1. DEL Ehinakozid zavira sproščanje glutamata z zaviranjem od napetosti odvisnega Ca2 plus vstopa in protein kinaze C v cerebrokortikalnih živčnih terminalih podgan
Mar 07, 2022
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 in Su Jane Wang 3,*
1 Oddelek za anesteziologijo, Far-Eastern Memorial Hospital, okrožje Pan-Chiao, New Taipei City 22060, Tajvan; drluchengwei@gmail.com (CWL); drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)
2 Oddelek za strojništvo, Univerza Yuan Ze, Taoyuan 32003, Tajvan
3 Medicinska fakulteta, Katoliška univerza Fu Jen, št. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Tajvan.
Povzetek:Glutamatergični sistem je lahko vpleten v učinke nevroprotektivnih terapij. Ehinakozid, feniletanoidni glikozid, pridobljen iz zdravilne kitajske rastlineHerba Cistanche,ima nevroprotektivne učinke. Ta študija je preučevala učinke ehinakozida na 4-z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata v cerebrokortikalnih živčnih končičih podgan (sinaptosomih). Ehinakozid zavira Ca2 plus-odvisen, vendar ne Ca2 plus-neodvisno, 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata na način, ki je odvisen od koncentracije. Ehinakozid je tudi zmanjšal 4-z aminopiridinom izzvano povečanje prostega Ca v citoplazmi2 pluskoncentracije, vendar ni spremenil potenciala sinaptosomske membrane. Zaviralni učinek ehinakozida na 4-z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata je preprečil cu-konotoksin MVIIC, zaviralec širokega spektra kanalov Cav2.2 (N-tip) in Cav2.1 (P/Q-tip). , vendar je bil neobčutljiv na intracelularni Ca2 pluszaviralci sproščanja dantrolen in 7-kloro-5-(2-klorofenil)-1,5-dihidro-4,1-benzodiazepin{{ 8}}(3H)-on (CGP37157). Poleg tega je ehinakozid zmanjšal 4-z aminopiridinom povzročeno fosforilacijo protein kinaze C, zaviralci protein kinaze C pa so odpravili učinek ehinakozida na sproščanje glutamata. Glede na te rezultate predlagamo, da je zaviralni učinek ehinakozida na izzvano sproščanje glutamata povezan z zmanjšanim od napetosti odvisnim Ca2 plusvstop in kasnejša supresija aktivnosti protein kinaze C.
Ključne besede:ehinakozid; sproščanje glutamata; cerebrokortikalni živčni končiči; napetostno odvisen Ca2plus kanali; protein kinaza C Parkinsonove bolezni, Alzheimerjeve bolezni in okluzije srednje možganske arterije[9-12]. Vendar pa mehanizem, prek katerega ehinakozid inducira nevroprotekcijo, ni popolnoma razumljen.
Za več informacij se obrnite na:Joanna.jia@wecistanche.com
Ehinakozidv cistanche imajo številne funkcije
1. Uvod
Ehinakozidje glavni feniletanoidni glikozid, prisoten vHerba Cistanche, znana tradicionalna kitajska medicina, ki se uporablja za zdravljenje pozabljivosti, impotence in kroničnega zaprtja [1].Ehinakozidima različne bioaktivnosti, kot so antioksidacija, protivnetje, proti raku, hepatoprotekcija in imunska modulacija [2–4]. Zlastiehinakozidima nevroprotektivne učinke; na primer, lahko zaščiti pred nevrotoksičnostjo, ki jo povzroči oksidativni stres ali nevrotoksin, v primarnih kortikalnih nevronih podgan, celicah človeškega nevroblastoma SH-SY5Y in celicah feokromocitoma (PC12) [5–8]. Poleg tegaehinakozidzmanjša poškodbe možganov in izboljša kognitivno funkcijo pri živalskih modelih Parkinsonove bolezni, Alzheimerjeve bolezni in okluzije srednje možganske arterije [9–12]. Vendar mehanizem, prek kateregaehinakozidpovzroča nevroprotekcijo, ni popolnoma razumljen.
