Nanovlakna oleanolne kisline zmanjšajo oksidativni stres v keratinocitih, ki ga povzročajo delci

Za več informacij se obrnite na oscar.xiao@wecistanche.com

Povzetek:Trdni delci v zraku (PM) so eden od indikatorjev onesnaženosti zraka in so tudi glavni dejavnik, ki povzroča oksidativni stres v koži. Oleanolna kislina (OA), naravna terpenoidna spojina, je učinkovito zavirala staranje kože, ki ga povzročajo PM; vendar ima OA slabo topnost v vodi in absorpcijo kože, kar omejuje njeno uporabo v zdravilih in kozmetiki. Namen te študije je bil pripraviti nanovlakna oleanolne kisline (OAnf) in oceniti učinke OA in OAnf v keratinocitih, obdelanih s PM. Rezultati so pokazali, da (OA, raztopljen v raztopljenem v dimetil sulfoksidu (DMSO), oslabi prekomerno produkcijo reaktivnih kisikovih vrst, povzročenih s PM, aktivacijo protein kinaze/Jun-amino-terminalne kinaze (SAPK/JNK), ki jo povzroči stres, ter izražanje vnetnih in kožnih -proteini, povezani s staranjem. Poleg tega je postopek OA z nanovlakni učinkovito izboljšal topnost OA v vodi za več kot 99,000-krat s spremembo njegovih fizikalno-kemijskih lastnosti, vključno s povečanjem površine, zmanjšanjem velikosti delcev, amorfno transformacijo in tvorba vodikove vezi s pomožnimi snovmi. Sposobnost OAnf prodiranja skozi kožo je bila dosledno več kot 10--krat večja kot pri OA. Poleg tega je OAnf, raztopljen v PBS, pokazal boljše antioksidativne, protivnetne in proti staranju kože aktivnosti v PM -zdravljenih keratinocitov kot OA. Skratka, naše ugotovitve kažejo, da bi lahko bil OAnf aktualna antioksidativna formulacija za ublažitev kožnih težav, ki jih povzročajo PM.

Ključne besede:trdni delci; oleanolna kislina; nalno vlakna; antioksidant; protivnetno; proti staranju

1. Uvod

Onesnaženost zraka je zdaj javnozdravstveni problem po vsem svetu. Z razvojem tehnologije se različne škodljive snovi, vključno s plini, kemičnimi snovmi, biološkimi onesnaževalci in delci, kopičijo v ozračju in močno prizadenejo življenje in zdravje ljudi. Trdni delci (PM), indikator onesnaževal zraka, so kombinacija različnih organskih spojin, biološko pridobljenih materialov in delcev ogljikovih jeder [1]. PM vstopi v pljuča z vdihavanjem in vstopi v krvni obtok, kar povzroča sistemske nevarnosti za zdravje, kot so vnetja organov ter bolezni srca in ožilja ter dihal [2,3]. Poleg tega lahko PM prehaja skozi kožno pregrado in se kopiči v lasnih mešičkih ter ob ponavljajočem stiku celo prodre v dermis; zato je prekomerna izpostavljenost kože PM povezana z zunanjim staranjem kože, spremembami pigmentacije, atopijskim dermatitisom, aknami in luskavico [2,4]. Dolgotrajen stik s PM povzroči čezmerno proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst (ROS) v keratinocitih, kar sproži več signalnih poti, vključno s potjo apoptoze, potmi protein kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK), in vnetjem. V keratinocitih, ki so izpostavljeni PM. Poleg tega PM aktivira tudi matrične metaloproteinaze (MMP) in povzroči izgubo elastičnosti kože in staranje [5].

Za več informacij kliknite tukaj

Naravni izdelki se že dolgo uporabljajo kot učinkovite kozmetične sestavine. Oleanolična kislina (OA, 3 -hidroksiolean-12-en-28-oikaslina), triterpenoidna spojina s petimi obroči, je široko prisotna v rastlinah, sadju in zelenjavi [6]. OA je dobro znan po svojih zaščitnih učinkih na jetra, kot je zmanjšanje s kemikalijami povzročene akutne poškodbe jeter in fibroze/ciroze pri kroničnih boleznih jeter [6,7]. Poleg tega so prejšnje študije pokazale, da ima OA antioksidativne, protirakave, protivnetne, antidiabetične in protimikrobne učinke [8]Kim et al. je razkrilo, da lahko OA zmanjša izražanje pro-vnetnih citokinov (TNF-a,IL-6) in proteina staranja kože (MP-1) v keratinocitih, obdelanih s PM [9]. Vendar pa fizikalno-kemijske lastnosti OA otežujejo topljenje v vodi, kar omejuje njegovo uporabo v zdravilih, hrani in kozmetiki.

