1. del: Protifibrotični učinek 6-bromo-indirubina-3 ′ -oksima (6-BIO) prek regulacije aktivatorskega proteina-1 (AP-1) In specifični protein-1 (SP-1) transkripcijski faktorji v ledvičnih celicah

Protifibrotični učinek 6-bromo-indirubin-3 ′ -oksima (6-BIO) prek regulacije aktivatorskega proteina-1 (AP-1) in specifičnega proteina -1 (SP-1) transkripcijski faktorji v ledvičnih celicah

Za več informacij:ali.ma@wecistanche.com

Ključne besede:ledvica, fibroza,SMAD,Antifibrotično

POVZETEK

PAI-1 in CTGF sta čezmerno izražena vledvicabolezniin vzrokfibrozapljuč, jeter inledvice. Uporabili smo podganji model enostranske ureteralne obstrukcije (UUO), da bi raziskali, ali6-BIO, zaviralec glikogen sintaze kinaze-3, oslabljenfibrozaz zaviranjem PAI-1 in CTGF in vivo. Poleg tega celične celice, ki jih povzroča TGFfibrozaopazovali in vitro z uporabo človekaledvicaproksimalne tubularne epitelne celice (HK-2) in intersticijski fibroblasti podgan (NRK49F). Izražanjefibrozasorodne beljakovine in signalne molekule, kot so PAI-1, CTGF, TGF, SMA,SMADin MAPK so določili v celicah HK-2 in NRK49F z uporabo imunoblotinga. Za identifikacijo transkripcijskih faktorjev, ki uravnavajo izražanje PAI-1 in CTGF, smo promotorske aktivnosti AP-1 in SP-1 analizirali z uporabo luciferaznih testov. Konfokalna mikroskopija je bila uporabljena za opazovanje solokalizacije AP-1 in SP-1 v PAI-1 in CTGF. Izražanje PAI-1, CTGF, TGF in -SMA se je povečalo v modelu UUO kot tudi v celicah HK-2 in NRK49F, obdelanih s TGF. Poleg tega je zdravljenje z UUO in TGF povzročilo aktivacijo P-SMAD2/3, SMAD4, signalne poti P-ERK 1/2, P-P38 in P-JNK MAPK. Aktivnost promotorja PAI-1, CTGF, AP-1 in SP-1 se je povečala kot odziv na zdravljenje s TGF. Vendar pa zdravljenje z6-BIOzmanjšalo izražanje beljakovin in signalnih poti, povezanih zfibrozav modelu UUO kot tudi v celicah HK-2 in NRK49F, obdelanih s TGF. Poleg tega je 6-zdravljenje z BIO oslabilo izražanje PAI-1 in CTGF ter promotorske aktivnosti AP-1 in SP-1, s čimer je uravnavaloSMADin MAPK signalnih poti ter posledično izvajanjeantifibrotičniučinki naledvicacelice.

Kliknite na Cistanche herba za bolezni ledvic

1. Uvod

Ledvicafibrozo povzročajo različni dejavniki, vključno s sladkorno boleznijo, visokim krvnim tlakom, glomerulonefritisom in s starostjo povezano kroničnoledvicabolezen [1–3]. Skleroza glomerulov in tubulointersticijafibrozaso končne patološke značilnostiledvicabolezni [4,5]. Prekomerna proizvodnja in odlaganje proteinov zunajceličnega matriksa (ECM) povzroča strukturne in funkcionalne poškodbeledvice, kar povzroči postopno izgubo njegove funkcije, ki kulminira v končni faziledvicabolezen [5]. Theledviceimajo kompleksno strukturo, ki je razdeljena na glomerule, tubulointersticije in vaskulaturo; vsak prekat ima drugačno vrsto zunajceličnega matriksa in nanj lahko vplivafibroza[6,7]. ECM intersticijskih tubularnih celic vsebuje različne komponente, vključno s kolagenom, glikozaminoglikanom, elastinom, lamininom in glikoproteini. Aktivirane proksimalne tubularne celice lahko aktivirajo tubulointersticijski [6–10]. Glikogen sintaza kinaza (GSK3) spodbujaledvicafibrozaz aktiviranjem signalizacije TGF v proksimalnih tubularnih in tubulointersticijskih celicah [11]. V tej študiji smo želeli ugotoviti učinke zaviralca GSK3,6-BIOna proksimalne tubularne in intersticijske fibroblastne celice z usmerjanjem na zaviralec aktivatorja plazminogena-1 (PAI-1) in faktor rasti vezivnega tkiva (CTGF), ki imata ključno vlogo pri napredovanjuledvicapoškodbe in tubulointersticijskifibroza.

