DelⅠPresnovno razumevanje genetske disregulacije v tumorskem mikrookolju ledvičnega svetloceličnega karcinoma

Povzetek

Presnovna disregulacija je značilnost raka, vključno s KIRC, ki jo povzročajo spremembe v presnovnih genih. Trenutno obstaja pomanjkanje soglasja med presnovnimi podpisi v tumorskem mikrookolju. V tej študiji smo opazili pomembne korelacije različno izraženih presnovnih genov (DEmG) med KIRC in sorodnimi normalnimi vzorci. Na kratko, zbrali smo sklope presnovnih genov s podatki RNA-seq KIRC in normalnih tkiv iz TCGA, čemur je sledila identifikacija DEmG, povezanih s KIRC. Nato smo bolnike razvrstili v tri skupine in z uporabo WGCNA smo med različnimi skupinami identificirali presnovne gene, ki sodelujejo pri preživetju.

Poleg tega smo raziskali preživetje in klinične parametre skupaj z imunsko infiltracijo v grozdih. Hkrati smo izdelali in validirali napovedni model, ki temelji na teh DEmG. Te analize so pokazale, da so bolniki z visoko izraženostjo DEmG pokazali slabo preživetje, medtem ko je bila infiltracija manj imunskih celic povezana z metastazo KIRC. Na koncu smo identificirali NUDT1 kot gen središča, saj je pokazal znatno visoko izraženost v vzorcih KIRC, pa tudi povezan s preživetjem in prognozo bolnikov. Nadaljnja analiza je pokazala onkogeno vlogo NUDT1 v celicah 786-O in ACHN. Tako sklepamo, da bi lahko bil NUDT1 potencialni diagnostični in prognostični marker za KIRC.

Ključne besede

presnovna disregulacija; Diferencialno izraženi presnovni geni (DEmG); Stopnja preživetja; NUDT1;Koristi Cistanche.

Kliknite tukaj, če želite izvedetiCistanchejevi učinki

Uvod

Ledvični svetlocelični karcinom (KIRC) je vrsta ledvičnoceličnega karcinoma (RCC), ki velja za enega od pogostih rakov, ki predstavlja 70–80 odstotkov primerov [1] in je uvrščen na 16. mesto najpogostejših vzrokov umrljivosti zaradi raka. po vsem svetu [2]. Karcinom ledvičnih celic (RCC) je najpogostejša vrsta raka ledvic in predstavlja 90 odstotkov primerov raka ledvic [3]. V zadnjem času se široko uporablja bioinformatska identifikacija potencialnih markerjev pri raku, vendar je bilo ugotovljenih le nekaj zanesljivih biomarkerjev KIRC ali pa večina markerjev še ni v celoti potrjenih. Zato so bioinformatične analize skupaj z eksperimentalnimi validacijami potrebne za pojasnitev možnega mehanizma biogeneze in napredovanja KIRC [4]. Poglobljeno raziskovanje tumorskega mikrookolja in razvoj imunoterapije sta omogočila preučevanje interakcije med tumorji in imunskim sistemom [5]. Kljub temu mnogi od identificiranih biomarkerjev niso bili raziskani glede njihovega učinka na celični fenotip in ustrezne osnovne molekularne mehanizme v KIRC [6]. Vendar pa je napoved bolnikov s KIRC slabo razumljena in skupno 5-letno preživetje je manj kot 10 odstotkov po prvi diagnozi [7, 8]. Na splošno normalna tkiva pretežno vsebujejo visoke ravni antiangiogenih dejavnikov. Motnje v ravni teh dejavnikov lahko aktivirajo proangiogene dejavnike, ki dodatno povečajo delitev celic z nenormalno hitrostjo, kar vodi v nastanek tumorja [9]. V tem procesu tumorske celice izražajo visoko raven proangiogenega rastnega faktorja in ta učinek podpira razvoj novih krvnih žil v tumorjih [10]; tako se začne razvoj tumorja. Zato so številni drugi dejavniki vključeni v tumorigenezo, vključno z infiltracijo imunskih celic in izražanjem različnih presnovnih genov. Dobro je znano, da prisotnost različnih vrst imunskih celic v tumorskem mikrookolju v veliki meri vpliva na napredovanje tumorja in imunoterapijo; tako spremembe imunsko povezanih genov vplivajo tudi na delež in delovanje imunskih celic v tumorskem mikrookolju [11]. Na primer, infiltracija imunskih celic v mikrookolje tumorja pomembno vpliva na razvoj glioma [12]. Kljub pomanjkanju zanimanja za presnovne gene, ki vplivajo na raka, so trenutne študije obnovile to zavest o raku kot presnovni motnji [13, 14]. Te študije zagotavljajo osnovo za vključitev presnovnega reprogramiranja kot novega znaka maligne transformacije [15]. Vendar se izražanje vseh presnovnih genov ali poti med različnimi tkivi, vključno s tumorji in normalnimi tkivi, razlikuje med seboj in je v veliki meri neraziskano, zlasti v KIRC.