Zasnove formulacij za dostavo zdravil, kot so nanonosilci na osnovi polimerov, li. posomi, nanovlakna pa se običajno uporabljajo za izboljšanje fizikalno-kemijskih lastnosti učinkovin. Enkapsulacija aktivnih sestavin s pomožnimi snovmi v teh farmacevtskih formulacijah bi lahko povečala njihovo topnost v vodi in absorpcijo kože ter zmanjšala potencialno toksičnost in draženje kože. Med njimi so nanovlakna nastajajoča formula nano velikosti, z veliko površino, nizko gostoto in velikim volumnom por ter se že pogosto uporabljajo v biomedicini, ki lahko zmanjšajo količino peroralnih zdravil, povečajo stabilnost učinkovin, nadzorujejo sproščajo, izboljšajo biološko uporabnost in izdelujejo umetna tkiva [10]. Elektropredenje je običajna tehnologija, ki se uporablja za proizvodnjo nanovlaken in je zelo združljiva z množično proizvodnjo [1]. Zato lahko priprava nanovlaken s postopkom elektropredenja hkrati izboljša biološko uporabnost. učinkovitost in proizvodno učinkovitost učinkovine s slabo vodotopnostjo. Polivinil pirolidon (PVPK90) in 2-hidroksipropil- -ciklodekstrin (HPBCD) sta spojini, ki ju je odobrila FDA za raztapljanje in dovajanje hidrofobnih aktivnih farmacevtskih sestavin ljudem.cistančni holesterolPrejšnje študije so pokazale, da so nanovlakna, pripravljena s HPBCD in PVPK90, bistveno izboljšala topnost v vodi in prodiranje resveratrola [12] in plaijevega olja [13] v kožo. Tako je bil cilj te študije uporabiti PVPK90 in HPBCD kot nosilca dostave za pripravo nanovlaken oleanolne kisline (OAnf) in oceniti učinke OA in OAnf v keratinocitih, obdelanih s PM.

Cistanche lahko upočasni staranje

Namen te študije je bil oceniti biološki učinek OA, raztopljenega v DMSO, pri poškodbah keratinocitov, ki jih povzročajo PM. Da bi premagali slabo vodotopnost OA, smo uporabili PVPK90 in HPBCD kot dostavna nosilca za pripravo nanovlaken oleanolne kisline (OAnf) s postopkom elektropredenja in nato določili spremembe fizikalno-kemijskih lastnosti med surovim OA in OAnf, da bi pojasnili izboljšanje topnosti v vodi in penetracija kože. Za primerjavo biološkega učinka po postopku OA z nanovlakni je bil uporabljen model poškodb keratinocitov, povzročenih s PM, za oceno antioksidativnega, protivnetnega in delovanja proti staranju OAnf in OA.

2. Materiali in metode

2.1.Materiali

Hidrat oleanolne kisline (OA) je bil kupljen pri Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japonska). Polivinilpirolidon (Luviskol" K90 Powder, PVP) je bil kupljen pri Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Taipei, Tajvan). Hidroksipropil-beta-ciklodekstrin (HPBCD) je bil pridobljen pri Zibo Qianhui (Zibo, Kitajska). Metanol in dimetil sulfoksid (DMSO) so bile kupljene pri Aencore Chemical (Surrey Hills, Avstralija).Vse kemikalije ali reagenti za celične kulture so bile biološke kakovosti, druge kemikalije za fizikalno-kemijsko določanje pa so bile kakovosti za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).

2.2. Preizkus viabilnosti celic

Določanje viabilnosti celic aktivne sestavine je običajna metoda, ki se uporablja za izbiro ustreznih koncentracijskih razponov za aktivne sestavine za oceno njihove biološke aktivnosti. Keratinociti HaCaT so bili kupljeni pri Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Italija). Celice HaCaT so bile gojene v DMEM (Himedia Laboratories, Mumbai, Indija), ki je vseboval 10 odstotkov fetalnega govejega seruma (Hazelton Product, Denver, PA, ZDA) z 1 odstotkom penicilina in streptomicina (Biological Indus-tries, Connecticut, NE). , ZDA) in HaCaT celice so bile inkubirane v inkubatorju (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) s pogoji, nastavljenimi na 37 stopinj s 5 odstotki COz. Za pripravo testnih vzorcev sta bila OA in OAnf raztopljena v DMSO oziroma PBS, nato pa je bil vsak vzorec razredčen v DMEM brez fetalnega govejega seruma za določitev viabilnosti celic. Celice HaCaT so bile zasejane v 96-plošče z vdolbinicami pri gostoti 1 × 104 celic/100 μL/vdolbinico 24 ur. Nato smo gojišče odstranili in celice obdelali z različnimi koncentracijami OA in OAnf v razponu od 5 do 80 uM v DMEM brez seruma 24 ur. V času preizkusa smo medij za obdelavo odstranili in v vsako vdolbinico dodali 150 μl 0,5 mg/ml raztopine MTT. Po 3 urah inkubacije smo raztopino MTT odstranili in vijolične kristale formazana vsake vdolbinice raztopili v 100 uL DMSO. Absorbanco pri 550 nm vsake vdolbinice smo nato izmerili s spektrofotometrom za mikroploščo (BioTek uQuant, Winoski, VT, ZDA). Viabilnost celic smo izračunali po naslednji formuli:

