1. del: Vzpostavitev sočasnega eksperimentalnega modela osteoporoze v kombinaciji z Alzheimerjevo boleznijo pri podganah in dvojnimi učinki ehinakozida in acteosidea iz Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Stik:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRAKTEN
Etnofarmakološki pomen: Cistanche tubulosaje dragoceno tradicionalno kitajsko zdravilo, ki se je pogosto uporabljalo pri zdravljenju osteoporoze inAlzheimerjeva bolezen.Echinacosidein akteozid so glavne aktivne sestavine zdravila Cistanche tubulosa, ki imajo farmakološke dejavnosti z raziskovalno vrednostjo. Poročali so, da ehinakozid inakteozidizboljšanje sposobnosti učenja in spomina, spodbujanje razmnoževanja in razlikovanja osteoblasta. Cilj študije: Echinacoside in acteoside izCistanche tubulosaso pokazale pomembne aktivnosti proti osteoporozi in proti Alzheimerjevi bolezni, medtem ko ti učinki niso bili raziskani sočasno v modelu podgane. Cilj te študije je bil vzpostaviti in preveriti model osteoporoze v kombinaciji zAlzheimerjeva bolezenpodganah in preučiti dvojne učinkeehinakozidin acteoside na tem sočasni model.
Materiali in metode:Tri skupine modelov jajčnikov (OVX), kirurški poseg z D-galaktozo in AlCl3 (D), ovariektomija z D-galaktozo in AlCl3 (OVX+D) so bile nastavljene hkrati. Podgane v skupinah za zdravljenje drog so bile jajčne. Med intraperitonealno injekcijo D-galaktoze in intragastrično uporabo zdravila AlCl3 pri podganah skupin za zdravljenje zdravil so podgane peroralno dajaliehinakozid(90 mg/kg/d),akteozid(90 mg/kg/d) in pozitivna kontrolna zdravila estradiola valerata (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d). Po zdravljenju z zdravili 8 tednov, Morris Water Maze (MWM) test za 6 dni je bil prvič izveden. Podgane so se žrtvovale, da bi pobovale kri, uteri, femoro, tibiae in možganska tkiva. Serum so uporabili za biokemične teste. Uteri so uporabljali za histomorfometrijo. Pravo femoro so uporabljali za mikro-CTin histomorfometrijo. Za biomehanični test so uporabili pravo tibijo. Hipokampus, zbran na ledu, je bil uporabljen za biokemične teste. Možgani 41, zbrani s perfuzijo, so bili uporabljeni za histomorfometrijo.
Rezultati:V primerjavi s skupino Sham bi lahko skupina OVX+D bistveno zmanjšala učno in spominsko sposobnost s povzročitvijo oksidativnih poškodb, okvaro nevronov v hipokampusu ter vpliva na hidrolizo in sintezo acetilholina. Medtem so se dejavnosti BALP in TRAP v skupini OVX+D znatno povečale (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">ehinakozidinakteozid, značilne patološke značilnosti osteoporoze inAlzheimerjeva bolezenameliorated.
Sklepi:Model osteoporoze v kombinaciji zAlzheimerjeva bolezenpri podganah je bila izvedljiva in uspešno uveljavljena.Echinacosidein acteoside je pokazal tudi nekatere pomembne učinke na ta sočasni model, in lahko bi bili potencialnih 56 kandidatov izCistanche tubulosadvojnim učinkom za nadaljnjo študijo.
Ključne besede:osteoporozo; Alzheimerjeva bolezen; dvojne učinke; ehinakozid; akteozid; Cistanche tubulosa
Cistanche izgubljeno cesarstvo zelišč ameliorates Alzheimerjeva bolezen
1. Uvod
Osteoporoza je degenerativna bolezen kosti, za katero je značilna progresivna izguba kostne mase in uničenje mikroarhitekture, kar lahko poveča tveganje za zlom krhkosti (Rachner et al., 2011).Alzheimerjeva bolezen(AD) je pogosta nevrodegenerativna bolezen pri starejših, za kar je značilno nenehno duševno upadanje, kognitivna okvara in izguba neodvisne življenjske sposobnosti v klinični (Reitz 76 in al., 2011). Nastanek senilnih plakov, povzročen z β-amiloidno deponacijo, nevrofibrilarne zaplete, ki jih povzroča tau hiperfosforilacija, in nevronsko degeneracijo v možganih so tipične patološke značilnosti AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Površinsko, OP in AD so popolnoma neodvisne bolezni z različnimi patološkimi in kliničnimi funkcijami. Vendar pa se op in AD pogosto opažata, da se soobstojita v klinični praksi (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Razširjenost obeh bolezni se je povečala s starostjo, zlasti pri ženskah v postmenopavzi (Li et al., 2017; Stern, 2012). Vse več dokazov kaže, da imajo osebe z diagnozo AD povečano tveganje za op (Zhou et al., 2014).