6-BIOje celično prepusten derivat analoga indirubina, 6-bro-indirubina, ki je izoliran iz morskih mehkužcev in ima visoko specifičnost in selektivnost za GSK-3 [12,13].6-BIOje konkurenčni zaviralec ATP in kaže podobnost z vezavno domeno ATP ciklin-odvisne protein kinaze (CDK), ki uravnava protitumorsko aktivnost [14–16]. Nenormalna aktivnost GSK3 je povezana z več človeškimi boleznimi, vključno s sladkorno boleznijo, vnetji, nevrodegenerativnimi boleznimi in psihozo [17,18]. V prejšnjih študijah je bilo dokazano, da lahko zaviralci GSK3 popravijo poškodovane tubule in zmanjšajo vnetne odzive, epitelno-mezenhimski prehod (EMT), povezan s signalizacijo TGF 1, in kopičenje fibronektina v gojenih glomerularnih intermediarnih celicah [11, 19–21]. poleg tega6-BIOlahko ima potencialne terapevtske učinke pri več boleznih, vključno s sladkorno boleznijo, nevrodegenerativnimi motnjami in rakom z uravnavanjem vnetja, oksidativnega stresa, celičnega preživetja, pa tudi proliferacije in celične smrti [22–24]. Vendar pa so potencialni terapevtski učinki6-BIOnaledvicafibrozapovezane s poškodbo proksimalnega tubula in tubularnega intersticija, še vedno niso znane.

PAI-1, večnamenski glikoprotein vledvice, je zaviralec serinske proteaze, ki zavira urokinazni aktivator plazminogena (uPA) in tkivni aktivator plazminogena (tPA), ki razgrajuje plazminogen v plazmin [25,26]. Prekomerna ekspresija PAI-1 zavira fibrinolizo in razgradnjo ECM, s čimer poveča kopičenje ECM [27]. Poleg tega PAI-1 poveča MAPK (mitogen-aktivirane proteinske kinaze),SMADin RhoA/ROCK (Rho-povezana protein kinaza) signalne poti pri sladkorni bolezni in kroničniledvicabolezen [28–30]. Transkripcijski faktorji, kot so AP-1, SP-1,SMAD3/4, USF2 (navzgornji transkripcijski faktor 2) in CTF/NF (družina vezave DNA, specifične za mesto

beljakovine), aktivirata tudi MAPK inSMADsignalizacija [30,31]. Kombinirana aktivacija teh signalnih poti in transkripcijskih faktorjev poveča izražanje PAI-1 in vodi do kopičenja ECM. CTGF je protein, ki veže heparin, povezan z ECM, in vključuje domene, kot so inzulinu podoben rastni faktor, ki veže protein (IGFBP), von Willebrandove ponovitve tipa C (VWC), ponovitve trombospondina tipa 1 (TSR) in C-terminal domene (CT) z motivom cisteinskega vozla. Od teh štirih domen domena CT sodeluje s superdružino TGF, fibronektinom in perlekanom [32–34]. Posledično CTGF poveča MAPK,SMAD, PI3K in YAP signalizacijo z indukcijo TGF, te signalne poti pa aktivirajo transkripcijske faktorje, kot so AP-1, SP-1, NF-kB inSMAD2/3. Tako povečana regulacija CTGF povzroči migracijo, proliferacijo in vnetje celic, s čimer povzroči kopičenje ECM [35–37].

