdelani s H2O2. Astrociti, najpogostejši tip glialnih celic CŽS, igrajo ključno vlogo pri vzdrževanju možganske homeostaze in so znaki različnih nevroloških bolezni (Cekanaviciute in Buckwalter 2016; Colombo in Farina 2016). Veljajo za ključne regulatorje prirojenega imunskega odziva in njihov odziv na škodljive učinke, kot je oksidativni stres, lahko poslabša vnetne reakcije in poškodbe tkiva ali spodbuja obnovo tkiva. Dobro je znano, da aktivirani astrociti proizvajajo nevrotoksične dejavnike, kot so MMP, ki imajo ključno vlogo pri spodbujanju nevrovnetja in progresivne izgube nevronov pri nevroloških boleznih (Hsieh in Yang 2013). Zato je modulacija

Slika 4 Učinek spojin ITC na izražanje MMP-2 in MMP-9 v astrocitih, aktiviranih z LPS. Astrocite, posejane v plošče s 6 vdolbinicami, smo aktivirali z LPS (10 µg mL-1) in sočasno 20 ur obdelali z AITC (400 µM), PEITC (10 µM) ali SFN (25 µM), nato jih izpostavili RT-PCR. V (a) so navedeni reprezentativni agarozni geli izražanja MMP-2 in MMP-9. Histogrami v (b) predstavljajo rezultate (povprečje ± SD) n=3 poskusov, izvedenih na različnih celicah

dogodki, ki se pojavijo po aktivaciji astrocitov, bi lahko ublažili vnetni odziv in poškodbo nevronov.

Rezultati te študije so pokazali, da je bil med proučevanimi ITC AITC manj toksičen, saj ni povzročil nobenega zmanjšanja sposobnosti preživetja celic pri vseh uporabljenih koncentracijah. Nasprotno, podobno kot so opazili drugi avtorji na različnih celičnih linijah glije, sta PEITC in SFN pokazala celično toksičnost pri koncentracijah, večjih od 10 oziroma 25 µM (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. 2015).

V trenutni znanstveni literaturi je veliko kontroverznih podatkov o molekularnih mehanizmih, na katerih temeljijo učinki ITC na sposobnost preživetja celic. V zvezi s tem je večina študij pokazala, da ITC zavirajo apoptozo, ki povzroča celično rast, zaustavitev celičnega cikla, nastajanje ROS v rakavih celicah, ne pa tudi v normalnih celicah (Fofaria et al. 2015; Qin et. drugi 2018; Sestili in Fimognari 2015). Ugotovili smo, da imata SFN in PEITC, ne pa tudi AITC, zaščitno vlogo pred oksidativnim stresom v astrocitih, pri najvišjih nestrupenih koncentracijah pa sta lahko preprečila proizvodnjo ROS, ki jo povzroča izpostavljenost H2O2. Osrednje živčevje je še posebej občutljivo na oksidativni stres zaradi visoke porabe kisika, šibkih antioksidativnih sistemov in visoke vsebnosti biomakromolekul, dovzetnih za oksidacijo. Nastajanje ROS in oksidativne poškodbe naj bi bilo vključeno v patogenezo nevroloških motenj, kot so Alzheimerjeva bolezen (AD), Parkinsonova bolezen (PD), amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in multipla skleroza (MS) (Lee et al. 2015). Čeprav sta torej v naših poskusih in vitro SFN in PEITC v zmerni meri preprečila nastajanje ROS, lahko domnevamo, da lahko in vivo dolgotrajno dajanje ITC vodi do pomembnejšega zmanjšanja ROS, ki lahko sčasoma povzroči pomembno za populacije, izraženo kot odstotek inhibicije MMP v primerjavi s pozitivno kontrolo (LPS), izračunano po skeniranju denzitometrije in računalniški analizi gelov. Statistično pomembno zmanjšanje izražanja MMP-2 in MMP-9 v primerjavi z LPS je označeno z zvezdicami (enosmerna ANOVA, ki ji sledi Dunnetov post hoc test; *p <>

preprečevanje in modulacija možganskih bolezni. ROS deluje kot kritična signalna molekula za sprožitev kaskade vnetnega odziva v CNS. V zvezi s tem je dobro znano, da ROS uravnava izražanje številnih genov, vključenih v nevrovnetje, z aktivacijo provnetnih transkripcijskih faktorjev, kot je jedrski faktor-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana et al. 2019). V tem scenariju igrajo pomembno vlogo MMP, katerih ekspresijo nadzira ROS z aktivacijo NF-κB (Yan in Boyd 2007).

Ker disregulacija MMP prispeva k patogenezi številnih vnetnih in nevrodegenerativnih bolezni, njihova inhibicija predstavlja pomembno terapevtsko strategijo. Zaradi tega je bilo v zadnjem desetletju vedno večje zanimanje osredotočeno na potencial zdravil in naravnih spojin za zaviranje MMP. Številne študije in vitro so dokazale, da je protivnetno in antioksidativno delovanje več zdravil in bioaktivnih spojin, prisotnih v zelenjavi in ​​morskih organizmih, povezano z njihovo sposobnostjo zaviranja izražanja MMP (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. 2015). V tej študiji smo dokazali, da sta bila med testiranimi ITC SFN in PEITC najučinkovitejša pri zaviranju ravni in izražanja MMP-2 in MMP-9 v astrocitih, aktiviranih z LPS. O zaviranju MMP z ITC so poročali v drugih študijah in vivo in in vitro. Zlasti Li et al. (2013) je dokazal, da lahko SFN ublaži poškodbe BBB z zaviranjem izražanja MMP-9 v in vivo modelu eksperimentalnega avtoimunskega encefalomielitisa. Drugi avtorji so poročali, da je SFN lahko oslabil ekspresijo MMP-9 po poškodbi hrbtenjače pri miših (Mao et al. 2010a). Poleg tega so študije in vitro pokazale, da zatiranje migracije celic in