Na splošno je v KIRC na voljo manjše število zanesljivih biomarkerjev za napovedovanje prognoze in imunoterapevtskih odzivov; zato je težko doseči popoln klinični uspeh. Zato bi lahko obsežne študije bioinformatike skupaj z eksperimentalnimi validacijami razjasnile potencialne mehanizme biogeneze in napredovanja KIRC. Tako je trenutna študija namenjena celoviti oceni učinkov presnovnih poti na presnovne transkripcijske profile v KIRC v primerjavi z njihovimi ujemajočimi se normalnimi tkivi. Tu smo uspešno ne le ločili različna mesta bolezni ali različne molekularne podtipe iste bolezni, ampak tudi napovedali odziv na terapijo, usmerjeno v presnovo. To predstavlja nov način prepoznavanja mehanizma, s katerim so presnovne poti motene pri malignosti, in ponuja nove tarče za klinične posege.

Standardizirana Cistanche

Material in metode

1. Pridobitve podatkov.

Podatki o sekvenciranju RNA (FPKM), pomembni za KIRC, so bili neposredno preneseni iz Atlasa genoma raka (TCGA). Nato so bili podatki obdelani v skladu z želenimi nadaljnjimi aplikacijami. Poleg tega so bili klinično-patološki podatki za ustrezne bolnike KIRC, vključno s spolom, raso, starostjo, lokacijo tumorja, histološko klasifikacijo, stopnjo diferenciacije, stopnjo tumorja in informacijami o preživetju, pridobljeni iz UCSC Cancer Browser. Da bi pridobili vpogled v presnovno heterogenost bolnikov s KIRC, so bili nizi presnovnih genov vzeti iz prejšnjih publikacij [16, 17]. Grafični izvleček te študije je prikazan na dodatni sliki 1, podroben delovni tok študije pridobivanja podatkov in nadaljnjega procesa pa je prikazan na dodatni sliki 2.

2. Identifikacija diferencialno izraženih presnovnih genov (DEmG).

Nabori presnovnih genov so bili identificirani s presečišči dveh nizov podatkov in uporabljeni za analizo DEG med tumorskimi in normalnimi vzorci. Kasneje smo identificirali tudi DEmG z uporabo WGCNA in na podlagi načinov preživetja so jih bolniki razvrstili v tri skupine. Na kratko, bolniki so bili razdeljeni v tri skupine, in sicer skupino C1, skupino C2 in skupino C3. Za identifikacijo DEG so bili uporabljeni linearni modeli z uporabo paketa R limma. Kot prag za identifikacijo DEG je bila nastavljena stopnja napačnega odkrivanja (FDR) < 0.05 v kombinaciji s hkratno absolutno vrednostjo log2-kratne spremembe, logFC > 1 in logFC < −1. Vulkanske ploskve so bile izdelane z uporabo ggplot2. Geni z logFC> 1 so veljali za regulirane navzgor, tisti z logFC <-1 pa so bili dodeljeni kot znižani geni.

