Del 1 | Herba Cistanche ekstrakt izboljša mitohontrijsko ATP generacijo v podgana srca in H9c2 celice

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung in Kam Ming Ko

Oddelek za biokemijo, Hong Kong University of Science & Technology, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, Kitajska

Ključne besede: ATP,Cistanche deserticola, celice H9c2, srce, mitohondrija

Abstrakten

Za preiskavo farmakološke podlage zdravila "Yang- povišujoče" ukrepanje rastlinskega cistanche [posušena cela rastlinaCistanche deserticolaY.C. Ma (Orobanchaceae)], v kitajski medicini, so bili učinki metanolnega ekstrakta herbe Cistanche na zmogljivost pridobivanja mitohontrijskega ATP preučili z uporabo ex vivo podgana srčnega modela in in situ H9c2 celične preiskave. Zdravljenje z ekstraktom Herba Cistanche je povečalo sposobnost miokardnega mitohondrialnega ATP za proizvodnjo na odmerek odvisen način pri podganah, kot je bilo ocenjeno z in vitro merjenjem. Stimulacija zmogljivosti za proizvodnjo ATP je bila povezana z vzporednim povečanjem v transportu mitohondrijskih elektronov, podprtih s piruvatom, vendar ne s sukcinatom. Zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche je povečalo tudi miokardni mitohondrialni kompleks I in kompleksne AKTIVNOSTI III, saj je obseg stimulacije kompleksa I aktivnosti večji. Zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche je v celicah H9c2 ustvarilo odmerek in časovno odvisen odmerek. Rezultati kažejo, da lahko zdravljenje z zdravilom Herba Cistanchepovečati mitohontrijsko atp generacijov podganah ex vivo in H9c2 celicah in situ, po možnosti prekizboljšanje oksidativne fosforilacije.

Cistanche lahko izboljša delovanje srca, zniža krvni tlak in zniža lipidov v krvi

Uvod

»Poživljanost Yanga«, ki uteleša posplošeno izboljšanje telesne funkcije v kitajski medicini, vključuje uporabo energije pri vožnji različnih biokemičnih procesov.

V zvezi s tem se ATP, ki je univerzalna valuta energije pri gorivu celične funkcije, v glavnem ustvarja z oksidativno fosforilacijo v mitohondrijah. Postulirani smo, da "Yang požvižga" zeliščasposobnost povečanja zmogljivosti za proizvodnjo mitohondrialnih ATP(Ko et al., 2004). To podpira naša nedavna ugotovitev, da "Yang- povišujoče", vendar ne "Yin-hranljiva" kitajska tonifikacijo zelišča lahko poveča zmogljivost miokardnega ATP generacije v mišje srce ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, posušena cela parazitska rastlina (razen cveta) cistanche deserticola Y.C. Ma (Orobanchaceae), je razvrščena kot'Yang-poživljajoče" tonifikacijo herba v tradicionalni kitajski medicini (Chen, 1998), in se zdi kot najbolj priljubljena sestavina v številnih kitajskih patentov za- mulations, ki se uporabljajo za Yang-poživljanje". Na Kitajskem in Japonskem, Herba Cistanche se pogosto uporablja za zdravljenje veliko yang pomanjkljivosti simptomov. Farmakološke študije so pokazale, da bi lahko herba Cistancheproste radikale(Xiong et al., 1996),proizvajajo sedative(Lu, 1998),antiaging(Lee et al., 1990),antinociceptivni in protivnetni učinki(Lin et al., 2002) inizboljšanje imunskega delovanja(Wu et al., 2005). Glavna zdravilna učinkovina zdravila Herba Cistanche jefeniletanoidni glikozidi(Ouyang et al., 2003), za katere je biloantibakterijsko, antistresno in antioksidantno(Xiong et al., 1998), kot tudi protiapototične učinke na kultivirajoče nevrone (Tian & Pu, 2005). V sedanji študiji so za preiskavo farmakološke podlage za pospešujoče delovanje zdravila Herba Cistanche v zdravilu Herba Cistanche preučili učinke zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche na sposobnost nastajanja ATP v mitohontriji, izolirani iz podganjenih src ex vivo in kultiviranih kardiomiocitov H9c2 in situ. Za raziskovanje biokemičnega mehanizma, ki je bil v skladu z ukrepom za krepitev atp, so bili učinki zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche na transport mitohondrijskih elektronov in kompleksne dejavnosti I–IV preučili tudi v podganah.