Na podlagi teh rezultatov prejšnjih študij smo špekulirali, da MAPK inSMADsignalizacije, pa tudi transkripcijskih faktorjev AP-1 in SP-1, morda skupne povezave med PAI-1 in kopičenjem ECM, ki ga povzroči CTGF, pri progresivniledvicabolezen in tubulointersticijskifibroza. Tako smo raziskali, ali6-BIOlahko prepreči kronično napredovanjeledvicabolezni z uravnavanjem PAI-1 in CTGF.

2. Material in metode

2.1. Protitelesa in reagenti

Primarna uporabljena protitelesa so bila protitelesa proti kuncem proti PAI-1 (11907), TGF (3711), fosforiliranaSMAD2/3 (8828), SMAD4 (38454), fosforiliran ERK (P-ERK) (9101), fosforiliran P38 (P-P38) (4631), fosforiliran JNK (P-JNK) (9251), fosforiliran C-JUN (PC-JUN) (3270) , fosforiliran C-FOS (PC-FOS) (5348) in histon H3 (9715), ki so bili vsi pridobljeni iz Cell Signaling Technology. CTGF (sc-365970), SP-1 (sc-17824),SMAD6 (sc-25321) so bili pridobljeni pri Santa Cruz Biotechnology. Mišja protitelesa proti aktinu (a5316) in (2'Z,3'E)-6-bromo indirubin-3-oksim (6-BIO) (B1686) so bili pridobljeni pri Sigma-Aldrich.

2.2. Poskusi na živalih

Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu z ustreznimi smernicami in predpisi. Eksperimentalni protokol je odobril Odbor za predpise o oskrbi živali (ACR) Medicinske fakultete nacionalne univerze Chonnam (CNUH IACUC-18010, 19. april 2019). Poskusi so bili izvedeni s samci podgan Sprague-Dawley (180–200 g, Samtako, Koreja) [38]. Podgane so hranili pri nadzorovani temperaturi (21 ± 2 ◦ C) v 12-urnem ciklu svetlo-tema. Podgane so bile razdeljene v tri skupine: kontrolna (n=6), enostranska obstrukcija sečnice (UUO, n=6) in UUO z6-BIOzdravljenje (n=6).6-BIO({{0}}.2 mg/kg/dan) je bil injiciran intraperitonealno (ip) 6 dni. Za razvoj modela obstruktivne nefropatije pri podganah je bila operacija izvedena na naslednji način: UUO je bil induciran z ligacijo levega sečevoda za sedem dni. Odprli smo trebušno votlino in na levi proksimalni sečevod namestili svileno ligaturo 2–0. Kontrolna skupina je prejemala enako zdravljenje sedem dni, razen ligature. Podgane so imele prost dostop do standardne krme za podgane in vode iz pipe in so bile žrtvovane 7. dan po operaciji. Theledviceso bili hitro odstranjeni in obdelani za imunohistokemijo in western blot.

2.3. Histologija

Ledvicatkiva so bila fiksirana s 4 odstotki paraformaldehida, vdelana v parafin in razrezana na 5 µm debele dele. Za oceno histološke morfologije so bili izvedeni postopki barvanja s hematoksilinom in eozinom (H&E), periodično kislino-Schiff (PAS), Siriusovo rdečo in Massonov trikrom (MT). H&E, PAS, Sirius rdeče barvanje smo izvedli po navodilih proizvajalca. Za barvanje z MT smo rezine po deparafinizaciji s ksilenom obdelali z Bouinovo raztopino pri 56 ◦ C 30 minut in jih sprali pod tekočo vodo iz pipe, dokler rezi niso postali bistri. Odseke smo nato obarvali z Weigertovim hematoksilinom (A: B=1:1), čemur je sledilo barvanje z raztopino Biebrich Scarlet/Acid Fuchsin 10 minut in pranje z destilirano vodo. Odseke smo 10 minut inkubirali z raztopino fosfovolframove kisline/fosfomolibdinske kisline in 15 minut obdelali z raztopino anilin modrega. Odseke smo nato 1 minuto inkubirali z ocetno kislino in dehidrirali z etanolom in ksilenom. Odložitve kolagena, jedra in mišična vlakna so bili obarvani modro, črno oziroma rdeče. Kvantitativno analizo obarvanega odseka smo izvedli s programsko opremo ImageJ.