3. Analize funkcionalne obogatitve in interakcije protein-protein.

Analize obogatitve s termini GO in KEGG so bile izvedene prek profila R package Cluster. Izrazi GO so bili razdeljeni v tri kategorije, vključno z molekularnimi funkcijami (MF), celičnimi komponentami (CC) in biološkimi procesi (BP). Da bi ugotovili pomembne razlike in korelacije DEmG med tumorskimi in normalnimi tkivi, smo uporabili računalniško programsko opremo GSEA (gene set enrichment analysis). Izvedene so bile analize obogatitve DEG s KEGG in GO (Gene Ontology), da bi identificirali potencialne poti in funkcije. Poleg tega je bila aplikacija cistoskop uporabljena za izgradnjo omrežja protein-protein interakcije (PPI) DEmG. Začetni PPI je bil pridobljen iz baze podatkov STRING. Najvišja meja zaupanja je bila nastavljena na 0.9.

4. Analiza preživetja.

Različno izraženi geni pri bolnikih z ledvičnim rakom so bili identificirani s paketom limma, različno izraženi geni pa so bili analizirani z uporabo paketa WGCNA za izvedbo koekspresije, da bi zgradili koekspresijsko mrežo, ki je identificirala skupno 6 modulov.=5 in omrežje je omrežje brez obsega. Prognostični pomen DEmG, ki jih je identificiral WGCNA v načinu preživetja, je bil določen s Kaplan-Meierjevimi (KM) ploskvami s testom log-rank.

Cistanche tablete

5. Analiza imunske infiltracije.

Imunske in stromalne celice so bile izračunane z uporabo paketa R, "xCELL; " za nadaljnjo analizo so bili izbrani vzorci s p < 0:05. Poleg tega so bile imunske celice, ki vsebujejo biološke markerje, analizirane s paketom R GSVA. Poleg tega smo za analizo čistosti tumorja uporabili algoritem ESTIMATE za oceno stromalnih in imunskih rezultatov serije tkiv KIRC.

6. Izdelava modela napovedi.

Različno izraženi presnovni geni so bili pridobljeni iz podatkov o sekvenciranju RNA tumorjev KIRC z informacijami o preživetju, bolniki pa so bili naključno razdeljeni v kohorte za usposabljanje in testiranje z uporabo paketa R "caret;" nato je bila izvedena univariatna analiza preživetja na DEmG. Poleg tega je bila analiza LASSO izvedena s paketom R "glmnet;" za optimizacijo modela napovedi pa je bil uporabljen postopni proporcionalni model nevarnosti.

7. Celična kultura.

Celični liniji človeškega ledvičnega raka 786-O in ACHN sta bili kupljeni pri American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, ZDA). Celične linije 786-O so bile gojene v gojišču RPMI 1640 (kat. št. 11875093, Invitrogen, Carlsbad, CA, Združene države), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (kat. št. 04-001- 1ACS, Biološka industrija, Izrael). Celične linije ACHN smo gojili v mediju MEM (kat. št. 41500034, Invitrogen, Carlsbad, CA, Združene države), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma. Vse kulture so bile inkubirane pri 37 stopinjah C in 5 odstotkih CO₂v navlaženem inkubatorju.

8. Kvantitativni PCR v realnem času.

Celotno RNA iz celičnih linij in tkiv KIRC smo izolirali z uporabo TRIzola (kat. št. 9109; TaKaRa, Tokio, Japonska) v skladu s protokoli proizvajalca. RT-qPCR smo izvedli s kompletom QuantiNova SYBR Green PCR (kat. št. 208054, QIAGEN, Duesseldorf, Nemčija). Relativno izražanje genov je izračunal 2^−ΔΔCtmetoda. Sekvence primerjev so navedene v dodatni tabeli 1.

