1. del: Ehinakozid zavira sproščanje glutamata z zaviranjem od napetosti odvisnega Ca2 plus vstopa in protein kinaze C v cerebrokortikalnih živčnih terminalih podgan
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 in Su Jane Wang 3,*
Povzetek:
Glutamatergični sistem je lahko vpleten v učinke nevroprotektivnih terapij.Ehinakozid, feniletanoidni glikozid, ekstrahiran iz zdravilne kitajske rastlineHerba Cistanche, ima nevroprotektivne učinke. Ta študija je preučevala učinkeehinakozidna 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata v cerebrokortikalnih živčnih končičih podgan (sinaptosomi). Ehinakozid je zaviral od Ca2 plus odvisno, vendar ne od Ca2 plus neodvisno, 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata na način, ki je odvisen od koncentracije. Ehinakozid je tudi zmanjšal 4-z aminopiridin izzvano povečanje koncentracije prostega Ca2 plus v citoplazmi, vendar ni spremenil potenciala sinaptosomske membrane. Zaviralni učinek ehinakozida na 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata je preprečil o-konotoksin MVIIC, zaviralec širokega spektra kanalov Cav2.2 (N-tip) in Cav2.1 (P/Q-tip). , vendar je bil neobčutljiv na intracelularne zaviralce sproščanja Ca2 plus dantrolen in 7-kloro-5-(2-klorofenil)-1,5-dihidro-4 ,1-benzodiazepin-2(3H)-on (CGP37157). Poleg tega je ehinakozid zmanjšal 4-z aminopiridinom povzročeno fosforilacijo protein kinaze C, zaviralci protein kinaze C pa so odpravili učinek ehinakozida na sproščanje glutamata. Glede na te rezultate predlagamo, da je zaviralni učinek ehinakozida na izzvano sproščanje glutamata povezan z zmanjšanim od napetosti odvisnim vnosom Ca2 plus in kasnejšim zaviranjem aktivnosti protein kinaze C.
Ključne besede:ehinakozid; sproščanje glutamata; cerebrokortikalni živčni končiči; napetostno odvisni kanali Ca2 plus; protein kinaza C
1. Uvod
Ehinakozidje glavni feniletanoidni glikozid, prisoten vHerbaCistanche, znana tradicionalna kitajska medicina, ki se uporablja za zdravljenje pozabljivosti, impotence in kroničnega zaprtja [1].Ehinakozidima različne bioaktivnosti, kot so antioksidacija, protivnetno delovanje, proti raku, hepatoprotekcija in imunska modulacija [2–4]. Predvsem ima ehinakozid nevroprotektivne učinke; na primer, lahko zaščiti pred nevrotoksičnostjo, ki jo povzroči oksidativni stres ali nevrotoksin, v primarnih kortikalnih nevronih podgan, celicah človeškega nevroblastoma SH-SY5Y in celicah feokromocitoma (PC12) [5–8]. Poleg tega ehinakozid zmanjša poškodbe možganov in izboljša kognitivno funkcijo pri živalskih modelih Parkinsonove bolezni, Alzheimerjeve bolezni in okluzije srednje možganske arterije [9–12]. Vendar mehanizem, prek kateregaehinakozidpovzroča nevroprotekcijo, ni popolnoma razumljen.
Nevroprotekcija je kompleksen proces ohranjanja nevronske strukture in delovanja ob toksičnih insultih. Zmanjšanje ekscitotoksičnosti glutamata velja za potencialni mehanizem, vključen v nevroprotekcijo možganov. Glutamat, ekscitatorni aminokislinski nevrotransmiter, ima ključno vlogo pri več možganskih funkcijah [13]. Vendar prekomerna aktivacija glutamatnih receptorjev pod visokimi koncentracijami glutamata povzroči intracelularno Ca2 plus preobremenitev, mitohondrijsko disfunkcijo, nastajanje prostih radikalov in nevronsko smrt [14,15]. Ta patološki proces je vpleten v številne možganske motnje, vključno s cerebralno ishemijo, travmatsko poškodbo možganov, epilepsijo in nevrodegenerativno boleznijo [16,17]. Zato veljajo zaviralci, ki blokirajo patofiziološki glutamatergični prenos, potencialna nevroprotektivna zdravila. Pomembni primeri teh so antagonisti glutamatnih receptorjev [18,19]; vendar so bila klinična preskušanja teh zdravil neuspešna zaradi manjše učinkovitosti in nezaželenih ali celo citotoksičnih stranskih učinkov [20,21]. Poleg neposredne blokade glutamatnega receptorja je lahko zaviranje sproščanja glutamata učinkovita strategija za nevroprotekcijo. Več nevroprotektorjev (npr. memantin in riluzol) lahko zmanjša sproščanje glutamata v možganskih tkivih podgan [22–24].