2.4. Western blot analiza

Celice smo pobrali, dvakrat sprali z ledeno mrzlo fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS), resuspendirali v pufru za lizo in na kratko obdelali z ultrazvokom. Pufer za ekstrakcijo beljakovin je bil sestavljen iz 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 odstotka Nonidet P-40, 0,1 odstotka SDS, mešanice zaviralcev proteaz (GenDEPOT, P3100– 001) in koktajl zaviralcev fosfataze

(GenDEPOT, P3200–001). Po centrifugiranju smo zbrali supernatante, ki so vsebovali proteinske ekstrakte, in izmerili koncentracije proteinov z uporabo Pierce® BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, ZDA). Proteine ​​smo ločili na 12-odstotnem natrijevem dodecil sulfat-poliakrilamidnem gelu in prenesli na nitrocelulozne membrane. Blote smo blokirali pri sobni temperaturi 1 uro s 5 odstotki posnetega mleka v PBS, ki je vseboval 0,1 odstotka Tween-20 (PBST). Blot smo nato čez noč inkubirali s primarnim protitelesom (1;2000) pri 4 ◦ C, čemur je sledila inkubacija s sekundarnim protitelesom (1:2500) in nazadnje s protitelesi proti kunčji hrenovi peroksidazi, konjugiranimi s peroksidazo, kot je opisano prej [39]. ]. Specifične beljakovinske pasove smo vizualizirali z uporabo izboljšanega kemiluminiscenčnega sistema. Kvantitativna analiza

intenzivnost pasu je bila izvedena s programsko opremo ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, ZDA).

2.5. knockdown siRNA

Za uničenje SP-1, SP-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-29487) in kontrolne siRNA (Santa Cruz, sc-37007) sta bili transfektirani 24 ur v celice HK-2 in NRK49F pri 60-odstotni konfluenci z uporabo transfekcijskega reagenta Dhar-maFECT 1 (Dharmacon, T-2001–02) pri končni koncentraciji 30 nM. Celice smo inkubirali v mediju brez seruma en dan v 37^◦ C inkubator pod navlaženo 5-odstotno atmosfero CO 2, predhodno obdelan z 6-BIO 1 uro in stimuliran s TGF- 24 ur. Učinkovitost knockdowna je bila določena z Western blot analizo.

2.6. Prehodna transfekcija plazmida in reporterskega konstrukta

Celice smo gojili do 60–70 odstotkov konfluentnosti, jih sprali z medijem DMEM-F-12 (celice HK-2) ali DMEM (celice NRK49F) in nato inkubirali 24 ur v ustreznem mediju brez seruma in antibiotikov . Celice smo nato transficirali z dominantno-negativnim konstruktom C-JUN, pa tudi s PAI-1, CTGF, AP-1 in SP-1 reporterjem, ki nosi vektor pGL3, z uporabo reagenta FuGene HD. Koncentracija reporterskega plazmida, uporabljenega pri prehodni transfekciji, je bila 2 μg (1 μg/ μL). Reportersko transficirane celice so bile predhodno obdelane z 6-BIO 1 uro in inkubirane z 10 ng/mL TGF 16 ur.

2.7. Test promotorskega reporterja

Reporterske konstrukte PAI-1 in CTGF je izdelal BIO FACT (Yuseong-gu, Daejeon, Republika Koreja). Reporterska konstrukta pGL3-AP-1 in pGL3-SP-1 je prijazno zagotovil profesor Young Do Jung (nacionalna univerza Chonnam). Transkripcijska regulacija PAI-1, CTGF, AP-1 in SP-1 je bila raziskana s prehodno transfekcijo njihovih ustreznih reporterskih konstruktov pGL3 promotor-luciferaza. Celice HK-2 in NRK49F (5 × 10 5) so bile zasejane in rasle, dokler ni bilo doseženo 60–70-odstotno sotočje. Nato smo promotorske konstrukte in pGL3-prazne vektorje transfektirali v celice z uporabo FuGene HD v skladu s protokolom proizvajalca. PRL-null plazmid, ki kodira Renilla luciferazo, je bil vključen v vse vzorce za spremljanje učinkovitosti transfekcije. 24 ur po transfekciji so bile stopnje aktivnosti kresničke in Renilla luciferaze izmerjene zaporedno iz enega vzorca z uporabo sistema za testiranje Dual-Glo Luciferase (Promega). Aktivnost luciferaze kresničke je bila normalizirana na aktivnost Renilla in relativno količino aktivnosti luciferaze v neobdelanih celicah.