Treba je preučiti in pojasniti odnose med osteoporozo inAlzheimerjeva bolezenin vitro in in vivo. Preden se študije izvedejo in vivo, je pomembno izbrati veljavne živalske modele osteoporoze ali Alzheimerjeve bolezni. Model osteoporoze bi lahko vzpostavili z več vrstami metod, kot so intragastrična uporaba retinojske kisline, operacije ovarijektomije in intramuskularno injiciranje glukokortikoidov (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Zlasti je bil model postmenopavzalne osteoporoze, povzročen z ovariektomijo pri podganah, klasičen inv večini študij (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Sporadska Alzheimerjeva bolezen je glavna vrsta Alzheimerjeve bolezni. Živalmodeli sporadskihAlzheimerjeva bolezenlahko povzročijo različne metode, kot soinjiciranje D-galaktoze aliβ-amiloid, intragastrični dajanje zdravila AlCl3,in tako naprej(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Poleg tega jemodel alzheimerjeve bolezni, ki jo povzroči dolgotrajna intraperitonealnaInjiciranje D-galaktoze v kombinaciji z ovariektomijo je bilo tudi veliko raziskano (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Da bi razkrili pomembnost osteoporoze inAlzheimerjevo bolezen, je treba vzpostaviti model osteoporoze skupajz Alzheimerjevo boleznijo za preučevanje skupnih mehanizmov zdravil naosteoporozo inAlzheimerjeva disease.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight je parazitska rastlina, ki se razdeljuje predvsem v puščavah na severozahodu Kitajske. Posušena sočna stebnaCistanche tubulosa(CT) se uporabljajo kot znano tonik zdravilo z imenom Cistanches Herba s kitajskim imenom Roucongrong v kitajski farmakopeji (2015). Počaščen je bil kot "ginseng puščav" in se pogosto uporablja za zdravljenje bolečin v pasu in kolenu, ženske sterilnosti, in zaprtje v tradicionalni kitajski medicini (Jiang in Tu, 2009). Glavne aktivne sestavine CT so fenilethanoidni glikozidi (PHG), ehinakozid (ECH) inakteozid(ACT) so reprezentativne spojine v phGs (Morikawa et al., 2014). Zlasti sta ECH in ACT zaradi visoke vsebnosti in različnih farmakoloških dejavnosti, kot so učinki nevrozaščite, zaščita kosti,
antioksidati, anti-staranje in izboljšanje sposobnosti učenja in spomina (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Vendar pa učinka zdravila ECH in ACT na osteoporozov kombinaciji zAlzheimerjeva bolezenše niso raziskali skupaj v modelu podgane.Zato je bil namen te študije vzpostaviti podgana model osteoporoze v kombinaciji zz Alzheimerjevo boleznijo in raziščite učinkeehinakozidin acteoside o temmodelu, da bi zagotovili eksperimentalne dokaze za nadaljnjo preučevanjeehinakozid ali akteozid v naslednjih raziskavah.
cistanche farmacevtska posebnazaOGLAS
2. Materiali in metode
2.1 Živali
Osemdeset 8-tedenske podgane Wistar (Številka potrdila: SCXK 2018-0006), tehtajo 180~200 g, so bile pridobljene od Sino-British SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Šanghaj, Kitajska) in vzgajane v Eksperimentalnem centru farmacevtskih živali v Kitajski farmacevtski univerzi.