Glede na vlogo glutamata pri ekscitotoksičnosti in nevroprotektivnem profilu ehinakozida je ta študija uporabila izolirane živčne končiče (sinaptosome), prečiščene iz možganske skorje podgan, da bi raziskala učinek ehinakozida na sproščanje glutamata in nadalje raziskala potencialne mehanizme. Izolirani pripravek živčnega terminala je dobro uveljavljen model za proučevanje presinaptične regulacije sproščanja nevrotransmiterjev z zdravili v odsotnosti kakršnih koli postsinaptičnih učinkov [25]. Z uporabo tega modela smo ovrednotili učinek ehinakozida na sproščanje glutamata, membranski potencial, presinaptični Ca2 plus dotok in aktivnost protein kinaze C. Po našem pregledu literature je to prvo poročilo, ki dokumentira mehanizem, prek katerega ehinakozid zavira endogeno sproščanje glutamata na presinaptični ravni.
2. Rezultati
2.1. EhinakozidZ zmanjšanjem vezikularne eksocitoze zavira 4-z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata iz cerebrokortikalnih živčnih končičev podgan
Slika 1 prikazuje od koncentracije odvisen učinek ehinakozida na 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata iz očiščenih cerebrokortikalnih sinaptosomov podgan. V sinaptosomih, inkubiranih z 1 mM CaCl2, je 1 mM 4-aminopiridin sprožil sproščanje glutamata 7,4 ± {{1{{20}}}.1 nmol/mg/5 min, ki je bil zmanjšan z 1, 5, 10, 30 in 50 uM ehinakozida na 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,
4,1 ± 0.1 oziroma 2,3 ± 0.4 nmol/mg/5 min (F(5,24)=67.1, p=0). 000). Vrednost IC50 za z ehinakozidom posredovano inhibicijo 4-z aminopiridin izzvanega sproščanja glutamata, izpeljana iz krivulje odmerek-odziv, je bila 24 uM. Poleg tega je sproščanje glutamata, ki ga sproži 1 mM 4-aminopiridina v zunajcelični raztopini brez Ca2 plus, ki vsebuje 300 uM etilen glikol bis(-aminoetil eter)-N,N,N/,N/-tetraocetne kisline (EGTA) je bil 2.1 0.2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000),
in na to od Ca2 plus neodvisno komponento 4-z aminopiridin izzvanega sproščanja glutamata ni vplivalo 20 uM ehinakozida (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p {{1 0}}.58; Slika 1). V sinaptosomih, zdravljenih z 0.1 uM bafilomicinom A1, zaviralcem vezikularnega prenašalca [26], se je 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata znatno zmanjšalo (2,2 ± 0.2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249.518, p=0.000). V prisotnosti bafilomicina A1 20 uM ehinakozid ni uspel pomembno zavirati sproščanja glutamata (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; slika 1). Nasprotno pa je 10 uM DL-treo-beta-benzil-oksiaspartat (DL-TBOA, zaviralec ponovnega privzema glutamata) [27] povečal 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata na 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, str=0.000). Celo v prisotnosti DL-TBOA je 20 uM ehinakozid znatno zaviral 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.000; Slika 1).