2.8. Konfokalna laserska mikroskopija

Podganaledvicavzorce smo fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu, vdelali v parafin in razrezali na 3- μ m debele odseke.Ledvicasekcije so bile deparafinizirane in rehidrirane, blokirane, sprane s PBS in inkubirane z anti-PAI-1, anti-CTGF, anti-PC-JUN, anti-PC-FOS, anti-SP-1 in protitelesa proti AQP1, razredčena v pufru za blokiranje, 24 ur pri

4 ^◦C. Po izpiranju so sekcije inkubirale s Alexa Fluor 488 (zelena fluorescenca) kozjim anti-kuncem (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA), Cy3 (rdeča fluorescenca) kozjim anti-mišjim ali kozjim anti-kunčjim (Invitrogen) , Oregon) protitelesa 2 uri. Celice HK-2 in NRK49F (3 ×10 5) smo zasejali v {{10}}prekatke z vdolbinicami in inkubirali 24 ur pri 37 ◦ C. Celice smo predhodno obdelali s 5 μ M 6-BIO za 1 uro in nato izpostavljen 10 ng/mL TGF za 16 ur. Po izpiranju z 1X PBS so bile celice fiksirane s 4 odstotki paraformaldehida pri sobni temperaturi 15 minut in blokirane 2 uri pri sobni temperaturi z 1X PBS, ki je vseboval 1 odstotek BSA in 0,2 odstotka Triton X-100. Celice smo nato inkubirali s kunčjimi ali mišjimi monoklonskimi protitelesi proti PAI-1, CTGF, PC-JUN, PC-FOS in SP-1 (razredčenih 1:200 v pufru za blokiranje) pri 4 stopinjah 24 h. Po izpiranju smo celice inkubirali z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (Cy3 kozja protitelesa proti zajcem in proti mišjem, Alexa Fluor 488 kozja protitelesa proti kuncem in proti mišjem, razredčena 1:200) 2 uri pri sobni temperaturi. Po izpiranju so bila pokrovna stekelca nameščena na mikrostekelca z uporabo ProLong Gold Antifade reagenta z DAPI (Life Technologies Corporation). Slike so bile analizirane pod konfokalnim laserskim skenirnim mikroskopom Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Nemčija).

2.9. Statistična analiza

Rezultati so bili izraženi kot povprečje ± SEM. Večkratne primerjave med skupinami so bile izvedene z enosmerno ANOVA in post hoc testom pošteno pomembne razlike (HSD) po Tukeyju. Rezultati s p < 0,05="" so="" veljali="" za="" statistično="">

3. Rezultati

3.1. 6-BIO zmanjša morfološke spremembe in izražanje markerjev, povezanih s fibrozo, v modelu UUO podgan