2.2 Kemikalije in reagenti
Kloral hidrat, natrijev penicilin G, D-galaktoza, aluminijev klorid heksahidrat, estradiol valerat, donepezil HCl so kupili pri Aladin Industrial Corporation (Šanghaj, Kitajska).Echinacoside(HPLC 94 %) je bila pridobljena iz Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co, Ltd. (Chengdu, Kitajska).Acteoside(HPLC 98 %) je bila kupljena pri baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kitajska). Alkalna fosfataza (BALP), fosfataza, odporna na tartrate (TRAP), superoksidna dismutaza (SOD), malonaldehid (MDA), acetilholine Kompleti imunosorbenta (AChE) i holinska acetiltransferaza (ChAT) vezani za imunosorbent (ELISA) kompleti su kupljeni od Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Univerzalno fiksativno tkivo je bilo pridobljeno izChengdu Wecistanche Bio-Technology Co. Ltd. (Chengdu, Kitajska).
ehinakozid
2.3 Modeli in obdelave živali
Vse poskuse na živalih je odobril in nadzoroval Odbor za etiko živali Kitajske farmacevtske univerze. Podgane so bile vzdrževane s svetlobnim/temnim cikličkom 12 h v temperaturno nadzorovanem prostoru (22±2°C) in krmljene s standardno krmo in vodo iz pipe.
Po prilagoditvi enega tedna je bil model osteoporoze izveden z operacijo ovarijektomije (francoščina et al., 2008). Po končani operaciji je bil natrij penicilin G enkrat posut na rano, da se prepreči okužba. Podgane so nato normalno hranili tri tedne. V skladu s sklicevanjem (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), modelAlzheimerjeva bolezenintraperitonealno injekcijo D-galaktoze v kombinaciji z ovariektomijo ali dolgotrajno intragastriko zdravila AlCl3. Za preučevanje izvedljivosti modela osteoporoze v kombinaciji z Alzheimerjevo boleznijo so tri vzorčne skupine ovariektomije (skupina OVX), kirurški poseg s intraperitonealno injekcijo 150 mg/kg/d D-galaktoze in intragastrične Davanje 30 mg/kg/d AlCl3 (D skupina), ovarijektomija s intraperitonealnom injekcijom od 150 mg/kg/d D-galaktoze i intragastrična administracija od 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX+D skupina) su bile določene u ovoj študiji.
Zato so bile podgane po 3 tednih naključno razdeljene v osem skupin (n=9 za vsako skupino) in so se 8 tednov zdravili z zdravili: skupina Sham; skupina OVX; skupina D; skupina OVX+D; zdravilom estradiol valerat (skupina EV, OVX+D+0,6 mg/kg/d estradiol valerat); donepezil HCl (skupina DPZ, OVX+D+0,8 mg/kg/d donepezil HCl);ehinakozid(skupina ECH, OVX+D+90 mg/kg/d ehinakozid);akteozid(skupina ACT, OVX+D+90 mg/kg/d akteozid). V skladu z načelom pretvorbe enakovrednega odmerka med človekom in podganami in odmerkom iz povezanega sklicevanja (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), so bili sprejeti odmiki skupin za zdravljenje drog v tej študiji.
Telesna masa vsake podgane je bila izmerjena vsak teden. Po celotnem zdravljenju z zdravili, ki trajajo 8 tednov, Morris Water Maze (MWM) test za 6 dni je bil prvič izveden. Po tem so žrtvovali 6 podgan iz vsake skupine, da so pobovali materiale. Podgane so anestestirali z intraperitonealno injekcijo 3,0 ml/kg 10% kloralnega hidrata, kri pa so zbirali iz trebuhov aorte. Kri je bila dana na sobno temperaturo na strdek in centrifugirana pri 3500 r/min 10 min. Serum je bil požet v centrifugni cevi s 1,5 ml (BIOTEHNOLOGIJA NEST) in shranjen pri -80 °C, dokler ni bil uporabljen za biokemične teste. Nato so zbrali uteri, femoro, tibiae in možganska tkiva. Uteri so uporabljali za histomorfometrijo. Pravo femoro so uporabljali za mikro-CT oziroma histomorfometrijo. Za biomehanični test so uporabili pravo tibijo. Hipokampus, zbran na ledu, je bil uporabljen za biokemične teste. Po tem so ostale tri podgane iz vsake skupine oddahnile iz srca s slano in univerzalno fiksacijo tkiv, da bi spravile možgane za histomorfometrijo.