2.2 Ehinakozid zmanjša koncentracijo citosolnega Ca2 plus, vendar ne spremeni potenciala sinaptosomske membrane
Depolarizacija sinaptosoma, ki jo povzroči 1 mM 4-aminopiridin, je povečala koncentracijo Ca2 plus (p=0.000; tabela 1). Aplikacija 20 uM ehinakozida ni pomembno vplivala na bazalno koncentracijo Ca2 plus (t(8)=0.06, p=0.95), vendar je pomembno zmanjšala 4-z aminopiridinom povzročeno povečanje Ca2 plus koncentracija (t(10)=6.16, p=0.000). Poleg tega je 1 mM 4-aminopiridin povečal fluorescenco 3',3',3'-dipropiltiadikarbocianin jodida [DiSC3(5)] (p=0.000). Dodatek 20 uM ehinakozida ni spremenil membranskega potenciala v mirovanju (t(8)=0.976, p=0.36) ali bistveno spremenil povečanja DiSC3, ki ga povzroči 4-aminopiridin (5) fluorescenca (t(8)=-0.014, p=0.99; tabela 1).
2.3 Zmanjšan dotok Ca2 plus skozi kanala Cav2.2 (N-tip) in Cav2.1 (P/Q-tip) je lahko povezan z zaviranjem 4-z aminopiridin sproščanja glutamata z ehinakozidom
Slika 2 prikazuje, da je 2 uM o-konotoksin MVIIC, zaviralec Ca2 plus kanalov N- in P/Q tipa, zmanjšal 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata s 7,4 ± {{10}}. 2 do 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 min (t(9)=25.35, p=0.000). V prisotnosti o-konotoksina MVIIC je bil učinek 20 uM ehinakozida na 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata nepomemben (1.8 2± plus 0,2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06,p=0.32). Dantrolen (10 uM), zaviralec intracelularnega sproščanja Ca iz endoplazme
retikulum [28], zmanjšano 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata (5,6 ± 0.3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, str=0.000). Vendar pa lahko v prisotnosti dantrolena 20 uM ehinakozida še vedno pomembno zavre sproščanje glutamata (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Podobne rezultate so opazili pri uporabi 100 uM 7-kloro-5-(2-klorofenija)-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepina -2(3H)-on (CGP37157), membransko prepustni blokator mitohondrijske izmenjave Na plus /Ca2 plus. V petih pregledanih sinaptosomskih pripravkih je 20 uM ehinakozida v kombinaciji s 100 uM CGP37157 zmanjšalo 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata za 48,3 odstotka ± 5,2 odstotka (F(2,13) = 136.79, p {{ 49}}.000), podobno inhibiciji s samim ehinakozidom (46,2 odstotka ± 2,3 odstotka; p=0,89; slika 2).
2.4 EhinakozidZavira 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata s signaliziranjem prek protein kinaze C
Kot je prikazano na sliki 3, 10 uM 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimid (GF109203X), splošni zaviralec protein kinaze C [29], zmanjša 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata (F(2,13) = 19.46, p=0.{{17 }}). V sinaptosomih, obdelanih z GF109203X, je 20 uM ehinakozida zmanjšalo 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata samo za 5,5 odstotka ± 1,8 odstotka (p=0.89), kar je manj kot samo ehinakozid (42,4 odstotka ± 2,3). odstotki; p=0.000). Podobne rezultate smo dobili s 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pirolo[3 ,4-c]karbazol-12-propannitril (Go6976), selektiven za Ca2 plus odvisne izooblike proteinske kinaze C ( , I, II, y) [29]. V prisotnosti 3 uM Go6976 je 20 uM ehinakozida zmanjšalo sproščanje glutamata za 11,9 odstotka ± 2,9 odstotka (p=0.59), kar pomeni znatno zmanjšanje v primerjavi s tistim pri samem ehinakozidu (42,4 odstotka 2,3 odstotka; p {{ 65}}.000; Slika 3). Nasprotno pa 3 uM rottlerina, od Ca2 plus neodvisnega zaviralca proteinske kinaze C6 [30], ni bistveno spremenil 4-aminopiridina (1 mM) sproščanja glutamata (p=0.45). Kljub temu je v prisotnosti rottlerina 20 uM ehinakozida učinkovito povzročilo povprečno inhibicijo 37,1 odstotka ± 5,6 odstotka sproščanja (F(2,13) = 19.72, p=0.{{88 }}), podobno kot pri samem ehinakozidu (p=0.41; slika 3). Poleg tega zaviralec protein kinaze, aktiviran z mitogenom 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on) (PD98059 ) (50 uM) in inhibitor protein kinaze A N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-izokinolinsulfonamid (H89) (100 uM) sta zmanjšala 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata (p=0.000). Tudi v prisotnosti PD98059 ali H89 je 20 uM ehinakozida učinkovito zmanjšalo sproščanje (F(2,13) = 52.3, p=0.000; slika 3).