2.3. Določanje vsebnosti reaktivnih kisikovih vrst (ROS).

PM (Standardni referenčni material, SRMB1649b) so bili kupljeni pri Nacionalnem inštitutu za standarde in tehnologijo. Ta izdelek je bil zbran leta 1976 in 197 v Washingtonu, DC Made. Skupno 10 mg/ml PM smo suspendirali v PBS in nato pred uporabo 10 minut sonicirali. Skupno 1 × 10 plus keratinocitov HaCaT smo gojili v 96-ploščah z vdolbinicami 24 ur pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2. Celice smo 24 ur obdelali z različnimi koncentracijami OA v DMSO, OA v PBS in OAnf v PBS. Nato smo jih inkubirali z 20 uM raztopino diklorodihidrofluorescein diacetata (DCFH-DA; Sigma, Tokio, Japonska) 30 minut. Nato smo v vsako vdolbino dodali 50 ug/cm² PM in inkubirali 1 uro. Po tem smo celice sprali dvakrat s PBS in intenzivnost fluorescence vsakega vzorca je bila analizirana z uporabo bralnika fluorescenčnih plošč (vzbujanje: 485 nm; emisija: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, ZDA).Naslednja enačba je bila uporabljena za izračun odstotka inhibicije Proizvodnja ROS:

2.4. Western blot analiza

Skupno 4 × 105 keratinocitov HaCaT smo gojili v 6-ploščah z vdolbinicami 24 ur. Celice smo nato 24 ur obdelali z OA ali OAnf v mediju brez seruma, čemur je sledil dodatek PM. Po različnih časovnih točkah smo celice lizirali s pufrom RIPAlysis (Merck Millipore, Burlington, MA, ZDA), nato centrifugirali pri 12,000 vrtljajih na minuto 10 minut. Za določanje koncentracije beljakovin je bil uporabljen komplet za analizo beljakovin BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Nato smo proteine ​​ločili z elektroforezo v natrijevem dodecilsulfat-poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in nato popivnali na membrane iz poliviniliden difluorida (PVDF) (Merck Millipore). Membrane smo blokirali 1 uro in jih sprali s tris-pufrano fiziološko raztopino ( TBS) z 1 odstotkom Tween-20. Membrane so bile inkubirane s primarnimi protitelesi pri 4 stopinjah čez noč. Primarna protitelesa, uporabljena v tej študiji, so vključevala ciklooksigenazo-2 (COX-2), matrično metaloproteinazo-9 (MMP-9), tkivni zaviralec metaloproteinaze-1 (TIMP-1), stresno aktivirana proteinska kinaza/Jun-amino-terminalna kinaza (SAPK/JNK) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ZDA), GAPDH (Santa Cruz Bi-otechnology, Dallas, TX, ZDA), matrična metaloproteinaza-1 (MMP-1) (Proteintech Group, Rosemont, IL, ZDA), p380, zunajcelično regulirane proteinske kinaze (ERK) in jedrski faktor kapa-lahke verige- ojačevalec aktiviranih celic B (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, ZDA). Nato smo dodali sekundarna protitelesa za 1 uro pri sobni temperaturi in reagirali z izboljšanimi kemiluminescenčnimi reagenti (ECL; Thermo Fisher Scientific). Protitelesa proti GAPDH so bila uporabljena kot notranje kontrole. Ekspresija vsakega proteina je bila analizirana z uporabo naprave Touch Imager (e-BLOT; Šanghaj, Kitajska), ekspresija pa je bila kvantificirana z uporabo ImageJ.

2.5. Priprava nanovlaken oleanolne kisline (OAnf)

OAnfs so bili elektropredeni z različnimi razmerji OA:PVP:HBPCD (1:8:5, 1:8:10 in 1:8:20). Raztopino elektrospin smo pripravili na naslednji način: 25 mg OA smo raztopili v 5 mL metanola in dodali HPBCD ter mešali z magnetnim mešalom, da smo dobili bistro raztopino; nato smo takoj dodali PVPK90 in zmes mešali 1 uro.cistanche deserticola neželeni učinkiNanovlakna so bila tkana z uporabo opreme za elektropredenje FES-COS (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Tajvan) pod naslednjimi pogoji: 10 ml brizga z iglo z notranjim premerom 0. 22 mm je bilo uporabljeno za elektropredenje; hitrost pretoka je bila nastavljena na 0,2 ml/h; uporabljena napetost je bila nastavljena na 12 KV; razdalja med konico in kolektorjem je bila 10 cm. Po postopku elektropredenja so bila nanovlakna zbrana z aluminijasto folijo. Novo sintetizirana nanovlakna so bila postavljena v zaprto plastično vrečko in shranjena v vsebniku, odpornem na vlago.

2.6. Analiza oleanolne kisline s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC)

Sistem za analizo HPLC (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tokio, Japonska) je bil sestavljen iz črpalke L-2130, samodejnega vzorčevalnika L-2200 in L{{3 }} ultravijolično-vidni (UV-vis) detektor. Analizna kolona je bila kolona Mightysil RP-18 GP (250×4,6 mm id., 5 um). Mobilna faza je bila sestavljena iz metanola in 0,1-odstotne raztopine ledocetne kisline v fiksnem razmerju (95:5; m/v). Hitrost pretoka mobilne faze je bila 1 ml/min, valovna dolžina detekcije UV detektorja pa je bila nastavljena na 215 nm. Absorpcijski vrh za oleanolno kislino se je pojavil pri 7,5 min. Umeritvena krivulja oleanolne kisline je pokazala dobro linearno （r =0.999） v območju 0.01-100 ug/mL.