9. Test viabilnosti celic.

Citotoksičnost po transfekciji siRNA NUDT1 v 786-O in ACHN je bila določena z uporabo kompleta za štetje celic-8 (CCK-8) (kat. št. C0038, Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Kitajska). Sekvence siRNA NUDT1 so navedene v dodatni tabeli 1. Sintetizirane so bile iz GenePharma (Šanghaj, Kitajska). Na kratko, obe celični liniji 786-O in ACHN v logaritemski fazi rasti (24 ur po transfekciji siRNA) smo zbrali in razdelili v 96-plošče za celično kulturo 96-vdolbinic (1000 celic/vdolbinico). Naslednji dan smo v vsako vdolbinico dodali 10 ul CCK-8. Po inkubaciji pri 37 stopinjah C za nadaljnji 2 uri je bila optična gostota (OD) celic pri 450 nm zaznana z bralnikom mikroplošč (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, ZDA).

10. Test celične migracije, invazije in apoptoze.

Celice KIRC {{0}}O in ACHN so bile transfektirane za razpad NUDT1, posredovan s siRNA. Po 24 urah po transfekciji smo celice zasejali v 6-plošče z vdolbinicami za test celjenja ran. Ko so celice dosegle 100-odstotno sotočje, so bile rane v celicah ustvarjene kot enoslojna z uporabo plastične konice pipete. Celice smo nato splaknili s PBS in gojili še 48 ur. Razdaljo zaprtja rane smo vizualizirali z mikroskopom in fotografirali za merjenje učinka knockdowna NUDT1 na celice KIRC 786-O in ACHN. Selitev in invazija celic je bila izvedena z uporabo transwell 24-plošč z jamicami (Corning, New York, NY). Skratka, enako število celic smo gojili v mediju brez FBS v zgornji komori, migracijo celic pa smo opazili v spodnji komori transvodnice, kjer je bil medij dopolnjen z 10 odstotki FBS. Transwellove komore so bile skrbno oprane in obarvane z 0,2-odstotno kristalno vijolično, vizualizirane in fotografirane; kasneje so bile razlike med migriranimi celicami med negativno kontrolo in knockdownom NUDT1 določene s preprostim štetjem celic. Test apoptoze smo izvedli po 72 urah transfekcije, celice smo pobrali, sprali in resuspendirali v ledeno hladnem PBS. Celice smo nato zaznali s kompletom za odkrivanje apoptoze (kat. št. KGA1013, KeyGen BioTech, Nanjing, Kitajska) v skladu z navodili proizvajalca in pregledali s pretočno citometrijo (FACScan; BD Biosciences). Vsi poskusi so bili izvedeni v treh izvodih.

11. Statistična analiza.

Vse statistične analize so bile izvedene na prizmi GraphPad (V7.0) in R (3.6.4), Wilcoxov test je bil uporabljen za primerjavo infiltracije imunskih celic v normalnih in tumorskih tkivih ter hi-kvadrat test je bila izvedena za preučevanje korelacije med infiltracijo imunskih celic in patološkimi parametri. Analiza variance je bila uporabljena za primerjavo imunskega rezultata, stromalnega rezultata in čistosti tumorja med tremi skupinami. Za analizo preživetja je bila p-vrednost izračunana s testom log-rank. P-vrednost<0.05 was considered statistically significant.

Cistanche dodatki

Reference

[1] V. Nerich, M. Hugues, T. Nai, et al., "Klinični vpliv tarčnih terapij pri bolnikih z metastatskim svetloceličnim karcinomom ledvičnih celic," Oncotargets and Therapy, vol. 7, str. 365–374, 2014.

[2] A. Znaor, J. Lortet-Tieulent, M. Laversanne, A. Jemal in F. Bray, "International variations and trends in renal cell carcinoma incidence and mortality", European Urology, vol. 67, št. 3, str. 519–530, 2015.

[3] B. Ljungberg, L. Albiges, Y. Abu-Ghanem, et al., "Smernice Evropskega urološkega združenja o raku ledvičnih celic: Posodobitev 2019," European Urology, vol. 75, št. 5, str. 799– 810, 2019.