2.4 Preskus vode Morris (MWM)
Podgane so bile po 8 tednih posega predmet prostorskega referenčnega učenja in preskušanja spomina v testu MWM. Test MWM je bil opravljen po predhodno sporočenih metodah (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Na kratko, 5 zaporednih dni s štirimi poskusi na dan, podgane so bile usposobljene za uporabo različnih vizualnih iztočnice, ki se nahajajo na steni bazena, za iskanje skrite potopljene ploščadi (premer 11 cm, višina 29 cm) v krožnem bazenu (premer 130 cm, višina 50 cm), napolnjena z nestrupenim ogljikovim črnilom porjavenim vodo. Bazen je bil namišljeno razdeljen na štiri kvadrante, štirje startni položaji pa so se nahajali na križiščih kvadrantov. Platforma se je nahajala v središču enega od kvadrantov in položaj je bil med poskusi stalen. V vsakem preskušanju so bile podgane naključno dane na izbrane lokacije, obrnjene proti steni bazena. Vsako sojenje je bilo končano, ko je podgana dosegla platformo ali po 60 s, in pretekli čas je bil zabeležen kot zamuda pobega. Podgana, ki ni dosegla platforme, je bila vodena na to. Po vsakem poskusu s skrito platformo je podgana ostala na platformi 10 s. Povprečni čas zakasnjenosti štirih poskusov na dan je bil izračunan kot rezultat usposabljanja. Šestega dne so vse podgane preiskale sondo, v kateri so plavale 60 let v bazenu brez platforme. Časi prehoda na lokaciji platforme in čas potovanja v ciljnem kvadrantu so bili zabeleženi kot končni rezultati. Podgane je spremljala kamera, nameščena v strop neposredno nad bazenom, in vse poskuse so bile posnete in analizirane z uporabo MORRIS MAZE programa, ki ga je Peking zhongshidichuang znanost in razvoj tehnologije Co., Ltd. (Peking, Kitajska)
2.5 Biokemični preskus ELISA
V skladu z navodili proizvajalca ELISA kompletov, Aktivnost alkalne fosfataze (BALP) specifične za kosti, aktivnost fosfataze (TRAP) odporne na tartrate, aktivnost superoksid dismutaze (SOD) i vsebnost malondialdehida (MDA) u serumu testirali su BioTek Synergy 2 multi-mode microplate reader (BioTek, USA). Hipokampusna tkiva iz vsake skupine so prali s PBS (0,01 M, pH 7.4), da bi odstranili kri ali nečistoče, ki so ostale na površini tkiv. Hipokampusna tkiva na eni strani so bila tehtana in nato narezana na koščke čim manjše. Hipokampusna tkiva so bila homogenizirana glede na razmerje 1: 9 (maso tkiv: volumen PBS). Homogenat je bil centrifugirana pri 4°C, 3000 r/min 15 min. Supernatant je bil zbran in razredčen za merjenje koncentracije beljakovin z metodo BCA. Aktivnost acetilholineteraze (AChE), aktivnost holin-acetiltransferaze (ChAT), aktivnost superoksid dismutaze (SOD) in vsebnost malondialdehida (MDA) v hipokampusnem tkivu so nato testirali z metodami ELISA.
2.6 Hipokampus histomorfometrija
Možganska tkiva (n=3/skupina) so bila fiksna v univerzalnem fiksative tkiv. Vzorci možganskega tkiva so bili nato oprani, dehidrirani s gradientnim etanolom, vdelani s parafinsko vosko in narezani v koronalne dele 5 μm. Preseki so bili obmagani s hematoksilinom in eozinom (HE). Po tem so koronalne dele možganskih tkiv fotografirali z obrnjenim fluorescencnim mikroskopom (Nikon, Japonska). Še posebej so opazili morfološke spremembe CA1, CA2, CA3 in GD v hipokampusu.
