za več informacij:ali.ma@wecistanche.com

Kliknite tukaj za 2. del

Yasaman Alaghbanda,b,c, Janine L. Kwapisa,b,d, Alberto J. Lópeza,b,c, André O. Whitea,b,c,3, Osasumwen V. Aimiuwua,b,c,1, Amni Al- Kachaka,b,c,2, Kasuni K. Bodinayakea,b,c,

Nicole C. Oparaugoa,b,c, Richard Danga,b,d, Mariam Astarabadia,b,c,4, Dina P. Matheosa,b, in Marcelo A. Wooda,b,c,d

a301 Raziskovalni laboratorij Qureshey, Oddelek za nevrobiologijo in vedenje, Center za

Nevrobiologija učenja inSpomin, Univerza v Kaliforniji, Irvine, Irvine, Kalifornija, 92697 centrov za nevrobiologijo učenja inSpomin(CNLM), Irvine, Kalifornija, 92697 c

Irvine Center for Addiction Neuroscience (ICAN), Kalifornijska univerza, Irvine, Kalifornija, 92697d Inštitut zaSpominOkvare in nevrološke motnje, Kalifornijska univerza, Irvine,

Kliknite zaKoristi in stranski učinki Cistanche tubulosa za izboljšanje spomina

Povzetek

Histonske deacetilaze (HDAC) so encimi, ki spreminjajo kromatin in so bili vpleteni kot močni negativni regulatorjispominprocesov. Izkazalo se je, da ima HDAC3 ključno vlogo pri dolgoročnem spominu za lokacijo predmeta, pa tudi pri izumrtju s kokainom povezanihspomin, vendar ni jasno, ali je ta funkcija odvisna od domene deacetilaze HDAC3. Tukaj smo preizkusili, ali ima domena deacetilaze HDAC3 vlogo pri lokaciji objektaspominnastanek ter nastanek in izumrtje spominov, povezanih s kokainom. Z uporabo mutanta mrtve točke deacetilaze HDAC3 smo ugotovili, da je selektivno blokiranje aktivnosti deacetilaze HDAC3 v dorzalnem hipokampusu izboljšalo dolgoročni spomin za lokacijo predmeta, vendar ni vplivalo na tvorbo spomina, povezanega s kokainom. Ko je bil ta isti točkovni mutirani virus HDAC3 infundiran v prelimbični korteks, ni vplival na s kokainom povezanespominnastanek. V zvezi z izumrtjem okvara domene deacetilaze HDAC3 v infralimbičnem korteksu ni vplivala na izumrtje, vendar so opazili olajšan učinek izumrtja, ko je bil točkovni mutant virus dostavljen v hrbtni hipokampus. Ti rezultati kažejo, da ima deacetilazna domena HDAC3 selektivno vlogo v specifičnih možganskih regijah, ki so dolgoročno osnovaspominnastajanje lokacije predmeta ter povezana s kokainomspominnastanek in izumrtje.

Ključne besede

dolgoročni spomin; epigenetika; kromatin; lokacija objekta; pogojena prednost kraja; dorzalni hipokampus

Uvod

Acetilacija histona je dobro raziskan mehanizem za spreminjanje kromatina, ki je vključen v regulacijo genske ekspresije, potrebne zaspomin. Številne študije so pokazale, da je acetilacija histona dolgoročnaspomintvorba (ogledano v Levenson in Sweatt, 2006; McQuown in Wood, 2011; Gräffand Tsai, 2013; Peixoto in Abel, 2013; Penney in Tsai 2014). Acetilacijo histonov izvajajo histonske acetiltransferaze in histonske deacetilaze (HDAC), ki na splošno olajšajo oziroma zavirajo izražanje genov (Jenuwein in Allis 2001; Kouzarides, 2007). Histon deacetilaza 3 (HDAC3) je najbolj izražen HDAC razreda I v možganih in ta specifični HDAC je močan negativni regulator procesov učenja in spomina (Kwapis et al., 2017; Malvaez et al., 2013; McQuown et al. ., 2011; Rogge et al., 2013). Naš laboratorij je pokazal, da ima HDAC3 ključno vlogo pri lociranju predmeta in oblikovanju spomina, povezanega s strahom (McQuown et al., 2011; Kwapis et al., 2017) z uporabo manipulacij HDAC3, specifičnih za hipokampus in amigdalo. Pokazali smo tudi, da inhibicija HDAC3 olajša izumrtje vedenja iskanja drog na način, ki blokira ponovno vzpostavitev (Malvaez et al., 2013). Poskusi izumrtja v Malvaezu et al (2013) so uporabili selektivni inhibitor HDAC3, ki so ga dajali sistemsko, zato nismo mogli ugotoviti, katere možganske regije so najpomembnejše za HDAC3-odvisno modulacijo izumrtja.