2.7 Merjenje morfologije, premera vlaken in velikosti delcev OAnf

Različni vzorci nanovlaken so bili prevlečeni s platino z ionskim premazom (E{{0}}, HITACH, Tokio, Japonska); pogoj je bil nastavljen na 10 mA 120 s kasneje. Morfologijo in obliko vsakega vzorca smo opazovali z vrstičnim elektronskim mikroskopom (Hitachi S4700 Hitachi, Tokio, Japonska). Premer vsakega vzorca je bil izračunan s programsko opremo image j. Za merjenje velikosti delcev OAnf je bil uporabljen analizator Zetasizer 3000HS (Malvern, Worcestershire, UK). Velikost delcev OA in OAnf je bila izmerjena pri koncentraciji 1 mg/mL oziroma 0,1 mg/mL.cistanche odmerek redditPoleg tega smo opazili tudi enotnost morfologije OAnf po raztapljanju v vodi z uporabo transmisijskega elektronskega mikroskopa (TEM, JEM{{0}}EXII instrument, JEOL Co., Tokio, Japonska). Testni vzorec je bil naravnan na 1 ug/mL OA v deionizirani vodi in nato nakapljan v bakreno mrežico, nato pa je bilo takoj nakapano 0,5 odstotka (m/v) fosfovolframove kisline. Po sušenju je bil vsak vzorec postavljen na TEM za opazovanje.

2.8. Nalaganje zdravil in učinkovitost inkapsulacije OAnf

Za ovrednotenje učinkovitosti farmacevtskega postopka je zelo pomembno določiti nalaganje zdravila in učinkovitost inkapsulacije sistema za dostavo. Obremenitev z zdravilom je bila izračunana kot odstotek ugotovljene vsebnosti in teoretične vsebnosti OA v nanovlaknih OA. Za določanje obremenitve z zdravilom je bilo 100 μL vsakega vzorca dodanih v 900 μL metanola, koncentracija OA pa je bila, kjer je CoA koncentracija OA iz OAnf, WoA je teoretična količina dodanega OA, VoAnf je volumen raztopine OAnf.

Učinkovitost inkapsulacije kaže, ali so nanovlakna uspešno inkapsulirala aktivne spojine. Vzorce OAnf smo raztopili v deionizirani vodi in jih dodali v centrifugalne filtrirne naprave (Microcon YM-10, Millipore, Billerica, MA, ZDA) in nato centrifugirali pri 12,00 rpm 10 minut z hlajena centrifuga (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamburg, Nemčija). Inkapsulirani del smo obdržali v zgornji epruveti, nekapsulirani del pa smo zaradi razlike v molekulski masi zbrali iz spodnje epruvete. Količino nekapsuliranega OA smo odkrili s prej omenjeno metodo HPLC. Za izračun učinkovitosti inkapsulacije je bila uporabljena naslednja enačba:

kjer je AoA teoretična količina OA (pridobljenega iz pogojev hranjenja), vključenega v nanovlakna, Aunentrapped OA pa je količina neinkapsuliranega OA.

2.9. Vodna topnost OAnf

Surovi OA (1 mg) in formulacije OAnf v različnih razmerjih (ki vsebujejo ekvivalent 1 mg oleanolne kisline) smo raztopili v 1 ml deionizirane vode in nato obdelali z ultrazvokom (Branson 5510, Emerson Electric, Louis, MO, ZDA) za 20 minut. Vsak vzorec je bil filtriran skozi 0,45 um membrano (Pall Corporation, Washington, NY, ZDA) in 10-krat razredčen. Razredčene raztopine smo analizirali s HPLC in standardno krivuljo smo uporabili za določitev količine oleanolne kisline za primerjavo njihove topnosti v vodi.

2.10. Določanje pretvorbe iz kristalne v amorfno

Za analizo kristalne oblike OA, pomožnih snovi in ​​OAnf smo uporabili rentgensko difraktometrijo (Siemens D500, Karlsruhe, Nemčija). Analiza je bila izvedena z uporabo Cu-Ka sevanja, filtriranega z nikljem, z uporabo napetosti 40 kV in toka 25 mA. Hitrost skeniranja je bila 1 stopinja/min, razpon skeniranih kotov pa je bil od 5 stopinj do 50 stopinj. 2.11. Medmolekularna interakcija med OA in pomožnimi snovmi

Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FTIR) in 1H jedrska magnetna resonanca (1H NMR) se običajno uporabljata za potrditev medmolekularne interakcije med učinkovinami in pomožnimi snovmi. Oleanolno kislino, PVP, HPBCD in formulacije OAnf v različnih razmerjih smo zmešali s kalijevim bromidom (KBr) v prostorninskem razmerju 1:9 z uporabo možnarja in stisnili v tablete. Vsak vzorec je bil nato analiziran s spektrofotometrom FTIR (spektrofotometer Perkin-Elmer 200, Perkin-Elmer, Norwalk, CT ZDA). Razpon skeniranja je bil 400-4000 cm-4. Poleg tega , je bil vsak vzorec raztopljen v 0,8 ml 99,8 odstotka DMSO-dg (Merck, St. Louis, MO, ZDA) in analiziran s spektrometrom JEOL Alpha 400 (Nihon Denshi Co., Tokio, Japonska).