2.7 Histomorfometrija maternice in morfometrija
Izbrani uteri (n=3/skupina) so bili fiksni v univerzalnem fiksativnom tkivu. Vzorci tkiva maternice so bili nato izliti, dehidrirani z gradientnim etanolom, vdelani s parafinsko vosko in narezani v prečne dele 5 μm. Preseki so bili obmagani s hematoksilinom in eozinom (HE). Opazili in fotografirali so prečiščene dele uteri. Pet poglednih polj je bilo naključno izbranih, premer prečne sekcije maternice in debelina epitelnega epitela maternice so nato merili s programsko opremo Image-Pro Plus 6.0. Prešteli so tudi število maternice v lamina propriji.
2.8 Mikro-CT
Izbrano desno femoro (n=3/skupino) smo skenirali v položaju z razdaljo predmeta do vira 121 mm in razdaljo fotoaparata do vira 171 mm z uporabo skyScan 1176 mikro rentgenske tomografije (Mikro-CT) skener (Bruker, Nemčija). Distalna rastna plošča je bila izbrana kot referenčna površina. Z razdaljo 1 mm pod referenčno površino je bila izbrana regija debeline 1,8 mm kot obseg zanimanja (VOI, 100 plasti). Slika sivega toskana je imela velikost piksla 17,76 μm od rekonstrukcije kosti (65 kV, 385 μA). Za izbiro trabekula iz kortikalne kosti je bila uporabljena polavtomatizirana metoda kontoringa. Za oceno odstotka volumna kosti (BV/TV), gostote površine kosti (BS/TV), trabekularnega ločevanja (Tb. Sp), trabekularni number (Tb. N), trabekularna debelina (Tb. Th), indeks modela strukture (SMI), trabekularni faktor vzorca (Tb. Pd) i mean kost mineralna gostota (mean BMD) za isti VOI uporabomCTProgram analizatorja (Bruker, Nemčija). 3D vizualizacija VOI z uporabo adaptivnega rendering algoritma je bila opravljena s CTvol programsko opremo (Bruker, Nemčija).
izvleček cistanche rastline
2.9 Kostna histomorfometrija
Izbrana prava femora (n=3/skupina) je bila določena v univerzalnem fiksativno tkivo in nato dekalcificirana v raztopini 10% EDTA-2Na za 3 tedne. Dekalcificirani vzorci so bili posušeni, dehidrirani z gradientnim etanolom, vdelani s parafinsko vosko in narezani na vzdolžne dele 5 μm. Preseki so bili obmagani s hematoksilinom in eozinom (HE). Fotografirali so vzdolžne dele femora. Opazili so strukture kostnega tkiv iz vsake skupine, zlasti trabekularne kostne strukture.
2.10 Biomehanični preskus
Naključno izbrani desni tibiae (n=4/skupina) so bili ocenjeni za tritočni preskus upogibanja z univerzalnim preskusnim strojem (SHIMADZU, Japonska). Premerje teh vzorcev so merili z vernier kalibrom v območju 2,16-2,38 mm (d). Vzorec je bil nato na dveh podpornih prečkah z razdaljo 25 mm (L) med obema tirnicama in fiziološko ukrivljenost vzorca navzgor. Nosilna palica tovora se je nahajala v središču vzorca in je padla s stalno hitrostjo 1,5 mm/min, dokler se primerek ni zlomil. Podatki o sili (F) in izmikanju so bili samodejno zabeleženi v računalnik, ki je bil vmesnikan s preskušavalnim strojem, krivulja deformacije obremenitve pa je bila risana hkrati. Vrednosti največje obremenitve (N) in absorpcije energije (mJ) so bile zabeležene s programsko opremo za preskušanje materialov TRAPEZIUM X hkrati. Vrednosti največjega stresa (MPa) so bile izračunane po naslednji formuli: Stres (σ) = upogibni moment (M) / Faktor odseka (Z) = (8×L×F) / (π×d3 )
2.11 Statistična analiza
Rezultati modelskih skupin so bili primerjani s skupino Sham, rezultati skupin, zdravljenih z zdravili, pa so bili primerjani s skupino OVX+D. Podatki so bili analizirani z enos smerjo ANOVA, ki mu je sledil Bonferronijev test za večkratno primerjavo z uporabo programske opreme Graph Pad Prism 5.0. Podatki so bili izraženi kot ± SD, vrednosti P, manjše od 0,05 pa so bile statistično pomembne.
myricetinincistanche