HDAC3 sam ima močno deacetilazno aktivnost (Guenther et al., 2002; Lahm et al., 2007; Zhang et al., 2002) in se povezuje s HDAC4/HDAC5 prek interakcij s korepresorjem jedrnega receptorja korepresorja (NCoR) v tvorijo funkcionalen multi-proteinski represorski kompleks (Guenther et al., 2001; Fischle et al., 2002; Alenghat et al., 2008). Ena ideja je, da so ti večproteinski kompleksi morda potrebni za deacetilacijo, ker ima HDAC4 malo ali nič katalitične aktivnosti na kanoničnih substratih acetil-lizina (Lahm et al., 2007). Dokazano je, da HDAC4 moduliraspominneodvisno od njegove domene deacetilaze (Sando et al., 2012). Zunaj področja učenja inspomin, HDAC3-posredovana genska ekspresija v drugih tkivih ne zahteva nujno encimske funkcije HDAC3 (Sun et al., 2013), kar nakazuje, da morda deacetilazna aktivnost HDAC3 morda ni potrebna za tvorbo spomina. Do nedavnega aktivnost deacetilaze HDAC3 pri oblikovanju spomina ni bila neposredno testirana. Kwapis in sodelavci (2017) so dokazali, da je encimska aktivnost HDAC3 dejansko potrebna za od amigdale odvisne oblikespominnastanek.

Prejšnje študije so pokazale, da lahko sistemsko dajanje zaviralca HDAC3 olajša oblikovanje lokacije objektaspomin(OLM), kot tudi izumrtje konteksta, povezanega s kokainomspomin(Malvaez et al., 2013). Vendar, ali je aktivnost deacetilaze HDAC3 potrebna za lokacijo objektaspominOLM v hipokampusu in izumrtje spomina, povezanega s kontekstom kokaina, v infralimbičnem korteksu ostaja nejasno. V trenutni študiji smo posebej ciljali na aktivnost deacetilaze HDAC3 pri tvorbi spomina, odvisnem od hipokampusa, kot tudi v dorzalnem hipokampusu (DH), prelimbičnem korteksu (PrL) in infralimbičnem korteksu (IL) glede na pridobitev in izumrtje s kokainom pogojena preferenca mesta ali kontekst, povezan s kokainomspominprocesov.

Materiali in metode

Predmeti

Vse postopke je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze v Kaliforniji Irvine in so bili v skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje. Miši so bile stare 8–12 tednov in so imele dostop do hrane in vode ad libitum v svojih domačih kletkah z lučmi, vzdrževanimi v 12-urnem ciklu svetloba/tema. Vedenjsko testiranje je bilo izvedeno med svetlim delom cikla. Subjekti so bili odrasli samci miši C57BL/6J za poskuse AAV-HDAC3(Y298H)-v5. Za eksperiment z brisanjem HDAC3 flox so bile miši Hdac3flox/flox in divji tip Hdac3 plus / plus miši iz legla vzdrževane na ozadju C57BL/6J (Mullican et al., 2011). Na kratko, te miši so bile ustvarjene v laboratoriju dr. Mitcha Lazarja na Univerzi v Pensilvaniji (Philadelphia, PA) z mesti loxP, ki obkrožajo ekson 4 do ekson 7 gena Hdac3, regije, potrebne za katalitično aktivnost encima (Mullican et. al., 2011).

Droge

Kokain-HCl je bil kupljen pri Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, ZDA) in raztopljen v fiziološki raztopini (0.9 odstotkov NaCl). Kokain-HCl je izražen kot teža soli. Za trening kokaina-CPP v poskusih pridobivanja je bil kokain-HCl raztopljen do končne koncentracije 0.5 mg/ml in dajan v volumnu 10 ml/kg telesne teže, kar je povzročilo končni odmerek 5 mg/kg. Za trening s kokainom-CPP v poskusu ekstinkcije je bil kokain-HCl raztopljen do končne koncentracije 2 mg/ml in dajan v volumnu 10 ml/kg telesne teže, kar je dalo končni odmerek 20 mg/kg. Kokain-HCl in fiziološko raztopino so dajali intraperitonealno (ip).