2.12. Prodiranje oleanolne kisline in njenih nanovlaken v kožo ex vivo

Ta poskus je bil izveden v skladu s standardnim protokolom smernic Evropskega združenja za kozmetiko in parfumerijo (COLIPA). Sistem Franzove difuzijske celice lahko razdelimo na steklene posode zgornje donorske komore in spodnje receptorske komore. Skupaj 1,5 ml pufrske raztopine, ki je vsebovala 0.14MNaCl,2mMK-HPO4, 0.4 mM KH2PO4 (pH7,4), smo dali v receptorsko komoro in vseskozi mešali z magnetno palico pri 600 obratih na minuto poskus. Svežo kožo bokov prašiča so pridobili pri lokalnem mesarju na tržnici in jo med obdobjem poskusa shranili v hladilniku. Vsak vzorec kože je bil razrezan na kose velikosti 2 cm × 2 cm in nameščen med obe komori, tako da je stratum corneum obrnjen navzgor. Franzovo difuzijsko celico smo vzdrževali pri 32 stopinjah s krožečo vodno kopeljo.koristi izvlečka cistancheNato je bilo v donorsko komoro za 1, 2 ali 4 ure dodanih 200 μl 1 mg/ml OA ali OAnf. Nato smo prašičjo kožo odstranili iz Franzove difuzijske celice in s 15-kratnim odstranjevanjem traku pridobili stratum corneum. Vsak vzorec preostale kože je bil segret na 95 stopinj s toplotno blazinico, povrhnjica in usnjica pa sta bila ločena s skalpelom. Vsak vzorec smo potopili v metanol in 1 uro obdelovali z ultrazvokom, da smo ekstrahirali OA, vsebnost oleanolne kisline v vsakem vzorcu pa smo določili z metodo HPLC. 2.13. Statistična analiza

Vsi podatki so bili prikazani kot povprečje ± standardni odklon (SD). Statistično značilnost med različnimi skupinami smo analizirali z analizo variance (ANOVA) s Tukeyjevim post hoc testom.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. Oleanolna kislina lahko zavira vnetje, staranje in signalne poti ROS/MAPK pri poškodbah keratinocitov, ki jih povzročajo PM

Da bi našli ustrezno območje koncentracije za vrednotenje biološke aktivnosti, smo citotoksičnost OA, raztopljenega v DMSO, določili v celicah človeških keratinocitov HaCaT z uporabo MTT testa. Kot je prikazano na sliki 1A, sta bila 40 in 80 μM OA povezana z 32- do 16-odstotno sposobnostjo preživetja celic. OA pri manj kot 20 μM je še vedno imela stopnjo preživetja celic nad 85 odstotkov. Ti rezultati so pokazali, da OA v koncentraciji 5-20 μM nima citotoksičnih učinkov na človeške keratinocite HaCaT (slika 1A). V skladu s tem so OA preučevali pri koncentraciji 5-20 uM, da bi raziskali njegovo antioksidativno in protipollucijsko delovanje pri poškodbah keratinocitov, ki jih povzročajo PM. V zadnjem času so številne študije pokazale, da so PM pogost onesnaževalec zraka, ki povzroča prekomerno proizvodnjo ROS in posledično poškodbe kožnega sistema zaradi vrste oksidativnega stresa, vključno s peroksidacijo lipidov, karbonilacijo beljakovin in mutacijo DNA [14-16], kot je prikazano v Slika 1B, zdravljenje s PM je znatno povečalo proizvodnjo ROS v primerjavi z nezdravljeno skupino (str<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. Nanovlakna oleanolne kisline so povečala topnost v vodi in prodiranje surove oleanolne kisline v kožo z izboljšanjem fizikalno-kemijskih lastnosti

3.2.1. Morfologija površine oleanolne kisline in njenih nanovlaken

Pod opazovanjem SEM je videz HPBCD predstavljal sferično in porozno pomožno snov, njena velikost pa je bila približno 20 do 50 μm (slika 2A). PVPK90 je pomožna snov z nepravilnimi poligonalnimi delci in velikostjo delcev več kot 60 um (slika 2B). Surova oleanolna kislina je nepravilno okrogel zrnat prah z velikostjo 3-60 um. Slika 2D-F prikazuje srednji premer vlaken različnih masnih razmerij oleanolne kisline: HPBCD:PVPK90 je bil 174,83±19,53nm, 219,23±18,93nm oziroma 403,17±32,99nm. Ugotovljeno je bilo, da je višje razmerje HPBCD(18) :20) je povzročilo, da ima OAnf večji premer vlaken (tabela 1).

3.2.2. Velikost delcev in morfologija OAnf, rekonstituiranega v vodi

Za opazovanje oblike in velikosti delcev OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20), raztopljenega v vodi, je slika OAnf pod transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) pokazala da so bili delci oleanolne kisline sferični in enakomerno razpršeni v vodi (slika 3). Velikost delcev je bila potrjena tudi z laserskim analizatorjem velikosti delcev (Tabela 2). Velikosti delcev OA in OAnf sta bili 5079,50±384,87 nm oziroma 302,37±11,91 nm. Indeksa polidisperznosti (PDI) OA in OAnf sta bila 1,63±0,21 oziroma 0,32±0,02. Ti rezultati kažejo, da je postopek elektropredenja učinkovito zmanjšal velikost delcev OA z enakomerno porazdelitvijo delcev in povzročil povečanje površine.