Učinkovite sestavine zdravila Cistanche lahko izvlečejo različne aktivne radikale brez kisika.

Materiali in metode

Kemikalije, celična kultura in zeliščni materiali

ATP, ADP in 3-[4,5-dimetiltiozol-2-yl]-2,5-difenil- tetrazolijev bromid (MTT) so kupili pri Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA). Luciferase raztopino (ATPlite) so dobili od perkinElmer (Boston, MA, ZDA). Spremenjeni Orlov medij (DMEM) in fetalni goveji serum (FBS) sta bila kupljena pri GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, ZDA). Celična linija H9c2 je bila kupljena pri ATTC (Rockville, MD, ZDA). Herba Cistanche je dobavljal lokalni prodajalec zelišč (Lee Hoong Kee). Herba je bila overjena s strani dobavitelja, kupon vzorec (HKUSTY00301) je bil deponiran na Oddelku za biokemijo, Hong Kong University of Science & Technology (HKUST).

Ekstrakcija zelišč

Herba Cistanche (100g) je bila razrezana na majhne kose in nato izvleče z ogrevanjem pod refluksom v 300 ml metanola pri 65-C za 2 h. Postopek se je ponovil dvakrat. Zbran izvleček so posušili z izhlapevanje topila pod zmanjšanim tlakom, izvleček metanola herbe Cistanche pa je bil pridobljen z donosom 39% (w/w). Kemična analiza je pokazala, da je metanol ex-trakt zdravila Herba Cistanche vseboval skupne saponine, skupne flavonoide, celotne lignane in polisaharide v koncentracijah 1,62 % (w/w), 0,08 %, 0,15 % oziroma 75,6 %.

Nega živali

Odrasli moški podgane Sprague-Dawley (8–10 tednov; 250–300g) so se vzdrževati pod 12-h temnim/ svetlobnim ciklusom v sobi, ki je bila nadzorovana z zrakom/vlažnostjo, pri približno 22-C in so omogočale hrano in vodni ad libitum v objektih za nego živali v HKUST. Eksperimentalne protokole je odobril Odbor za raziskovalno prakso pri HKUST.

Zdravljenje z zdravili

Živali so bile naključno razdeljene v skupine, v vsaki pa pet do šest živali. V zdravilnih skupinah so podgane intragastrično dajali z metanolnim izvlečkom zdravila Herba Cistanche (raztopljen/suspendiran v vodi) pri povečanju dnevnih odmerkov (0,031–0,5 g/kg) 3 dni. Kontrolne živali so prejele samo vodo. Štiriindvajseč po zadnjem odvajanju je bilo srce pridobljeno iz fenobarbitalnih anestetiziranih živali in podvrglo biokemični analizi.

Priprava mitohontrijskih frakcij in merjenje zmogljivosti za proizvodnjo ATP (ATP-GC) ex vivo

Vzorci srca levega pretisnega tkiva so bili izvlečeni in izpereni z ledeno hladnim izotonim puferjem (0,32 Mharoze, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4). Srčne mitohondijske frakcije so bile pripravljene z diferencialno centrifugacijo v izotonem odbojniku pri 4-C. 10% (w/v) srčni homogenat je bil pripravljen s homogenizacijo mletega pretisnega tkivo s homogenizatorjem teflonsko-steklenega stekla pri 4000 vrt/min za 20–30 popolnih potez. Homogenat je bil centrifugirana pri 600 × g 10 min za odstranjevanje jeder in celičnih ostankov. Supernatant je bil nato centrifugirana pri 8000 × g 30 min, da so usedli mitohontrijo (Evan, 1992). Peleti so bili ponovno na voljo v 1 ml izotonega blažilnika in rekonstituirano mitohontrijsko frakcijo. Mitohondrijski ATP-GC nezdravenih živali je bil izmerjen z metodo Leung et al. (2005)

Cistanche polysaccharides lahko odloži fiziološko degeneracijo organov in degeneracijo celične morfologije

Merjenje transporta mitohondrijskih elektronov

Merjenje transporta elektronov v izoliranih mitohondrijah, ki temelji na zmanjšanju MTT, kot je na[1], oblikovano kot je opisano v Cohen et al. (1997). Mitohontrijo so pripravili v koncentraciji beljakovin 1 mg/ml z inkubatorjem (250 mM saharoze, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4). Alikvot (40 μL) mitohondrije je bil zmešan s po 100 μL vsakega od 15 mM piruvata ali 0,5 mM sukcinata in 0,42 mg/ml MTT. Reakcijska mešanica je bila inkubatorna pri 37-C 10 min z nežnim hlajenjem. Po inkubacijskem postopku so reakcijsko mešanico prekinili z dodatkom 100 μL lysis buffer (10%, w/v, natrijev dodekil sulfat in 45% dimetilformamida, prilagojenega pH 4,7 s ledenično ocetno kislino). Po 5 minutah so bili odčitki absorbance reakcijske zmesi vzeti z mikrotiternim bralnikom plošč (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) in poročali kot razliko med 570 nm in 630 nm. Podatki so bili izraženi kot odstotek vrednosti vrednosti kontrolne skupine (npr. skupine Herba Cistanche- nezdravljena).

Celična kultura

Celice H9c2, stalna celična linija, pridobljena iz srčne mioblasti (Hescheler et al., 1991), so bile v DMEM, ki so bile pridobljene z 10 % (v/v) FBS, kulturene kot monoleje. Medij je vseboval glukozo (4,5 g/L) in glutamin (4,5 mM), ki so ga dopolnili z zdravilom NaHCO3 (17 mM), penicilinom (100 i.e./ml) in streptomicinom (100μg/ml). Vse celice so bile zrasle v ozračju 5% (v/v) CO2 v zraku pri 37-C. Medij je bil vsakih 2 ali 3 dni nadomeščen s svežim medijem. Zaloga celic je bila zrasla v 75 cm2 kulture bučko in razdeljena pred sotočje v razmerju subkulturivacije 1:10. Za ATP-GC-pregled so celice H9c2 sejale z gostoto 2,5 × 104 celic/no v ploščo z 24 dobro. Po pritrditvi celice, Herba Cistanche ekstrakt (raztopi v fosfat-buffered saline; PBS) je bila uporabljena v mediju, celice pa so bile inkubatorne za naraščajoča obdobja (2–16 h) časa. Kontrolne (neobdelane) celice so dobile samo PBS.

Merjenje ATP-GC in situ

Po navedenih obdobjih inkubacije z Izvleček cistanche pri povečanju koncentracij (50–300 μg/ml) je bil opravljen pregled ATP-GC. Srednjeročni je bil aspiratičen, celice pa so zdravili z digitoninom (50 μg/ml) v inkubatorju (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5% BSA, pH 7,4) 3 min pri 37-C. Po aspirativnem digitonin, glutamat (5 mM), malat (5 mM) in ADP (60 μM) so bile dodane celicam za mitohontrijsko atp generacijo, ki so jo spremljali v od 0 do 15 min. Reakcijo so prekinili z dodatek 60 μL perklorične kisline (30%, w/v) in reakcijske zmesi so nato centrifugiranje pri 600 × g 10 min ob 4-C. Alikvot (120 μL) nadnatanta 90 μL 1,4 M KHCO3 za nevtralizacijo. Mešanice so bile ponovno centrifugirana pri 600 × g pri 4-C, in supernataantsi so bili izmerjeni za vsebnost ATP kot opisane prej. ATP-GC nezdravljene celice je bil ocenjen tako, da je predel pod krivuljo grafa (AUC1) načrtovanje ATP, ki nastaja (nmol/mg beljakovine) proti čas (0–15 min) in izražen v samovoljnih enotah. Za Herbo Celice, zdravljene s cistanchem, vrednosti AUC1 za povečanje časa inkubacija (3, 5, 7, 10 in 15 min) so bile normalizirane na ustrezno vrednost nadzora iz nezdravenih vzorcev in izražena kot odstotek nadzora. Nato je območje pod krivuljo (AUC2) kontrolnih vrednosti v odstotkih grafikona inkubacijo (3–15 min), izračunana in izražena v samovoljnih enotah. Podatki o zdravilu Herba Cistanche, zdravljenem z zdravilom skupine so bile izražene kot odstotek nadzora iz enačba:

[AUC2(HerbaCistanche − zdravljen)/AUC2(nezdravljena)] ×100%

Meritve kompleksa I–IV in citratne sintaza Dejavnosti

Mitohondrijska transportna veriga elektronov (ETC) kompleks I– III dejavnosti so bile izmerjene s spektrometričnimi metodami z uporabo kompleksnih substrat (NADH za kompleksne I, sukcinat za kompleks II, in decylubiquinol za kompleksno III) kot je opisano (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al., 2005; Mark et al., 2001). Kompleksna AKTIVNOST IV je bila izmerjena z uporabo komplet za citokrom c oksidaze iz sigme. Aktivnost sintaze mitohontrijevega citrata je bila izmerjena z metodo srere (1969).

Proteinski presn

Koncentracije beljakovin iz mitohontrijskih frakcij in celic so bili določeni z bioRadovo beljakovinsko presoditvijo z uporabo govejega serumskega albumina kot standardno (0,038–0,600 mg/ml).

Statistična analiza

Vsi podatki so bili izraženi kot ± standardne napake (SEM). Analizirali so jih z enosedežno analizo odmik (ANOVA). Po hoc večkratnih primerjavah je bilo LSD. Vrednosti P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Rezultati

Učinki zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche na miokard mitohontrijska ATP-GC pri podganah

Kot je prikazano na sliki 1, je zdravljenje z izvlečkom zdravila Herba Cistanche v odmerkih do 0,5 g/kg povečalo miokardni mitohondrial ATP-GC na odmerek odvisen način pri podganah, pri 89% pri odmerku 0,5 g/kg.

Učinki zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche na transport mitohondrijskih elektronov v podganah

Obseg transporta elektronov v izoliranih mitohondrijah merjeno s spremljanjem zmanjšanja MTT. V substrat, ki se uporablja za pregled, bodisi piruvat bodisi sukcinat.

Slika 1.Učinek zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche na sposobnost nastajanja mitohondra ATP v podganah ex vivo

Vsaka vrstica predstavlja v ± SEM, z n = 5. Živali so bile zdravljene z zdravilom Herba Cistanche v indicirano dnevnih odmerkih 3 dni. Zmogljivost proizvodnje ATP je bila izmerjena, kot je opisano v "Materiali in metode". Podatki so bile izražene v odstotkih nadzora v zvezi z vrednostmi (AUC2) nezdravljena kontrolna skupina. ∗Vsebno različna nezdravljena kontrolna skupina; bistveno drugačne zdravila Herba Cistanche, ki je bila zdravljena s 0,5 g/kg.

Slika 2. Učinki zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche na transport mitohondrijskih elektronov v podganah

Vsaka vrstica predstavlja ± SEM, z n = 5. (a) Transport mitohondrijskih elektronov, podprt s piruvatom (b), je bil izmerjena z zmanjšanjem MTT, kot je opisano v v "Materiali in metode." Podatki so bili izraženi v odstotkih nezdravljene kontrolne vrednosti [podprto s piruvati: OD570nm− OD630nm = 0.0206 ± 0.0001 (SEM), n = 5; sukcinat podprt: moški, 0,255 ± 0.015, n = 5]. ∗ Pomembno se razlikuje od zadevnih nezdravenih kontrolno skupino; 0,5 g/kg skupine.

Kot je prikazano na sliki 2a, je zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche odvisno od odmerka pyruvata v podganah, z optimalno stimulacijo, ki jo je mogoče ocenjevati pri odmerkih 0,5 g/kg. Vendar pa ni pomembnih sprememb v obsegu mitohontrijskih elektronski transport, ki ga podpira sukcinat, so odkrili v Herba Cistanche- zdravljena podgana srca (slika 2b).

Za del 2,prosim kliknite tukaj.