Operacija

Miši so inducirali s 4 odstotki izoflurana v kisiku in vzdrževali pri 1,5–2.0 odstotka med trajanjem operacije. Živalim so injicirali AAV-HDAC3(Y298H)-v5 ali AAV-EV (prazen vektor) (Kwapis et al., 2017). Za poskuse DH je bil dvostransko infundiran 1 µlofvirus. Za prelimbične in infralimbične poskuse smo dvostransko infundirali 0.3 µl virusa. Za potrditev izražanja HDAC3(Y298H) smo uporabili imunofluorescenco. Injekcijske igle so bile spuščene na želene koordinate s hitrostjo 0,2 mm/15 s. {{20}}min po dosegu ciljne globine je bil virus injiciran s hitrostjo 6 µl/h. Po infundiranju so injekcijske igle pustile na mestu 2- min, da so virusu omogočili difuzijo. Injektorje so nato dvignili 0.1 mm in pustili stati še eno minuto, preden so jih počasi odstranili (0.1 mm/15 s). Rez so zašili in pustili 2 tedna za popolno izražanje virusa pred obnašanjem. Virusi so bili infundirani z dvojnimi infuzorji velikosti 28 (DH: 3 mm od središča do središča; PrL/IL: 0.8 mm od središča do središča), pritrjenimi na cevje PE50 in povezanimi s Hamiltonovimi brizgami nameščeni na infuzijskih črpalkah. Koordinate za DH so bile: AP, −2,0 mm; ML, ±1,5 mm; DV, −1,5 mm glede na Bregmo. Koordinate za PrL so bile: AP, plus 1,9 mm; ML, ±0,4 mm; DV, −2,2 mm glede na Bregmo. Koordinate za IL so bile: AP, plus 1,5; ML, ±0,4 mm; DV, −3,2 mm glede na Bregmo.

Produkcija AAV

Divji tip HDAC3 je bil pomnožen iz cDNA mišjega hipokampusa in kloniran v modificiran pAAV-IRES-hrGFP (Agilent), pod nadzorom promotorja CMV in -globinskega introna. Da bi ustvarili točkovno mutacijo, je bila ustvarjena ena nukleotidna substitucija v eksonu 11 za usmerjanje proizvodnje ostanka histidina namesto tirozina pri aminokislini 298 (plazmid MW92). Za kontrolo praznega vektorja kodirno zaporedje HDAC3 ni bilo prisotno, ostali pa so vsi drugi elementi (plazmid MW87). Adeno-povezan virus (AAV) je izdelal Penn Vector Core (Univerza v Pensilvaniji) iz zgoraj opisanih plazmidov in je bil serotipiziran z AAV 2.1. Končni titer AAV-HDAC3(Y298H) je bil 6,48 × 1012 GC/mL, končni titer AAV-EV pa 1,35 × 1013 GC/mL.

Imunofluorescenca

V vedenjskih poskusih, prikazanih na slikah 2–7, je imela vsaka žival, vključena v analize vedenja, virusno infuzijo, potrjeno z imunohistokemijo. Miši so bile evtanazirane z izpahom materničnega vratu, njihovi možgani pa so bili odstranjeni in hitro zamrznjeni v ledeno mrzlem izopentanu. 20µm rezine so bile zbrane v celotnem IL/PrL ali DH, odmrznjene na stekelcih in shranjene pri –80 stopinjah do uporabe. Za imunofluorescenčno analizo so bila stekelca fiksirana s 4 odstotki paraformaldehida za 10 minut in permeabilizirana v 0,01 odstotka Triton X-100 v 0,1 M PBS za 15 minut. Stekelca smo nato za 1 uro blokirali pri sobni temperaturi v 8-odstotnem normalnem kozjem serumu (Jackson) in jih čez noč inkubirali pri 4 stopinjah v primarnem protitelesu (protitelo HDAC3 klon Y415: 1:250; Abcam). Naslednji dan smo preparate inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi s kozjim anti-kunčjim Alexa 488 (razredčitev 1:1 000, Invitrogen) v temi, čemur je sledila bodisi 15--minutna inkubacija DAPI (1: 10.000, Invitrogen; DH). Za poskuse, v katerih je bilo uporabljeno rdeče fluorescentno barvilo Nissl NeuroTrace (1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies), so bila stekelca inkubirana 50 minut pri sobni temperaturi, čemur sta sledili dve izpiranji z 0,01-odstotnim Triton-X-100 za 5 minut in nato dve izpiranji v PBS po 5 minut. Predmetna stekelca so prekrili z nosilnim medijem VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Vse slike so bile pridobljene z Olympus Scanner VS110 z 20× apokromatskim objektivom (numerična apertura 0,75) s programsko opremo za optični bralnik VS110. Vse zdravljene skupine so bile predstavljene na vsakem diapozitivu in vse slike na diapozitivu so bile posnete z enakim časom osvetlitve. Intenzivnost imunskega označevanja je bila kvantificirana z ImageJ z vzorčenjem optične gostote v celični plasti CA1, normalizirane na ozadje.