3.2.3. Nalaganje zdravil, učinkovitost inkapsulacije in topnost v vodi nanovlaken oleanolne kisline

Kot je prikazano v tabeli 3, so bili odstotki obremenitve OA v različnih razmerjih pomožnih snovi 72,36 ± 10,45 odstotka, 84,23 ± 3,62 odstotka oziroma 98,19 ± 4,82 odstotka. Rezultati so pokazali, da je višje razmerje HPBCD pokazalo boljši učinek nalaganja zdravila. Učinkovitost inkapsulacije vseh formulacij je bila večja od 95 odstotkov, kar je pokazalo, da sta PVPK90 in HPBCD učinkovito inkapsulirala OA. Poleg tega je bila topnost OAnf v vodi z različnimi razmerji pomožnih snovi 296,14±57,75 ug/mL, 395,87±32,77 ug/mL. in 998,7±58,32 ug/ml.cistanche Genghis KhanTi rezultati so pokazali, da je povečanje HPBCD v formulaciji dramatično povečalo topnost surovega OA v vodi. Nasprotno pa topnosti v vodi surovega OA ni bilo mogoče določiti, ker je bila pod mejo zaznavnosti (0,01 ug/mL) v metodi HPLC. Ta rezultat je pokazal, da je imel 1:8:20 OAnf več kot 1000-kratno izboljšanje topnosti v vodi v primerjavi s surovim OA. Tako je bil v naslednjih študijah 18:20 OAnf uporabljen za določanje biološke aktivnosti v modelu poškodb keratinocitov, ki jih povzroči PM.

3.2.4. Kristalna sprememba oleanolne kisline in njenih nanovlaken

Rentgenski difrakcijski vzorci (XRD) surovega OA, pomožnih snovi in ​​njegovih nanovlaken so prikazani na sliki 4. Surovi OA je pokazal več značilnih difrakcijskih vrhov visoke intenzivnosti pri kotu skeniranja 5 stopinj -20 stopinj, kar kaže, da surova OA je bila kristalinična spojina. Po drugi strani pa uklonski vzorci PVPK90 in HPBCD nimajo očitnih značilnih uklonskih vrhov. Poleg tega so za neobdelan OA pri obdelavi z elektropredenjem popolnoma izginili vsi značilni uklonski vrhovi surovega OA, kar je pokazalo, da je narava surovega OA je bil transformiran iz kristalnega v amorfnega (slika 4). Glede na te rezultate bi lahko sklepali, da je bila surova oleanolna kislina uspešno inkapsulirana v HPBCD in inkapsulirana s PVPK90 po postopku nanovlaken.

3.2.5. Tvorba medmolekularne vodikove vezi med oleanolno kislino in pomožnimi snovmi

Medmolekularno interakcijo surovega OA in HPBCD s PVPK90 smo določili s FTIR spektroskopijo, rezultati pa so prikazani na sliki 5. FTIR spekter je jasno pokazal absorbanco več kemičnih funkcionalnih skupin surovega OA, vključno z absorpcijskim pasom pri 3463 cm{{ 3}} (——OH raztezne vibracije), 1696 cm-1 (——C=O raztezne vibracije) in 1462 cm-l (—CHz raztezne vibracije) (slika 5). Ko so bili OA, PVPK90 in HPBCD kompleksirani v nanovlakna, se je absorpcija teh kemičnih funkcionalnih skupin očitno premaknila na nižjo absorpcijo. Te ugotovitve so kazale na medmolekularne interakcije vodikove vezi med OA in HPBCD s PVPK90. Poleg tega je ta študija uporabila tudi 'H NMR za potrditev medmolekularne interakcije OA in pomožnih snovi. 1HNMR spekter surovega OA (slika 6C) je pokazal karboksilni signal pri 812 ppm (H28), dvojno vezane protone pri 85,15 ppm (H12), signal hidroksi protona pri 83,38 ppm (H3) in metilne protone (81 ppm). HNMR spekter nanovlaken OA je pokazal, da je karboksilni signal OA izginil, kemijski premiki dvojno vezanih, hidroksi in metilnih protonov pa so bili očitno premaknjeni navzgor (slika 6). Ti rezultati so pokazali nastanek medmolekularnih vodikovih vezi med OA in pomožnimi snovmi, kar je podprlo uspešno inkapsulacijo OA s HPBCD in PVPK90.