Nevroprotekcija je kompleksen proces ohranjanja nevronske strukture in delovanja ob toksičnih insultih. Zmanjšanje ekscitotoksičnosti glutamata velja za potencialni mehanizem, vključen v nevroprotekcijo možganov. Glutamat, ekscitatorni aminokislinski nevrotransmiter, ima ključno vlogo pri več možganskih funkcijah [13]. Vendar prekomerna aktivacija glutamatnih receptorjev pod visokimi koncentracijami glutamata povzroči intracelularno Ca2 plus preobremenitev, mitohondrijsko disfunkcijo, proizvodnjo prostih radikalov in nevronsko smrt [14,15]. Ta patološki proces je vpleten v številne možganske motnje, vključno s cerebralno ishemijo, travmatsko poškodbo možganov, epilepsijo in nevrodegenerativno boleznijo [16,17]. Zato veljajo zaviralci, ki blokirajo patofiziološki glutamatergični prenos, potencialna nevroprotektivna zdravila. Pomembni primeri teh so antagonisti glutamatnih receptorjev [18,19]; vendar so bila klinična preskušanja teh zdravil neuspešna zaradi manjše učinkovitosti in nezaželenih ali celo citotoksičnih stranskih učinkov [20,21]. Poleg neposredne blokade glutamatnega receptorja je lahko zaviranje sproščanja glutamata učinkovita strategija za nevroprotekcijo. Več nevroprotektorjev (npr. memantin in riluzol) lahko zmanjša sproščanje glutamata v možganskih tkivih podgan [22–24].
Ob upoštevanju vloge glutamata pri eksitotoksičnosti in nevroprotektivnem profiluehinakozid, je ta študija uporabila izolirane živčne končiče (sinaptosome), očiščene iz možganske skorje podgan, da bi raziskala učinekehinakozido sproščanju glutamata in nadalje raziskal možne mehanizme. Izolirani pripravek živčnega terminala je dobro uveljavljen model za proučevanje presinaptične regulacije sproščanja nevrotransmiterjev z zdravili v odsotnosti kakršnih koli postsinaptičnih učinkov [25]. S tem modelom smo ocenili učinekehinakozidna sproščanje glutamata, membranski potencial, presinaptični Ca2 plus influks in aktivnost protein kinaze C. Po našem pregledu literature je to prvo poročilo, ki dokumentira mehanizem, prek kateregaehinakozidzavira endogeno sproščanje glutamata na presinaptični ravni.
Echinacoside lahko antioksidira
2. Rezultati
2.1. EhinakozidZ zmanjšanjem vezikularne eksocitoze zavira 4-z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata iz cerebrokortikalnih živčnih končičev podgan
Slika 1 prikazuje od koncentracije odvisen učinekehinakozidna {{0}}z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata iz prečiščenih cerebrokortikalnih sinaptosomov podgan. V sinaptosomih, inkubiranih z 1 mM CaCl2, je 1 mM 4-aminopiridin izzval sproščanje glutamata 7,4 ˘ 0,1 nmol/mg/5 min, ki se je zmanjšalo za 1, 5, 10, 30 in 50 µMehinakoziddo 6,5 ˘ 0.2, 5.8 ˘ 0.3, 4.8 ˘ {{10}}.2, 4.1 ˘ 0.1 ali 2.3 ˘ 0.4 nmol/mg/5 min (F(5,24)=67.1, p=0.000). Vrednost IC50 zaehinakozid-posredovana inhibicija 4-z aminopiridin izzvanega sproščanja glutamata, izpeljana iz krivulje odmerek-odziv, je bila 24 µM. Poleg tega je sproščanje glutamata sproženo z 1 mM 4-aminopiridina v zunajcelični raztopini brez Ca2 plus, ki vsebuje 300 µM etilen glikol bis(-aminoetil eter)-N,N,N1,N{{ 13}}tetraocetna kislina (EGTA) je bila 2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000) in ta Ca2 plus -neodvisna komponenta 4-z