Kvantitativna RT-PCR

Kvantitativni RT-PCR v realnem času je bil izveden za preverjanje ekspresije V5 in povečanja ekspresije divjega tipa Hdac3mRNA po infuziji AAV-HDAC3(Y298H) (poskus 1), kot je opisano prej (López et al., 2016; White et al., 2016). Za poskus 1 so bili 1 mm udarci v DH zbrani iz 500 µm rezin na območju ekspresije virusa (ali enakovrednega območja pri miših EV), kar je potrjeno z imunofluorescenco. Vse tkivo je bilo do obdelave shranjeno pri -80 stopinjah.

RNA je bila izolirana z uporabo RNeasy Minikit (Qiagen) in cDNA je bila ustvarjena z uporabo kompleta Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche Applied Science). Uporabljeni so bili naslednji primerji, pridobljeni iz Roche Universal ProbeLibrary: Hdac3right primer, 5'- ttcaacgtgggtgatgactg-3'; Hdac3left primer, 5'- ttagctgtgttgctccttgc-3'; sonda, ctgctccc; Hdac3-v5right primer, 5'-tggagattctcgagggtaagc-3'; Hdac3-v5left primer, 5'- atgccacccgtagatctgg-3'; sonda, ctctcctc. Vsaka od sond za te ciljne gene je bila konjugirana z barvilom FAM. Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (Gapd) je bila uporabljena kot referenčni gen za vse teste RT-qPCR. Za Gapd smo uporabili naslednje primerje: levi primer, 5'atggtgaaggtcggtgtga-3'; desni primer, 5-aatctccactttgccactgc-3'; sonda, tggcggtattgg. Gapdprobe je bil konjugiran z LightCycler Yellow 555. Neprekrivajoča se barvila in dušilec na referenčnem genu omogočajo multipleksiranje v napravah Roche LightCycle 480 II (Roche Applied Sciences). Vse vrednosti so bile normalizirane na ravni izražanja Gapd. Analizo in statistiko smo izvedli z lastniškimi algoritmi Roche in programsko opremo REST 2009, ki temelji na metodi Pfaffl (Pfaffl 2001; Pfaffl et al., 2002).

OLM in ORM naloge

Za OLM in prepoznavanje novih predmetovspomin(ORM), podatki o navajanju (prepotovana razdalja med posameznimi sejami navajanja), videoposnetki o usposabljanju in testiranju so bili zbrani s programsko opremo za vedenjsko analizo ANY-maze. Usposabljanje in testiranje za OLM in ORM sta bila izvedena, kot je opisano prej (López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Vogel-Ciernia et al., 2013; Vogel-Ciernia in Wood, 2014). Pred treningom so miši obravnavali 1–2 minuti 4 dni in jih navajali na eksperimentalno napravo 5 minut v komoro OLM 6 zaporednih dni v odsotnosti predmetov. Med poskusom usposabljanja so miši postavili v eksperimentalno napravo z dvema enakima predmetoma (OLM: 100 ml čaše, premer 2,5 cm, višina 4 cm; ORM: pločevinke za začimbe in stekleni svečniki) in jim dovolili, da te predmete raziskujejo 3 minute. , ki ne povzroči kratkoročno ali dolgoročnospomin. Prej smo pokazali, da 3-minutno obdobje usposabljanja ne zadostuje za ustvarjanje LTM, testiranega po 24 urah (Haettig et al., 2011, 2013; López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Stefanko et al., 2009) . Štiriindvajset ur kasneje je bila retenca živali testirana 5 minut. Za OLM je bila ena kopija znanega predmeta postavljena na isto mesto kot med učnim poskusom, ena kopija znanega predmeta pa je bila postavljena na sredino škatle. Za ORM sta bila ena kopija znanega predmeta in nov predmet postavljena na isto mesto kot med poskusom usposabljanja. Vsi poskusi usposabljanja in testiranja so bili posneti z video posnetki in ročno točkovani s strani posameznikov, ki niso vedeli za zdravljenje živali. Videoposnetki so bili analizirani za skupno raziskovanje predmetov poleg indeksa diskriminacije (DI) [(čas, porabljen za raziskovanje novega cilja, porabljen za raziskovanje znanega predmeta)/(skupni čas za raziskovanje obeh predmetov) × 100 odstotkov]. Vse kombinacije in lokacije predmetov so bile uporabljene na uravnotežen način, da bi zmanjšali morebitne pristranskosti, ki jih je mogoče pripisati preferencam za določene lokacije ali predmete.