[4] W. Zheng, S. Zhang, H. Guo et al., "Multi-omična analiza značilnosti tumorske angiogeneze in potencialnih epigenetskih regulacijskih mehanizmov pri ledvičnem svetloceličnem karcinomu", Celična komunikacija in signalizacija: CCS, vol. 19, št. 1, str. 39, 2021.

[5] J. Galon in D. Bruni, "Pristopi k zdravljenju imunsko vročih, spremenjenih in hladnih tumorjev s kombiniranimi imunoterapijami," Nature Reviews Drug Discovery, vol. 18, št. 3, str. 197–218, 2019.

[6] W. du, L. Zhang, A. Brett-Morris et al., "HIF spodbuja odlaganje lipidov in raka pri ccRCC prek zatiranja presnove maščobnih kislin," Nature Communications, vol. 8, št. 1, str. 1769, 2017.

[7] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, et al., "Cancer statistics, 2008," CA: A Cancer Journal for Clinicians, vol. 58, št. 2, str. 71–96, 2008.

[8] I. Lucca, T. Klatte, H. Fajkovic, M. de Martino in SF Shariat, "Erratum: Razlike med spoloma v incidenci in rezultatih urotelnega in ledvičnega raka," Nature Reviews Urology, vol. 12, št. 12, str. 653, 2015.

[9] IJ Fidler, "Angiogeneza in metastaze raka", Cancer Journal, vol. 6, Dodatek 2, str. S134–S141, 2000.

[10] C. Kut, F. Mac Gabhann in AS Popel, "Kje je VEGF v telesu? Meta-analiza porazdelitve VEGF pri raku," British Journal of Cancer, vol. 97, št. 7, str. 978–985, 2007.

[11] F. Ren, Q. Zhao, M. Zhao, et al., "Profiliranje imunske infiltracije pri raku želodca in njihove klinične posledice," Cancer Science, vol. 112, št. 9, str. 3569–3584, 2021.

[12] X. Ge, Z. Wang, R. Jiang et al., "SCAMP4 je nov prognostični marker in je povezan z napredovanjem tumorja in imunsko infiltracijo v gliomu," The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol. 139, 2021.

[13] MG Vander Heiden in RJ DeBerardinis, "Razumevanje presečišč med metabolizmom in biologijo raka", Cell, vol. 168, št. 4, str. 657–669, 2017.

[14] DS Wishart, "Ali je rak genetska bolezen ali presnovna bolezen?" biomedicina, letn. 2, št. 6, str. 478-479, 2015.

[15] D. Hanahan in RA Weinberg, "Znaki raka: naslednja generacija", Cell, vol. 144, št. 5, str. 646–674, 2011.

[16] X. Peng, Z. Chen, F. Farshidfar, et al., "Molekularna karakterizacija in klinični pomen podtipov presnovne ekspresije pri raku pri ljudeh," Cell Reports, vol. 23, št. 1, str. 255–269.e4, 2018.

[17] S. Haider, A. McIntyre, RG van Stiphout, et al., "Genomske spremembe so osnova presnovnega premika pan-raka, povezanega s tumorsko hipoksijo," Genome Biology, vol. 17, št. 1, str. 140, 2016.

Junwei Xie,1,2,3,4,5 Lingang Cui,6 Shaokang Pan,1,2,3,4,5 Dongwei Liu,1,2,3,4,5 Fengxun Liu,1,2,3,4 ,5 in Zhangsuo Liu 1,2,3,4,5

1 Oddelek za nefrologijo, Prva pridružena bolnišnica univerze Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Kitajska

2 Raziskovalni inštitut za nefrologijo, Univerza Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Kitajska

3 Raziskovalni center za ledvične bolezni, Zhengzhou, 450052 Henan, Kitajska

4 ključni laboratorij za natančno diagnozo in zdravljenje kronične ledvične bolezni v provinci Henan, Zhengzhou 450052, Kitajska

5. osrednja enota nacionalnega kliničnega medicinskega raziskovalnega centra za ledvične bolezni, Zhengzhou 450052, Kitajska

6 Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Kitajska