aminopiridin izzvanega sproščanja glutamata ni vplivala 20 µMehinakozid(1,8 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,58; slika 1). V sinaptosomih, zdravljenih z 0.1 µM bafifilomicinom A1, zaviralcem vezikularnega prenašalca [26], se je 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata znatno zmanjšalo (2,2 ˘ 0.2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249.518, p=0.000). V prisotnosti bafifilomicina A1 20 µM ehinakozid ni uspel pomembno zavirati sproščanja glutamata (2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; slika 1). Nasprotno pa je 10 µM DL-treo-beta-benzil-oksiaspartat (DL-TBOA, zaviralec ponovnega privzema glutamata) [27] povečal 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata na 11,8 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=´11.31, p=0.000). Tudi v prisotnosti DL-TBOA, 20 µMehinakozidpomembno zavira {{0}}z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata (7,7 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.{{ 12}}; Slika 1)
2.2. EhinakozidZmanjša citosolni Ca2plusKoncentracija, vendar ne spremeni sinaptosomskega
Membranski potencial
Depolarizacija sinaptosoma, ki jo povzroči 1 mM 4-aminopiridina, je povečala Ca2plus koncentracija(p= 0.000; Tabela 1). Uporaba 20 |vMehinakozidni pomembno vplival na baralni Ca2plus koncentracija (t(8) = 0.06, p= 0.95), vendar znatno zmanjša zvišanje iia Ca, ki ga povzroči 4-aminopiridin2plus koncentracija (t(10) = 6.16, p =0.000). Poleg tega se je 1 mM 4-aminopiridina povečalo v 3',3',3'-dipropiltiadikarbocianin jodidu [DiSC3(5)] fluorescenca (p= 0.000). Dodatek o(20 fdM ehinakozid ni spremenil membranskega potenciala v mirovanju (t(8)=0.976,p= 0.36) ali bistveno spremeni 4-zvišanje DiSC, ki ga povzroči 4-aminopiridin3(5) fluorescenca (t(8) = —0.014, p= 0,99; Tabela 1).
Cistancheehinakozidlahko zdravijo bolezni ledvic
2.3. Znižano - CO2 plusPritok skozi kanala Cav2.2 (N-vrsta) in Cav2.1 (P/Q-vrsta) je lahko povezan z zaviranjem 4-z aminopiridin izzvanega sproščanja glutamataEhinakozid
Slika 2 kaže, da 2 cu-konotoksin MVIIC, N-in Ca tipa P / Q2plus zaviralec kanalov,
zmanjšano {{0}}z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata s 7,4 土 0.2 na 2.0 土 0,1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). V prisotnosti cu-konotoksina MVIIC je bil učinek 20 pM ehinakozida na 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata nepomemben (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1.06, p= 0.32). Dantrolen (10 ^M), zaviralec intracelularnega Ca2plus sproščanje iz endoplazmatskega retikuluma [28], zmanjšano 4-z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata (5,6 土 0.3 nmol/mg/5 min; F(2,14)=104. 95,p= 0.000). Vendar pa je v prisotnosti dantrolena 20 pJMehinakozidlahko še vedno pomembno zavira sproščanje glutamata (3,3 土 0.2 nmol/mg/5 min;p= 0.000). Podobne rezultate so opazili pri uporabi 100 pM 7-kloro-5-(2-klorofenija)-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepina -2(3H)-on (CGP37157), membranski zaviralec mitohondrijskega Naplus/pribl2plus menjava. V petih pregledanih sinaptosomskih pripravkih je 20 pMehinakozidv kombinaciji s 100 pM CGP37157 je zmanjšal 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata za 48,3 odstotka 土 5,2 odstotka (F(2,13) = 136.79,p= 7.000), podobno zaviranju s samim ehinakozidom (46,2 odstotka 土 2,3 odstotka;p = 0.89;