Ocenili smo učinke 6-BIO nafibrozavledvicemodela podgane UUO. Kot je prikazano na sliki 1A, se je model UUO izrazito povečalledvicatubulointersticijska poškodba, glomerularna skleroza, intersticijska infiltracija mononuklearnih celic, odlaganje intersticijskega kolagena infibrozav primerjavi s kontrolami, kot je bilo ugotovljeno z barvanjem H&E, PAS, Sirius Red in MT. Poleg tega proteini, povezani z EMT, ki inducirajoledvicafibrozakot tudi kolagen I in -IV, ki povečata kopičenje ECM, sta bila povečana pri UUO v primerjavi s kontrolami (sl. S1A in C). Vendar so bile te spremembe z 6-BIO zdravljenjem oslabljene. Slika 1B prikazuje, da se je po 7 dneh obstrukcije izražanje proteinov PAI-1, CTGF, -SMA in TGF povečalo v ledvicah modelov UUO podgan v primerjavi s tistimi pri kontrolah, to povečanje pa je oslabilo zdravljenje z 6-BIO. Izrazfibrotičnioznačevalci so se izrazito povečali pri UUO v primerjavi s kontrolami, kar je preprečil6-BIOzdravljenje (slika 1C). Imunofluorescenčno barvanje (slika 1D) je razkrilo, da se je izražanje PAI-1 in CTGF (rdeča fluorescenca) povečalo v oviraniledvicena dan-7 v primerjavi s kontrolami. Vendar se je izražanje PAI-1 in CTGF zmanjšalo po 6-BIO zdravljenju (slika 1D). Te ugotovitve skupaj kažejo, da 6-BIO zmanjša tubulointersticijsko poškodbo z zaviranjem izražanja PAI-1 in CTGF.

3.2. 6-BIO oslabi izražanje PC-JUN, PC-FOS, SP-1 in zavira signalne poti, povezane s fibrozo, v modelu UUO podgan

Nato smo ugotovili, ali6-BIOvpliva na signalne poti, povezane zledvicafibroza. Najprej smo to potrdili6-BIO, ki je znan zaviralec GSK3, zavira fosforilacijo GSK3. Sliki S1A in B prikazujeta zmanjšanje GSK3 z 6-BIO. Slika 2A prikazuje TGF /SMADsignalna pot. Western blot analiza je pokazala, da je izražanje fosforiliranihSMAD2/3 inSMAD4 beljakovine so se povečale v UUOledvice, ki je bil oslabljen z 6-BIO zdravljenjem (slika 2A). vendarSMAD6, ki zavira fosforilacijo SMAD 2 in aktivnostSMAD4 [40], je imel nasprotne rezultate. Poleg tega ima signalizacija MAPK ključno vlogo priledvicafibroza [41,42]. Izvedli smo Western blot analizo, da bi ugotovili, ali 6-BIO vpliva na signalizacijo MAPK. Ravni fosforiliranega ERK, JNK in P38 so se povečale pri UUOledvicev primerjavi s tistimi v nadzoruledvice(Slika 2B). Izražanje fosforiliranih ERK in JNK je bilo znatno zmanjšano z 6-BIO zdravljenjem, medtem ko je bilo zmanjšanje fosforiliranega nivoja p38 zanemarljivo (slika 2B).SMADin MAPK signalne poti so bile regulirane navzgor v skupini UUO, kar je bilo obrnjeno z6-BIOzdravljenje (slika 2C). Vpletenih je veliko transkripcijskih faktorjevledvicafibrozain igrajo ključno vlogo pri uravnavanju genske ekspresije navzdol. Slika 2D prikazuje, da se je po 7 dneh obstrukcije izražanje proteinov PC-JUN, PC-FOS in SP-1 povečalo vledvicepodgan z UUO v primerjavi s tistimi pri kontrolah, to povečanje pa je bilo oslabljeno z 6-BIO zdravljenjem. Podobno izražanje AP-1 in SP-1, pomembnih transkripcijskih faktorjev, ki uravnavajoledvicagenov, povezanih s fibrozo, je bil izrazito povečanledvicepodgan z UUO, vendar je bila oslabljena po zdravljenju z 6-BIO (slika 2E). Slika 2F prikazuje imunofluorescenčno barvanje PC-JUN, PC-FOS. in SP-1. Rdeča fluorescenca obarvanja PC-JUN, PC-FOS in SP-1 je bila znatno povečana pri obstrukcijiledvice, v primerjavi s kontrolami, zmanjšalo pa se je z 6-BIO zdravljenjem. Ti rezultati potrjujejo, da sta AP-1 in SP-1 pomembna transkripcijska faktorja, ki sodelujeta priledvicafibroza in6-BIOse lahko zmanjšaledvicafibrozo z oslabitvijo njihove transkripcijske aktivnosti.

Za 2. del kliknitetukaj.