3.2.6. In vitro penetracija surove oleanolne kisline in njenih nanovlaken v kožo

Biološka aktivnost topikalne formulacije je večinoma odvisna od absorpcije kože. Penetracije surovega OA in njegovih nanovlaken v kožo so bile določene v prašičji koži ex vivo. Kot je prikazano na sliki 7, nižja vsebnost OA（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3. Nanovlakna oleanolne kisline v necitotoksičnih koncentracijah so imela boljše delovanje proti onesnaževanju z izboljšanjem antioksidativnega, protivnetnega delovanja in delovanja proti staranju

Podobno kot OA, raztopljen v DMSO, je OAnf, raztopljen v PBS pri 40 uM in 80 uM, zmanjšal sposobnost preživetja celic HaCaT na 14,1 odstotka oziroma 5,6 odstotka (slika 8A). Zato je bilo 10 uM OAnf ovrednotenih za nadaljnje antioksidativno in antipollucijsko delovanje, da bi razumeli, ali imajo OA in njegova nanovlakna sposobnost zaviranja prekomerne proizvodnje ROS, ki jo povzroča PM. Slika 8B prikazuje, da je OAnf pri 10 uM opazno zmanjšal prekomerno proizvodnjo ROS, ki jo povzroči PM. Izračunali smo tudi stopnjo inhibicije proizvodnje ROS, da bi primerjali antioksidativno aktivnost med OA, raztopljenim v PBS, in OAnf. Deset mikromolarnih OA v PBS je povzročilo 28,3-odstotno inhibicijo proizvodnje ROS, OAnf pa je dosegel 97,6-odstotno inhibicijo (slika 8B). Ti rezultati so pokazali, da ima OAnf boljšo antioksidativno aktivnost kot OA v PBS pri oksidativnem stresu v keratinocitih, ki ga povzroči PM. Poleg tega smo primerjali tudi protivnetno delovanje poškodb keratinocitov, ki jih povzroči PM. Predobdelava s surovim OA v PBS ni mogla zavreti s PM inducirano ekspresijo beljakovin NF-KB in COX-2 Nasprotno pa je predobdelava z OAnf v PBS znatno zmanjšala ekspresijo NF. kB in COX-2 v celicah, obdelanih s PM (str<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Razprava

V zadnjem času je spremljanje koncentracije trdnih delcev v zraku eden najpomembnejših kazalnikov za vrednotenje indeksa kakovosti zraka. Koža je največji imunski organ človeka in prekomerna izpostavljenost PM lahko poškoduje funkcije kože. Jin et al. je razkrilo, da različne vrste PM niso le ostale v zunanji stratum corneum povrhnjice, ampak so prodrle tudi v stratum spinosum in lasne mešičke [14]. Če je dolgo časa izpostavljen prekomerni PIA, bo to povzročilo disfunkcijo kožne pregrade in je povezano s številnimi kožnimi boleznimi, kot so atopijski dermatitis, luskavica, akne in staranje [19, 20]. Dijkhoff et al. jasno prikazano, da lahko PM sproži eksogeno in endogeno tvorbo ROS, kar povzroči napredovanje oksidativnega stresa, vključno s peroksidacijo lipidov, oksidacijo beljakovin, mitohondrijsko disfunkcijo, poškodbo DNA, aktivacijo vnetja in pospeškom procesa staranja [15]. V skladu s tem je preprečevanje prekomerne proizvodnje ROS, ki jo povzročajo PM, dobra strategija in prva izbira za preprečevanje poškodb zaradi oksidativnega stresa med čezmerno izpostavljenostjo PM. Prejšnje študije so tudi pokazale, da lahko antioksidantna zdravljenja, kot so difloretohidroksikarmalol [21], dieckol [22], izvleček Opuntia humifusa [23] in izvleček trpke češnje [24], učinkovito ublažijo disfunkcijo keratinocitov, ki jo povzroči PM. Naši rezultati so tudi ugotovili, da lahko OA v DMSO zmanjša prekomerno proizvodnjo ROS, ki jo povzroči PM, in prepreči škodo zaradi PM. Poleg tega je NF-kB povsod prisoten in inducibilen transkripcijski faktor, ki uravnava izražanje vnetnih proteinov, kot je COX-2, ki igrajo ključno vlogo pri številnih kožnih boleznih. Naši rezultati so omenili, da lahko OA zmanjša aktivacijo NF-kB, ki jo povzroči PM, da zavira izražanje vnetnega proteina COX-2[25]. Poleg tega lahko aktivacija signalizacije MAPK poveča izražanje AP-1 in vodi do regulacije transkripcije MP[18]. V tej študiji je OA uspelo zatreti izražanje proteina MP-1 za staranje kože in povečati izražanje proteina proti staranju kože TIMP-1, da bi preprečil staranje keratinocitov, ki ga povzroči PM. Naši rezultati so tudi pokazali, da je OA učinkovito zaviral fosforilacijo JNK. Zato lahko OA zavira vnetje in staranje kože, ki jih povzroči PM, tako da zniža signalno pot ROS/JNK pri poškodbah keratinocitov, ki jih povzroči PM.