Slika 4 prikazuje, da je 1 mM 4-aminopiridin povečal fosforilacijo protein kinaze C v sinaptosomih (t(4)=-6.871, p=0.002). Ko so bili sinaptosomi predhodno obdelani z 20 uM ehinakozida 10 minut pred dodatkom 4-aminopiridina, se je 4-aminopiridinom inducirana fosforilacija protein kinaze C znatno zmanjšala (F(2,6)=29).202 , str=0.001).
2.5 Z ehinakozidom posredovana inhibicija sproščanja glutamata ne vključuje receptorja gama-aminomaslene kisline tipa A (GABAA).
Na sliki 5 je bil primerjan učinek ehinakozida na 4-z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata v odsotnosti ali prisotnosti SR95531 (antagonista receptorja GABAA). Poleg tega 100 uM SR95531 ni bistveno spremenilo 4-aminopiridina (1 mM) sproščanja glutamata. V sinaptosomih, zdravljenih s SR95531-, je uporaba 20 uM ehinakozida povzročila 43-odstotno inhibicijo sproščanja glutamata, ki ga povzroča 4-aminopiridin (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), ki se ni bistveno razlikovalo od inhibicije, ki jo povzroči sam ehinakozid (40 odstotkov; p=0.000). Podoben rezultat je bil dosežen z drugim antagonistom receptorja GABAA, bikukulinom (50 uM). Sproščanje, izmerjeno v prisotnosti bikukulina in ehinakozida, se je pomembno razlikovalo od tistega, pridobljenega v prisotnosti samega bikukulina (p=0.000).
3. Razprava
V tej študiji,ehinakozid, aktivna spojina v HerbiCistanche, zavira 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata v živčnih končičih možganske skorje podgan. Možni osnovni mehanizmi zaehinakozid-posredovana inhibicija sproščanja glutamata, se tukaj nadalje raziskuje in obravnava.
3.1 Mehanizmi, na katerih temelji z ehinakozidom posredovana inhibicija sproščanja glutamata
Sproščanje glutamata, ki ga izzove 4-aminopiridin, je sestavljeno iz dveh komponent: fiziološko pomembne Ca2 plus odvisne komponente, ki nastane z eksocitozo sinaptičnih veziklov, ki vsebujejo glutamat; in komponenta, neodvisna od Ca2 plus, ki izvira iz podaljšane depolarizacije, ki povzroči premik stanja dinamičnega ravnovesja transporterja glutamata, ki ga posreduje membranski potencial, v smeri navzven, kar vpliva na citosolni izliv glutamata [31]. Tukaj smo opazili, da ehinakozid ni bistveno zaviral 4-z aminopiridin izzvanega sproščanja glutamata v prisotnosti medija brez Ca2 plus (Ca2 plus neodvisno sproščanje). Poleg tega je opaženo z ehinakozidom posredovano zaviranje 4-z aminopiridin izzvanega sproščanja glutamata učinkovito preprečil bafilomicin A1 (ki zmanjša vsebnost glutamata v sinaptičnih mehurčkih), ne pa tudi DL-TBOA (ki neselektivno zavira vse ekscitatorne aminokisline podtipi prenašalcev). Ti rezultati kažejo, da ehinakozid vpliva na od Ca2 plus odvisno eksocitozo sproščanja glutamata, ne da bi vplival na od Ca2 plus neodvisen citosolni iztok glutamata prek obračanja transporterja glutamata na plazemski membrani živčnih terminalov. V sinaptičnih končičih inhibicija Na plus kanala ali aktivacija K plus kanala stabilizira razdražljivost membrane in posledično zmanjša izzvan vstop Ca2 plus in sproščanje nevrotransmiterjev [32,33]. Zato potencialni mehanizem, na katerem temelji zaviranje sproščanja glutamata, ki ga posreduje ehinakozid, vključuje zmanjšanje sinaptosomske razdražljivosti. Vendar je ta možnost nevzdržna na podlagi dveh opažanj: (1) 4-depolarizacija membranskega potenciala, izzvana z 4-aminopiridinom, izmerjena z barvilom DiSC3(5), občutljivim na membranski