2.4. EhinakozidZavira 4-izzvano aminopiridin (sproščanje glutamata s signaliziranjem prek protein kinaze C
Kot je prikazano na sliki 3, 10 stopinj jlM 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimid (GF109203X), splošni zaviralec protein kinaze C [29], zmanjša 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata (F(2,13) = 19.46, p=0 .000). V sinaptosomih, obdelanih z GF109203X, je 20 pM ehinakozida zmanjšalo 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata samo za 5,5 odstotka 土 1,8 odstotka (p=0.89), kar je manj kot samo ehinakozid (42,4 odstotka 土 2,3). odstotkov; p=f.000). Podobne rezultate smo dobili s 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pirolo[3 ,4-c]karbazol-12-propannitril (Go6976), selektiven za izooblike proteinske kinaze C, odvisne od Ca2 plus (a, |3I, |3II, y) [29]. V prisotnosti 3 pM Go6976, 20 pMehinakozidzmanjšalo sproščanje glutamata za 11,9 odstotka 土 2,9 odstotka (p=0.59), kar pomeni znatno zmanjšanje v primerjavi s tistim pri samem ehinakozidu (42,4 odstotka 土 2,3 odstotka; p=0.000; Slika 3). Nasprotno pa 3 pM rottlerina, od Ca2 plus neodvisnega inhibitorja proteinske kinaze C6 [30], ni bistveno spremenil 4-aminopiridina (1 mM) sproščanja glutamata (p=0.45). Kljub temu je v prisotnosti rottlerina 20 pM ehinakozida učinkovito povzročilo povprečno inhibicijo 37,1 odstotka 土 5,6 odstotka sproščanja (F(2,13) = 19.72, p=0.{{33 }}), podobno kot pri samem ehinakozidu (p=0.41; slika 3). Poleg tega z mitogenom aktivirani inhibitor protein kinaze 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on) (PD98059 ) (50 pM) in inhibitor protein kinaze A N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-izokinolinsulfonamid (H89) (100 pM) sta zmanjšala 4-z aminopiridin izzvano sproščanje glutamata (p=0.000). Tudi v prisotnosti PD98059 ali H89, 20 pMehinakozidučinkovito zmanjšalo sproščanje (F(2,13) = 52.3, p=0.000; Slika 3).
Slika 4 prikazuje, da je 11 mM 4-aminopiridina povečalo fosforilacijo protein kinaze C v sinaptosomih (t(4) = —6.871, p= 0.002). Ko so bili sinaptosomi predhodno obdelani z 20 pM ehinakozida 10 minut pred dodatkom 4-aminopiridina, se je 4-aminopiridinom inducirana fosforilacija protein kinaze C znatno zmanjšala (F(2a6) = 29.202, p = 0.00 1).
Ehinakozidvcistanchelahko povečaimunski sistem
2.5. Ehinakozid-Posredovana inhibicija sproščanja glutamata ne vključuje gama-aminomaslene kisline tipa A (GAB)3AA) Receptor
Na sliki 5 je prikazan učinek ehinakozida na 4-z aminopiridin sproščeno sproščanje glutamata v odsotnosti ali prisotnosti SR95531 (antagonista GABAAreceptorja) so primerjali. Poleg tega 100 pM SR95531 ni bistveno spremenilo 4-aminopiridina (1 mM) sproščanja glutamata. V
Sinaptosomi, obdelani s SR{0}}, je uporaba 20 pM ehinakozida povzročila 43-odstotno inhibicijo sproščanja glutamata, ki ga povzroča 4-aminopiridin (F(2,12)=42).63,p= 0.000), ki se ni bistveno razlikovalo od zaviranja, ki ga povzroči sam ehinakozid (40 odstotkov;p= 0.000). Podoben rezultat je bil dosežen z drugim antagonistom receptorja GABAa, bikukulinom (50 pM). Sproščanje, izmerjeno v prisotnosti bikukulina in