Slika 5 Zunajcelična signalno regulirana kinaza 1/2 (ERK 1/2) je vključena v inhibicijo izražanja MMP s spojinami ITC. Reprezentativni avtoradiografski filmi Western blotting analize lizatov iz astrocitov, predhodno obdelanih 1 uro z AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ali SFN (25 μM) in nato 2 uri aktiviranih z LPS (10 ug mL{{ 13}}). Neobdelane in nestimulirane celice predstavljajo negativno kontrolo (CTRL). Histogram v (b) predstavlja invazijo ravni pERK1/2 v celicah glioma C6, ki je bila povezana z inhibicijo ekspresije MMP-9, ki jo posreduje NF-κB (Lee et al. 2015).

Molekularni mehanizmi, s katerimi ITC zavirajo MMP, niso jasni in ni študij, ki bi raziskovale antioksidativne in protivnetne lastnosti ITC na primarnih kulturah astrocitov. Več študij podpira hipotezo, da je zaviralni učinek ITC posledica njihove sposobnosti blokiranja NF-κB s signalno potjo Nrf2. V zvezi s tem je študija in vivo pokazala, da so bile miši z izločenim Nrf2 bolj dovzetne za vnetni odziv hrbtenjače, ki ga posreduje NF-κB, in za povečano izražanje od NF-κB odvisnih genov, vključno z MMP-9 (Mao et al. 2010b). ). Čeprav bi se poti NF-κB in Nrf2 lahko medsebojno prepletale, smo pokazali, da se regulacija NF-κB dogaja tudi z modulacijo molekularnih mehanizmov, ki so neodvisni od Nrf2. Dejansko smo ugotovili, da AITC, PEITC in SFN zavirajo aktivacijo ERK1/2, ki ima ključno vlogo v kaskadi dogodkov transdukcije signala, ki na koncu uravnavajo transkripcijo gena MMP.

Vendar pa so eksperimentalni dokazi, da je SFN pri najvišji netoksični koncentraciji popolnoma zaviral izražanje MMP-9 in ravni, medtem ko sta AITC in PEITC zavirala izražanje MMP-9 v največji možni meri, vendar sta le zmanjšala MMP{{3} } na približno 50 odstotkov, lahko nakazuje, da te spojine modulirajo transkripcijo MMP-9 z različnimi mehanizmi delovanja. V zvezi s tem so poročali, da SFN poleg inhibicije aktivacije NF-κB, ki jo povzroči LPS, moti vezavo LPS na receptor TLR4 (Koo et al 2013). Zaviralni učinek SFN na TLR4 bi lahko preprečil aktivacijo astrocitov z LPS, kar lahko povzroči inhibicijo izražanja MMP-9 navzgor s posledično pomanjkanjem proizvodnje MMP-9.

dobljen po denzitometričnem skeniranju avtoradiografskih filmov in normalizaciji na nefosforilirano ERK 1/2. Podatki predstavljajo povprečje ± SD n=3 poskusov, izvedenih na različnih celičnih populacijah. Zvezdice predstavljajo vrednosti, ki se statistično razlikujejo od pozitivne kontrole (LPS-aktivirani astrociti), ki je bila nastavljena na 100 odstotkov (enosmerna ANOVA, ki ji sledi post hoc test Dunnettove večkratne primerjave; *p <>

Sklepi

Če povzamemo, naši podatki kažejo, da zdravljenje astrocitov z ITC zmanjša tvorbo ROS in zavira sproščanje MMP-2 in MMP-9, kar zagotavlja nov vpogled v antioksidativne in protivnetne lastnosti ITC na gliji celice. Ti rezultati kažejo, da bi lahko bili ITC obetavni prehranski agensi za razvoj nevro-prehranskih posegov, ki temeljijo na uporabi zdrave hrane, za preprečevanje in dopolnilno zdravljenje nevroloških bolezni.

Financiranje Financiranje z odprtim dostopom, ki ga zagotavlja Università Degli Studi di Bari Aldo Moro v okviru sporazuma CRUI-CARE.

Skladnost z etičnimi standardi

Nasprotje interesov Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Odprt dostop Ta članek je licenciran pod licenco Creative Commons Attribution 4.0 International License, ki dovoljuje uporabo, skupno rabo, prilagajanje, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju ali formatu, pod pogojem, da navedete ustrezno priznanje izvirnemu avtorju (s) in vir, navedite povezavo do licence Creative Commons in navedite, ali so bile narejene spremembe. Slike ali drugo gradivo tretjih oseb v tem članku so vključeni v licenco Creative Commons za članek, razen če je v kreditni liniji za gradivo navedeno drugače. Če gradivo ni vključeno v licenco Creative Commons za članek in vaša nameravana uporaba ni dovoljena z zakonskimi predpisi ali presega dovoljeno uporabo, boste morali pridobiti dovoljenje neposredno od imetnika avtorskih pravic. Če si želite ogledati kopijo te licence, obiščite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.