potencial, ni vplivala z dodatkom ehinakozida; in (2) ehinakozid ni vplival na 4-aminopiridin izzvano Ca2 plus -neodvisno sproščanje glutamata, komponento sproščanja, ki je odvisna le od membranskega potenciala [31]. Če učinka ne povzroči zatiranje sinaptosomske razdražljivosti, se lahko kaže v zmanjšanju aktivnosti Cav2.2 (tip N) in Cav2.1 (tip P/Q) Ca2 plus kanalov, povezanih z eksocitozo glutamata v živčnih končičev [34–36]. Z uporabo fura-2 dokazujemo, da ehinakozid pomembno zmanjša z 4-aminopiridinom izzvano povečanje koncentracije Ca2 plus. Poleg tega naši podatki kažejo, da se je zaviralni učinek ehinakozida na 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata zmanjšal s 42,4 odstotka 2,3 odstotka na 12,1 odstotka 3,9 odstotka po izpostavitvi blokatorju Cav2.2 (N-tip) in Cav2 .1 (P/Q-tip) Ca2 plus kanali. Poleg tega smo opazili, da je ehinakozid še naprej pomembno zaviral 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata v prisotnosti intracelularnih zaviralcev sproščanja Ca2 plus. Ti rezultati kažejo, da je hkratna supresija Cav2.2 (tip N) in Cav2.1 (tip P/Q) Ca2 plus kanalska potencialni mehanizem, na katerem temelji zaviranje sproščanja glutamata, ki ga posreduje ehinakozid. Vendar pa kombinirana aktivacija Cav2.2 (tip N) in Cav2.1 (tip P/Q) Ca2 plus kanalske aktivnosti ni mogla popolnoma blokirati delovanja ehinakozida. Zato so lahko v inhibicijo vključene druge neidentificirane vrste Ca2 plus kanalov ali druge presinaptične poti. Na primer, receptorji GABAA so prisotni na presinaptični ravni in dokazano je, da njihova aktivacija zavira dotok Ca2 in sproščanje glutamata [37]. V tej študiji antagonista receptorjev GABAA SR95531 in bikukulin nista blokirala inhibicije sproščanja glutamata, posredovane z ehinakozidom, kar kaže na to, da receptorji GABAA niso vključeni v zmanjšanje napetostno odvisne aktivnosti kanala Ca2 plus in v poznejše inhibicije sproščanja glutamata. Vstop Ca2 plus skozi napetostno odvisne kanale Ca2 plus aktivira več protein kinaz, povezanih s sproščanjem glutamata v živčnih končičih, vključno z mitogenom aktivirano protein kinazo, protein kinazo C in protein kinazo A. Tukaj prikazujemo, da so zaviralci protein kinaze C učinkovito antagonizirali ehinakozid -posredovana inhibicija sproščanja glutamata; kljub temu sta bila z mitogenom aktivirani inhibitor protein kinaze PD98059 ali inhibitor protein kinaze A H89 neučinkovita. Poleg tega se je 4-z aminopiridinom povzročena fosforilacija protein kinaze C zmanjšala v sinaptosomih po predhodnem zdravljenju z ehinakozidom v koncentraciji, ki je učinkovita za zaviranje sproščanja glutamata. Zato lahko signalna pot zaviranja sproščanja glutamata, posredovanega z ehinakozidom, vključuje protein kinazo C. Protein kinaza C je pomemben znotrajcelični signalni sistem, ki je prisoten na presinaptični ravni in ima ključno vlogo pri eksocitozi nevrotransmiterjev. Na primer, več sinaptičnih proteinov, vključenih v promet s sinaptičnimi vezikli ali novačenje in eksocitozo, kot je miristoilirani substrat C kinaze, bogat z alaninom, se fosforilira s protein kinazo C [38,39]. Ta proces fosforilacije se lahko poveča z vstopom Ca2 plus, stimuliranega z depolarizacijo, kar olajša sproščanje glutamata [40]. Zato lahko razumno špekuliramo, da lahko zaviralni učinek ehinakozida na vstop Ca2 plus, ki ga opazimo tukaj, zmanjša aktivnost protein kinaze C in posledično sproščanje glutamata.