Kolikor nam je znano, je slaba topnost aktivnih spojin v vodi povezana z nizko biološko uporabnostjo, kar omejuje njihovo uporabo v medicini, živilski in kozmetični industriji [26, 27]. Dobro je znano, da imajo spojine s slabo topnostjo v vodi več skupnih fizikalno-kemijskih lastnosti, kot so pretirano velika velikost delcev, nižja površina, lipofilna struktura in kristalinična oblika [28]. Naši rezultati so tudi pokazali, da ima surov OA te fizikalno-kemijske lastnosti, vključno z veliko velikostjo delcev (5079,50±384,87 nm), 3-60 um nepravilnim zrnatim prahom z nižjo površino (slika 2C) in očitna kristalna oblika. Ti rezultati so pokazali, da je bila topnost OA v vodi nižja od 0,01 ug/mL in bi jo bilo mogoče razvrstiti kot praktično netopno aktivno spojino v skladu s klasifikacijo topnosti v vodi Farmakopeje Združenih držav (USP) [29]. Če teh pomanjkljivosti ni mogoče odpraviti, bi bile aktivnosti OA na koži močno omejene. Ta študija je uspešno uporabila PVPK90 in HPBCD kot nosilca z uporabo postopka elektropredenja za pripravo OAnf. Izboljšanje topnosti v vodi je glavni indeks, ki se uporablja za potrditev optimalne farmacevtske formulacije, naši rezultati pa so pokazali, da je imel OA:PVPK90:HPBCD pri 1:8:20 najboljšo topnost v vodi. To je pokazalo, da je OAnf učinkovito povečal topnost surovin v vodi OA odvisno od razmerja HPBCD. Podobno so predhodne študije pokazale, da večje razmerje ciklodekstrina poveča sposobnost inkapsulacije formulacije in povzroči znatno povečanje topnosti v vodi in biološke aktivnosti kurkumina [30], resvera-trola [12], timola [31] in difenokonazol [32]. Poleg tega je ta študija primerjala tudi fizikalno-kemijske lastnosti surovega OA in njegovih nanovlaken, da bi razjasnila mehanizme izboljšanja topnosti OA v vodi. Vsa nanovlakna OA, proizvedena v tej študiji, so bila filamenti enotne nano velikosti. Rezultati analize velikosti delcev so tudi omenili, da je OAnf, rekonstituiran v vodi, pokazal delce nano velikosti z vrhunsko homogenostjo porazdelitve. Ti rezultati so pokazali, da ima OAnf večjo površino kot neobdelani OA. Poleg tega bi lahko tvorba medmolekularnih vodikovih vezi med aktivnimi spojinami in nosilci prav tako prispevala k izboljšanju topnosti v vodi. Spekter FTIR in HNMR OAnf je pokazal, da je bil surov OA učinkovito inkapsuliran v HPBCD in je tvoril stabilizirano strukturo nanovlaken s PVPK90 z oblikovanjem medmolekularne vodikove vezi med OA in HPBCD/PVPK90. Kristalna oblika, transformirana v amorfno obliko aktivne spojine, je bila tudi indikator izboljšanja topnosti v vodi. XRD vzorec OAnf je pokazal, da se je kristalna struktura surovega OA preoblikovala v amorfno strukturo po nastanku nanovlaken. Ta podoben rezultat so opazili tudi pri več aktivnih spojinah, naloženih v nanovlakna [12,30]. Skupaj je formulacija nanovlaken učinkovito izboljšala topnost surovega OA v vodi z izboljšanjem fizikalno-kemijskih lastnosti, vključno z zmanjšanjem velikosti delcev, povečanjem površine, tvorbo vodikove vezi z nosilci in amorfno transformacijo.

Lokalne formulacije, ki vsebujejo antioksidante, so učinkovite za dostavo v povrhnjico in usnjico, da preprečijo oksidativni stres, ki ga povzročajo PM, vnetje in staranje kože [33]. Na podlagi znanja o kožni absorpciji je stratum corneum dejavnik, ki omejuje hitrost, ki omejuje penetracijo kože in absorpcijo aktivnih spojin, kar povzroči zmanjšanje biološke aktivnosti [34]. Rezultat penetracije kože in vitro je pokazal, da je OAnf lažje in hitreje prešel skozi stratum corneum kot neobdelani OA in ostal v povrhnjici in dermisu v velikih količinah. Ta rezultat je potrdil, da lahko OAnf učinkovito izboljša kožno absorpcijo surovega OA. Nato, da bi ugotovili, ali ima OAnf boljšo aktivnost proti onesnaženju kot neobdelani OA, je bil v tej študiji uporabljen model poškodbe keratinocitov, ki ga povzroči PM, za primerjavo njihovih bioloških aktivnosti. Naši rezultati so pokazali, da je imel OAnf v PBS boljše učinke proti onesnaženju kot surov OA, vključno z zmanjšano prekomerno produkcijo ROS, zmanjšano ekspresijo vnetnih beljakovin (COX-2 in NF-kB) in beljakovino za staranje kože (MP-1), povečano izražanje beljakovin proti staranju kože (TIMP-1) in znižano fosforilacijo JNK. Zato bi lahko bil OAnf aktualna formulacija kot antioksidant za preprečevanje poškodb keratinocitov, ki jih povzroči PM.

Če povzamemo, je OAnf izboljšal svoje fizikalno-kemijske lastnosti, da bi rešil slabo topnost surovega OA v vodi in tudi znatno izboljšal absorpcijo surovega OA v koži. OAnf je imel boljše antioksidativne, protivnetne in zaviralske aktivnosti pri poškodbah keratinocitov, ki jih povzročajo PM. Zato predlagamo, da bi se OAnf lahko uporabljal kot izdelek za nego kože ali kot farmacevtska formulacija za preprečevanje poškodb kože, ki jih povzročajo PM, v prihodnosti.

Ta članek je izvleček iz Antioxidants 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants