Del Ⅰ Identifikacija in validacija podpisa imunsko povezanih genskih parov za tri urološke rake

Povzetek

Za prepoznavanje bolnikov z urološkim rakom, pri katerih obstaja veliko tveganje za ponovitev, so potrebni zanesljivi biomarkerji. V tej študiji smo zgradili nov podpis genskih parov, povezanih z imunostjo, da bi hkrati napovedali ponovitev treh uroloških rakov. Zbrali smo 14 javno dostopnih profilov izražanja genov, vključno z rakom mehurja, prostate in ledvic. Skupno 2700 vzorcev je bilo razvrščenih v učni niz (n=1,622) in validacijski niz (n=1,078). Podpis 25 imunsko povezanih genskih parov, sestavljenih iz 41 edinstvenih genov, je bil razvit z regresijsko analizo operaterja najmanjšega absolutnega krčenja in selekcije ter Coxovim regresijskim modelom. Podpis je bolnike stratificiral v skupine z visokim in nizkim tveganjem s pomembno različnim preživetjem brez ponovitve bolezni v nizu meta-vadbe in njegovih podpopulacijah ter je bil neodvisen prognostični dejavnik uroloških rakov. Ta podpis je pokazal močno sposobnost pri meta-validaciji in več neodvisnih validacijskih kohortah. Imunski in vnetni odziv, kemotaksija in aktivnost citokinov so bili obogateni z geni, pomembnimi za podpis. V skupini z visokim tveganjem so ugotovili znatno višjo stopnjo infiltracije makrofagov M1 v primerjavi s skupino z nizkim tveganjem. Skratka, naš podpis je obetaven prognostični biomarker za napovedovanje preživetja brez recidiva pri bolnikih z urološkim rakom.

Ključne besede

Urološki raki; Biomarkerji; Imunsko povezani genski pari; Preživetje brez ponovitve; prognostični biomarker;Koristi Cistanche.

Kliknite tukaj za več informacij okakšni so učinki zdravila Cistanche

Uvod

Rak mehurja, rak prostate in rak ledvic so glavni tumorji v sečnem sistemu in vsako leto odkrijejo skoraj 2,4 milijona novih primerov [1]. Napredek tarčne terapije in neoadjuvantne terapije je podaljšal preživetje bolnikov [2–4]. Vendar pa številni bolniki trpijo za recidivi tudi po popolni kirurški resekciji [5–7] in njihove napovedi še vedno niso optimistične. Zanesljiv prognostični biomarker, ki bi lahko identificiral bolnike z večjim tveganjem za ponovitev in izbral bolnike, ki imajo odzive na terapije, bi bil dragocen za obvladovanje uroloških rakov.

Podpisi za izražanje genov so bili identificirani za stratifikacijo preživetja pri raku mehurja [8, 9], raku prostate [10, 11] in raku ledvic [12, 13]. Vendar pa večina biomarkerjev ni bila prevedena v klinično prakso zaradi prevelikega prilagajanja naborov podatkov o usposabljanju ali pomanjkanja zadostne validacije [14]. Priložnost za razvoj zanesljivejših prognostičnih biomarkerjev so prinesli zadostni obsežni javni nabori podatkov o izražanju genov [15, 16]. Vendar pa je integracija podatkov, pridobljenih z različnih platform, izziv. Tradicionalna metoda je otežila normalizacijo različnih naborov podatkov glede na tehnične pristranskosti in biološko heterogenost več platform [17, 18]. Nove metode, ki temeljijo na relativnem razvrščanju ravni izražanja genov, so bile uporabljene za odpravo zahteve po predprocesiranju podatkov in so dosegle robustne rezultate v številnih aplikacijah [19–21].

Vse več dokazov kaže, da je tumorsko imunsko mikrookolje povezano z nastankom in napredovanjem treh glavnih uroloških tumorjev [22–24]. Molekule imunske kontrolne točke, kot so programirana celična smrt 1 (PD-1), PD-1 ligand 1 (PD-L1) in citotoksični antigen 4, povezan s T-limfociti (CTLA-4) , so pokazali izjemen, trajen odziv pri raku mehurja [25, 26], raku prostate [27, 28] in raku ledvic [29, 30]. Biomarkerji, povezani s tumorskim imunskim mikrookoljem, imajo tako lahko potencial kot prognostični označevalci uroloških rakov.

Kot je dobro znano, so rak mehurja, rak prostate in rak ledvic anatomsko tesno povezani in so posledica podobnih napadov, ki spodbujajo nastanek tumorjev [31–33]. Zato smo v tej študiji razvili podpis, ki temelji na imunsko povezanih genskih parih (IRGP), za istočasno napovedovanje ponovitve raka mehurja, raka prostate in raka ledvic.

Cistanche tubulosa

Materiali in metode

1. Zasnova študije in nabori podatkov

Izčrpno smo analizirali 14 profilov izražanja genov pri treh uroloških tumorjih mehurja, prostate in raka ledvic, vključno s sedmimi nizi podatkov mikromrež in sedmimi nizi podatkov RNA-Seq (dodatna slika 1). Pristopne številke, platforme in velikosti vzorcev teh profilov izražanja genov so prikazani v dodatni tabeli 1. Podatki RNA-Seq so bili preneseni iz UCSC Xena in Mednarodnega konzorcija za genom raka (ICGC). Podatki mikromrež so bili preneseni iz Gene Expression Omnibus (GEO). Kohorte iz Atlasa genoma raka (TCGA) so bile uporabljene kot nabor za usposabljanje, drugi nizi podatkov pa so bili uporabljeni kot nabor za validacijo. Vključeni so bili samo bolniki s popolnimi informacijami o preživetju. Izključili smo tudi bolnike, ki so prejeli radioterapijo, neoadjuvantno terapijo in ciljno molekularno terapijo v vseh neodvisnih kohortah usposabljanja. Skupno je bilo v našo študijo vključenih 2.700 primerov. Naš projekt je odobril odbor za etično presojo medicinske univerze Chongqing.

2. Obdelava podatkov o izražanju genov

Javno dostopni nabori podatkov iz GEO so bili najprej normalizirani s funkcijo normalizeBetweenArrays, kot je implementirana v paketu 'limma', nato pa so bili nadalje log-transformirani. Metode normalizacije niso bile uporabljene v kohortah TCGA in ICGC.

3. Identifikacija specifičnih IRGP za napovedovanje prognoze

Imunsko povezane gene (IRG) smo prenesli iz baze podatkov ImmPort, do katere smo dostopali 3/3/2021. 2.483 edinstvenih IRG, ki sestavljajo 17 kategorij, vključno s citokini, citokinskimi receptorji, obdelavo antigenov, predstavitvenimi potmi, interlevkini, citotoksičnostjo naravnih celic ubijalk, TGFb in člani družine TNF. Izbrani so bili samo IRG-ji, izmerjeni z vsemi platformami z mediano absolutnega odstopanja > 0,5 v vseh neodvisnih sklopih usposabljanja. Rezultat za vsak IRGP je bil ustvarjen s parnimi primerjavami ravni izražanja genov v določenem vzorcu profilov. Rezultat IRGPs je bil opredeljen kot 1, če je bila stopnja izražanja IRG 1 večja od IRG 2; drugače je bil rezultat IRGP nastavljen na 0 [34]. Po odstranitvi IRGP s konstantnimi vrednostmi v katerem koli posameznem nizu podatkov so bili preostali IRGP dodatno analizirani.

4. Izdelava indeksa imunsko povezanih genskih parov (IRGPI) za napovedovanje prognoze

Prognostični IRGP so bili izbrani na podlagi naslednjih korakov. Prvič, napovedna sposobnost vsakega IRGP za napovedovanje bolnikovega preživetja brez recidiva (RFS) je bila ovrednotena z uporabo Coxovega regresijskega modela v naboru podatkov za meta-usposabljanje in IRGP z vrednostjo p < 0.05 so bili izbrani kot prvi označevalci kandidatov. Drugič, analiza najmanjšega absolutnega krčenja in izbirnega operaterja (LASSO) je bila uporabljena za nadaljnje filtriranje nekaterih manj informativnih IRGP. Nastavitveni parameter je bil določen s pričakovano napako posplošitve, ocenjeno s 10-kratnim navzkrižnim preverjanjem. Da bi izboljšali robustnost, smo naključno razdelili celoten nabor podatkov za meta-usposabljanje v nove nabore podatkov za usposabljanje in testiranje v razmerju 2:1 in 30-krat ponovili shemo naključne razdelitve, da smo stabilizirali izbirni postopek IRGP. Model LASSO je bil nato uporabljen za 30 sklopov usposabljanja in izbrani so bili tisti IRGP s frekvenco > 15. Končno je bil multivariatni Coxov regresijski model uporabljen za izgradnjo napovednega modela na podlagi IRGP in ustvarjanje IRGPI za vse vzorce. Bolniki so bili razvrščeni v skupine z nizkim in visokim imunskim tveganjem z uporabo mediane vrednosti IRGPI.

Izvleček Cistanche

5. Vrednotenje in potrjevanje IRGPI

The prognostic value of the IRGPI was evaluated in the meta-training and independent training sets and was further verified in the meta-validation and multiple independent validation sets. The log-rank test and time-dependent receiver operating characteristic (ROC) curves were adopted to assess the prognostic accuracy of the IRGPI. We combined IRGPI with clinical factors of age, gender, and tumor stage in multivariate Cox analyses. Age (>60) se je spremenilo v 1 in starost (<60) was transformed into 0. Stages III and IV were transformed into 1, and stage I and II were transformed into 0.

6. Profiliranje infiltriranih imunskih celic

CIBERSORT označuje sestavo imunske celice z uporabo profilov genske ekspresije množičnega tumorja [35]. Na podlagi referenčnih vrednosti ekspresije genov (LM22) je sklepal na relativne deleže 22 vrst infiltriranih imunskih celic [35]. V tej študiji so bili deleži 22 infiltriranih imunskih celic določeni z uporabo paketa R 'CIBERSORT'. Perm je bil nastavljen na 1,000 in primeri z izhodno p-vrednostjo CIBERSORT < 0.05 so bili izbrani za nadaljnjo analizo. Za primerjavo razlik v podtipih imunskih celic med skupinama z visokim in nizkim IRGPI je bil uporabljen Wilcoxonov test vsote rangov.

7. Analiza genske ontologije (GO).

Paket R 'clusterProfiler' je bil uporabljen za izvedbo analize obogatitve GO genov, povezanih z IRGPI, v kohorti meta-usposabljanja. Kot prag za določitev pomembnosti je bila uporabljena p-vrednost, prilagojena Benjamini Hochbergu < 0.05 (stopnja napačnih odkritij, FDR).

8. Izdelava in vrednotenje nomograma

Izdelan je bil nomogram za vzpostavitev kvantitativnega pristopa za napoved RFS v kohorti meta-treninga na podlagi IRGPI in kliničnih dejavnikov, kar je bilo nadalje preverjeno v kohortah meta-validacije. Za vsak faktor je bila izračunana točka, skupne točke vseh dejavnikov pa so bile nato pridobljene za oceno stopenj RFS po 1, 3, 5 in 10 letih. Nato so bile narisane kalibracijske krivulje, da se oceni zanesljivost nomograma.

Standardizirana Cistanche

9. Statistična analiza

Paket R 'survival', 'glmnet', 'sure miner', 'timeROC', 'rms', 'CIBERSORT' in 'clusterProfiler' so bili uporabljeni za izdelavo Coxovega regresijskega modela, modela LASSO, Kaplan-Meierjeve krivulje, časa -odvisna krivulja ROC, nomogram, izračun sestave imunskih celic in analiza GO. Povezanost rezultata IRGPI z RFS je bila analizirana s testom log-rank. Coxov regresijski model je bil sprejet za izvedbo multivariatne analize povezave IRGPI z RFS. Dvostranska p-vrednost < 0.05 je veljala za statistično pomembno za vse teste. Vse statistične analize so bile izvedene z uporabo R (različica 4.0.2).

Reference

1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN ocene incidence in umrljivosti po vsem svetu za 36 rakov v 185 državah. CA Cancer J Clin. 2021; 71: 209–49.

2. Seiler R, Oo HZ, Tortora D, Clausen TM, Wang CK, Kumar G, Pereira MA, Ørum-Madsen MS, Agerbæk MØ, Gustavsson T, Nordmaj MA, Rich JR, Lallous N, et al. Onkofetalna modifikacija glikozaminoglikana omogoča terapevtski dostop do raka mehurja, odpornega na cisplatin. Eur Urol. 2017; 72: 142–50.

3. Maroto P, Solsona E, Gallardo E, Mellado B, Morote J, Arranz JÁ, Gómez-Veiga F, Unda M, Clement MÁ, Alcaraz A. Strokovno mnenje o terapiji prve izbire pri zdravljenju raka prostate, odpornega na kastracijo . Crit Rev Oncol Hematol. 2016; 100: 127–36.

4. Fu Q, Xu L, Wang Y, Jiang Q, Liu Z, Zhang J, Zhou Q, Zeng H, Tong S, Wang T, Qi Y, Hu B, Fu H, et al. S tumorjem povezan interlevkin-23, pridobljen iz makrofagov, povezuje zasvojenost z glutaminom pri ledvičnem raku in imunsko utajo. Eur Urol. 2019; 75: 752–63.

5. Zhao Z, Wang Y, Zhang JJ, Huang XY. Zaviralci fascina zmanjšajo migracijo in adhezijo celic, hkrati pa povečajo splošno preživetje miši z rakom mehurja. Raki (Basel). 2021; 13:2698.

6. Peltomaa AI, Raittinen P, Talala K, Taari K, Tammela TL, Auvinen A, Murtola TJ. Napoved raka prostate po uvedbi terapije za odvzem androgena med uporabniki statinov. Populacijska kohortna študija. Rak prostate Prostatic Dis. 2021; 24: 917–24.

7. Tian M, Wang T, Wang P. Razvoj in klinična validacija prognostičnega podpisa sedmih genov, ki temelji na več algoritmih strojnega učenja pri raku ledvic. Presaditev celic. 2021; 30:963689720969176.

8. Zhang C, Gou X, He W, Yang H, Yin H. Podpis 4-mRNA, ki temelji na glikolizi, je v korelaciji s prognozo in procesom celičnega cikla pri bolnikih z rakom mehurja. Cancer Cell Int. 2020; 20:177.

9. Chen S, Zhang N, Shao J, Wang T, Wang X. Nova kombinacija genskega podpisa izboljša napoved celotnega preživetja pri raku sečnega mehurja. J Rak. 2019; 10: 5744–53.

10. Xu Z, Xu L, Liu L, Li H, Jin J, Peng M, Huang Y, Xiao H, Li Y, Guan H. Pet-genski podpis, povezan z glikolizo, napoveduje preživetje brez biokemičnih ponovitev pri bolnikih s prostato Adenokarcinom. Sprednji Oncol. 2021; 11: 625452.

11. Nguyen HT, Xue H, Firlej V, Ponty Y, Gallopin M, Gauthier D. Brezreferencni transkriptomski podpisi za prognozo raka prostate. Rak BMC. 2021; 21:394.

12. Lu J, Qian C, Ji Y, Bao Q, Lu B. Gene Signature Associated With Bromodomain Genes Predicts the Prognosis of Kidney Renal Clear Cell Carcinoma. Sprednji Genet. 2021; 12: 643935.

13. Wu Y, Wei X, Feng H, Hu B, Liu B, Luan Y, Ruan Y, Liu X, Liu Z, Liu J, Wang T. Integrirana analiza za identifikacijo redox-povezanega prognostičnega podpisa za svetlocelične ledvične celice karcinom. Oxid Med Cell Longev. 2021; 2021: 6648093.

14. Shi R, Bao X, Unger K, Sun J, Lu S, Manapov F, Wang X, Belka C, Li M. Identifikacija in validacija genskih podpisov, pridobljenih iz hipoksije, za napovedovanje kliničnih izidov in terapevtskih odzivov pri bolnikih s pljučnim adenokarcinomom na stopnji I . Teranostika. 2021; 11: 5061–76.

15. Brendel M, Barthel H, van Eimeren T, Marek K, Beyer L, Song M, Palleis C, Gehmeyr M, Fietzek U, Respondek G, Sauerbeck J, Nitschmann A, Zach C, et al. Ocena 18F-PI-2620 kot biomarkerja pri progresivni supranuklearni paralizi. JAMA Neurol. 2020; 77: 1408–19.

16. Lee ES, Jung SY, Kim JY, Kim JJ, Yoo TK, Kim YG, Lee KS, Lee ES, Kim EK, Min JW, Han W, Noh DY, Moon HG. Identifikacija potencialnih dolgotrajnih preživelih med bolnicami z rakom dojke z oddaljenimi metastazami. Ann Oncol. 2016; 27: 828–33.

17. Franks JM, Cai G, Whitfield ML. Funkcionalno specifična kvantilna normalizacija omogoča medplatformno klasifikacijo molekularnih podtipov z uporabo podatkov o izražanju genov. Bioinformatika. 2018; 34: 1868–74.

18. Shen Y, Rahman M, Piccolo SR, Gusenleitner D, ElChaar NN, Cheng L, Monti S, Bild AH, Johnson WE. ASSIGN kontekstno specifično genomsko profiliranje več heterogenih bioloških poti. Bioinformatika. 2015; 31: 1745–53.

19. Wu J, Zhao Y, Zhang J, Wu Q, Wang W. Razvoj in validacija podpisa imunsko povezanih genskih parov pri kolorektalnem raku. Onkoimunologija. 2019; 8: 1596715.

20. Xu F, Zhan X, Zheng X, Xu H, Li Y, Huang X, Lin L, Chen Y. Podpis imunsko povezanih genskih parov napoveduje onkološke izide in odziv na imunoterapijo pri pljučnem adenokarcinomu. Genomika. 2020; 112: 4675–83.

21. Wang S, Xu X. Podpis parov genov, povezanih z imunskim sistemom, za napovedovanje preživetja pri glioblastomu. Sprednji Oncol. 2021; 11: 564960.

22. Pfannstiel C, Strissel PL, Chiappinelli KB, Sikic D, Wach S, Wirtz RM, Wullweber A, Taubert H, Breyer J, Otto W, Worst T, Burger M, Wullich B, et al, in BRIDGE Consortium, Nemčija. Tumorsko imunsko mikrookolje spodbuja prognostično pomembnost, ki je povezana s podtipi raka mehurja. Cancer Immunol Res. 2019; 7: 923–38.

23. Long X, Hou H, Wang X, Liu S, Diao T, Lai S, Hu M, Zhang S, Liu M, Zhang H. Imunski podpis, ki ga poganja ADT-inducirano preoblikovanje imunskega mikrookolja pri raku prostate, je povezano s ponovitvijo- prosto preživetje in imunska infiltracija. Cell Death Dis. 2020; 11:779.

24. Vuong L, Kotecha RR, Voss MH, Hakimi AA. Dinamika tumorskega mikrookolja pri svetloceličnem karcinomu ledvičnih celic. Rak Discov. 2019; 9: 1349–57.

25. Maio M, Blank C, Necchi A, Di Giacomo AM, Ibrahim R, Lahn M, Fox BA, Bell RB, Tortora G, Eggermont AM. Neoadjuvantna imunoterapija preoblikuje obvladovanje raka pri več vrstah tumorjev: Prihodnost je zdaj! Eur J Rak. 2021; 152: 155–64.

26. Kates M, Nirschl TR, Baras AS, Sopko NA, Hahn NM, Su X, Zhang J, Kochel CM, Choi W, McConkey DJ, Drake CG, Bivalacqua TJ. Kombinirana analiza sekvenciranja naslednje generacije in pretočne citometrije za delnega odziva na antiPD-L1 skozi čas: raziskovanje mehanizmov aktivnosti in odpornosti PD-L1 pri raku mehurja. Eur Urol Oncol. 2021; 4: 117–20.

27. Sharma P, Pachynski RK, Narayan V, Fléchon A, Gravis G, Galsky MD, Mohammed H, Patnaik A, Subudhi SK, Ciprotti M, Simsek B, Saci A, Hu Y, et al. Nivolumab Plus Ipilimumab za metastatskega raka prostate, odpornega na kastracijo: predhodna analiza bolnikov v preskušanju CheckMate 650. Rakava celica. 2020; 38: 489–99.e3.

28. Ruiz de Porras V, Pardo JC, Notario L, Etxaniz O, Font A. Inhibitorji imunske kontrolne točke: obetavna možnost zdravljenja metastatskega raka prostate, odpornega na kastracijo? Int J Mol Sci. 2021; 22:4712.

29. Kamai T, Kijima T, Tsuzuki T, Nukui A, Abe H, Arai K, Yoshida KI. Povečano izražanje receptorjev adenozina 2A pri metastatskem karcinomu ledvičnih celic je povezano s slabšim odzivom na sredstva protivaskularnega endotelijskega rastnega faktorja in protitelesa proti PD-1/AntiCTLA4 ter krajšim preživetjem. Cancer Immunol Immunother. 2021; 70: 2009–21.

30. Chu G, Xu T, Zhu G, Liu S, Niu H, Zhang M. Identifikacija novega podpisa na osnovi beljakovin za izboljšanje napovedi prognoze pri ledvičnem svetloceličnem karcinomu. Sprednji Mol Biosci. 2021; 8: 623120.

31. Gorin MA, Verdone JE, van der Toom E, Bivalacqua TJ, Allaf ME, Pienta KJ. Krožeče tumorske celice kot biomarkerji raka prostate, mehurja in ledvic. Nat Rev Urol. 2017; 14:90–7.

32. Tölle A, Suhail S, Jung M, Jung K, Stephan C. Beljakovine, ki vežejo maščobne kisline (FABP) v celičnih linijah raka prostate, mehurja in ledvic ter uporaba IL-FABP kot napovedovalec preživetja pri bolnikih s karcinomom ledvičnih celic . Rak BMC. 2011; 11:302.

33. Jungwirth N, Haeberle L, Schrott KM, Wullich B, Krause FS. Serotonin se uporablja kot prognostični marker uroloških tumorjev. Svetovni J Urol. 2008; 26: 499–504.

34. Li B, Cui Y, Diehn M, Li R. Razvoj in validacija individualiziranega imunskega prognostičnega podpisa v zgodnji fazi neskvamoznega nedrobnoceličnega pljučnega raka. JAMA Oncol. 2017; 3: 1529–37.

35. Newman AM, Liu CL, Green MR, Gentles AJ, Feng W, Xu Y, Hoang CD, Diehn M, Alizadeh AA. Robustno naštevanje podmnožic celic iz profilov tkivne ekspresije. Nat metode. 2015; 12: 453–7.

Biao Xie 1, Kangjie Li 1, Hong Zhang 1, Guichuan Lai 1, Dapeng Li 2, Xiaoni Zhong 1.

1. Oddelek za biostatistiko, Šola za javno zdravje in management, Medicinska univerza Chongqing, Chongqing, Kitajska

2. Inštitut za hepatologijo, Nacionalni klinični raziskovalni center za nalezljive bolezni, Shenzhen Third People's Hospital, Shenzhen, Kitajska