Aparat za pogojeno prednostno mesto

Kondicioniranje prednostnih mest je bilo izvedeno, kot je opisano prej v naših študijah (Malvaez et al., 2011; Rogge et al., 2013; White et al., 2016). Na kratko, miši smo ravnali 1 minuto vsak dan 3 dni pred začetkom poskusa (dnevi 1–3). Postopek CPP za vse poskuse je bil izveden z uporabo nepristranskega, protiutežnega protokola. Osnovne preference za vsakega od poskusov so bile ocenjene tako, da so bile živali postavljene v sredinski prekat aparata za preferenco mesta in omogočen prost dostop do vseh predelkov za 15 minut (predtest; 4. dan). Faza usposabljanja se je začela en dan po predtestu. Kondicioniranje je potekalo v naslednjih 4 dneh z zaprtimi vrati giljotine, s čimer so bile živali zaprte v enega od dveh zunanjih predelkov aparata CPP za 30 minut (dnevi 5–8). Uporabljena je bila nepristranska zasnova, tako da je polovica živali prejela kokain pred namestitvijo v karirasti predelek, polovica pa je prejela kokain pred namestitvijo v bel predel na 1. dan usposabljanja (CS plus). Naslednji dan sta bila zdravljenje in predelek obrnjena za vsako žival (2. dan usposabljanja), miši smo vbrizgali fiziološko raztopino pred namestitvijo v nadomestni predel (CS−). Injekcije so bile spremenjene za naslednje priprave. Za poskuse pridobivanja, prikazane na sl. 3–5 so živali prejele skupaj dve 30--minutni pari s kokainom v enem predelku in dve 30--minutni pari s fiziološko raztopino v drugem. Oseminštirideset ur po zadnjem kondicioniranju je bila prednost (15 min; po testu 1; dan 10) ocenjena pri vseh živalih, kot je opisano zgoraj, v stanju brez zdravil. Za poskuse izumrtja, prikazane na sl. 6–7 so bile živali podvržene kondicioniranju, ki mu je sledil posttest 1 48 ur po zadnjem kondicioniranju, kot je opisano zgoraj. Dva tedna po infuziji virusa v DH ali IL so bile živali podvržene ponavljajočim se preferencialnim testom brez zdravil vsak dan (15 min; post-testi 2–5; dnevi 25–28). Ocena CPP je bila izračunana kot čas(-i), porabljen v predelkih s kokainom (CS plus) minus s fiziološko raztopino (CS−). Čas, porabljen v vsakem od velikih zunanjih predelkov, je analizirala avtomatizirana programska oprema iz videoposnetkov MPEG z uporabo programske opreme EthoVision 3.1 (Noldus Technology; glej Malvaez et al., 2011).

Statistična analiza

Za vse statistične analize je bil uporabljen program Graphpad Prism 7.02 (programska oprema GraphPad).

Navajanje je bilo analizirano z uporabo dvosmerne ANOVA za primerjavo skupne razdalje, prevožene med sejami navajanja. Podatki o usposabljanju in testiranju so bili analizirani s Studentovim t-testom za primerjavo bodisi raziskovanja bodisi DI med kontrolnimi in testnimi živalmi. Testni podatki so bili analizirani tudi z enostranskim t-testom, ki je primerjal vrednosti DI z nič, da bi ugotovili, ali je bila opažena pomembna diskriminacija ali ne. Poskusi CPP so bili analizirani z uporabo dvosmerne analize variance (ANOVA), ki so ji sledili Bonferronijevi posthoktestni testi s prednostnimi rezultati (PS) pri testih kot spremenljivke znotraj subjekta in skupina/genotip (prazen vektor v primerjavi s točkovnim mutantom Y298H; Hdac3 plus / plus vs. Hdac3flox/flox). Ta statistični test je bil uporabljen za posebne primerjave, ko so opazili pomembne interakcije in/ali učinke glavne skupine. Testni podatki so bili analizirani tudi z enostranskim t-testom, ki je primerjal vrednosti PS z ničlo, da bi ugotovili, ali je bila opažena pomembna prednost ali ne. Za poskuse ekstinkcije so najprej izvedli Studentove t-teste, da bi ugotovili, ali so živali imele pomembno preferenco pri posttestu 1 pred virusno infuzijo. Vrednosti RT-qPCR so bile pridobljene, kot je opisano zgoraj. Razlike v vrednostih RT-qPCR so bile ocenjene s Studentovim t-testom. Za vse analize je bila za pomembnost zahtevana vrednost 0.05.