Del Ⅰ Kelator železa, PBT434, modulira transcelični promet železa v mikrovaskularnih endotelijskih celicah možganov

Povzetek

Železo in druge prehodne kovine, kot sta baker in mangan, so bistvenega pomena za podporo delovanja možganov, vendar je prekomerno kopičenje citotoksično. To prekomerno kopičenje kovin, zlasti železa, je skupno številnim nevrološkim motnjam; te vključujejo Alzheimerjevo bolezen, Parkinsonovo bolezen, Friedrichovo ataksijo in druge motnje, ki se kažejo z nevrodegeneracijo in s tem povezanim kopičenjem železa v možganih. Upravljanje pretoka železa s krvno-možgansko pregrado zagotavlja prvo obrambno linijo pred prekomernim kopičenjem železa v normalni fiziologiji in teh patoloških stanjih. V tej študiji smo ugotovili, da kelator železa PBT434, ki se trenutno razvija za zdravljenje Parkinsonove bolezni in multiple sistemske atrofije, modulira privzem železa v mikrovaskularnih endotelijskih celicah človeških možganov (hBMVEC) s kelacijo zunajceličnega Fe^{2 plus}. Zdravljenje hBMVEC s PBT434 povzroči povečanje številčnosti transkriptov za transferinski receptor (TfR) in ceruloplazmin (Cp). Analiza Western blot in ELISA razkrivata tudi ustrezno povečanje beljakovin. V celici PBT434 poveča zaznavno raven dobrodelnega, labilnega Fe^{2 plus}; podatki kažejo, da je ta Fe^{2 plus}se sprosti iz feritina. Poleg tega PBT434 potencira izliv železa verjetno zaradi povečanja citosolnega železovega železa, substrata za izvoznika železa, feroportina. PBT434 se hitro in dvosmerno uravnoteži preko krvno-možganske pregrade hBMVEC. Ti rezultati kažejo, da kompleks železa PBT434- ni substrat za privzem hBMVEC in tako podpirajo model, v katerem bi PBT434 kelatiral intersticijsko železo in zaviral ponovni privzem železa s strani endotelijskih celic krvno-možganske pregrade, kot in zavirajo njegov prevzem s strani drugih celic nevrovaskularne enote. Na splošno to predstavlja nov in obetaven mehanizem za terapevtsko kelacijo železa.

Kliknite tukaj, da dobitekakšne so prednosti Cistanche

Uvod

Terapija s kelacijo kovin (MCT) se že dolgo uporablja kot zdravljenje zastrupitve s prehodnimi kovinami in genetskih motenj v presnovi bistvenega kovinskega iona, ki vodi v prekomerno kopičenje kovine [1–3]. Dva primera slednjega sta hiper-akumulacija bakra pri Wilsonovi bolezni [4] in železa pri dedni hemokromatozi [5]. Tako baker kot železo sta katalizatorja oksidativnega stresa in sta zato citotoksična v koncentracijah, ki presegajo zmožnost celice in organizma, da 'nadzorujeta' tem redoks-aktivnim prehodnim kovinam [6, 7]. Zlasti kopičenje železa je na splošno idiopatsko; dejansko je povečanje železa znak starajočih se možganov [8–10]. Patološko je to kopičenje železa v možganih značilnost mutacij v genih, ki niso povezani s presnovo železa [11–15], pa tudi vrste drugih nevrodegenerativnih bolezni, od katerih nekatere nimajo specifične genetske povezave, kot je staranje [16], Alzheimerjeva bolezen [1]. 17], Friedreichovo ataksijo [18] in Parkinsonovo bolezen [19]. Kot skupino lahko takšne motnje obravnavamo kot nevrodegeneracijo z kopičenjem železa v možganih (NBIA), čeprav je ta akronim običajno omejen na tiste, za katere je bila ugotovljena genetska povezava [11, 13, 14].

V primeru preobremenitve z železom je cilj "očistiti" telo odvečnega železa zaradi okvare v celičnem privzemu ali iztoku železa. Tukaj je cilj premagati konkurenco fiziološkim kelatorjem železa z zdravilom; spojina, ki ima dobro farmakokinetiko in visoko afiniteto do železovega železa, je tarčno zdravilo. Ker je telo prenapolnjeno z esencialno kovino, ni veliko skrbi, da bi povzročili pomanjkanje med zdravljenjem. Zdravljenje možganske bolezni s kelacijsko terapijo z železom zahteva drugačno strategijo. Ne gre za problem sistemske preobremenitve z železom, temveč za kopičenje železa na področjih patologije s škodljivimi posledicami na koncu. S starostjo povezano kopičenje železa pri Parkinsonovi bolezni (PB) na primer potencialno prispeva k celični poškodbi, povezani z oksidativnim stresom [20]. Prekomerno labilno železo spodbuja napačno zvijanje -sinukleina v substantia nigral nevronih. Uporaba kelatorja z visoko afiniteto lahko nekoliko zmanjša obremenitev možganov z železom, vendar bo zagotovo povzročila pomanjkanje železa, ki je kontraindicirano vsaj pri starejši populaciji glede na sistemsko pomanjkanje železa, ki je običajno za to starostno skupino [21]. . Kelator z optimalno afiniteto lahko zmanjša kopičenje železa kot tudi spremljajoči oksidativni stres zaradi presežka labilnega železa in osnovnih bolezenskih procesov.

Cistanche tubulosainCistanchejevi učinki

En kelator, odobren za uporabo pri zdravljenju preobremenitve z železom zaradi transfuzije pri bolnikih s talasemijo, je deferipron (DFP, blagovna znamka Ferriprox) [5, 22]. DFP je bil uporabljen tudi pri zdravljenju Friedreichove ataksije [23] in Parkinsonove bolezni [24, 25]. V meta-analizi je bilo dokazano, da DFP zagotavlja znatno zmanjšanje vsebnosti železa v miokardu kot tudi večjo zaščito srca pri bolnikih s talasemijo kot deferoksamin, klasično kelatno sredstvo za železo [5]. Po drugi strani se DFP hitro presnavlja v jetrih [26] in novejše delo je pokazalo, da kelatira Fe2 plus na aktivnem mestu od železa odvisnih histonskih lizin demetilaz, aktivnost, ki je v korelaciji s prej neprepoznano citotoksičnostjo [27]. Ta ugotovitev poudarja ključno omejitev pri uporabi kelacijske terapije z železom, in sicer konkurenco zdravila za fiziološko esencialno železo, bodisi v zalogi železa bodisi v beljakovini, ki vsebuje protetično vrsto železa. Kljub temu je na primer DFP pokazal učinkovitost v 2. fazi preskušanja zdravljenja Parkinsonove bolezni, kot kažejo tako analitični (zmanjšana obremenitev možganov z železom s T2- tehtano MRI) kot vedenjski indeksi (kognitivna in motorična nevronska funkcija) [ 24, 25].

Afiniteta DFP za Fe3 plus pa ostaja zaskrbljujoča. Stabilna vrsta DFP-železa je tris-kompleks [Fe(DFP)3] 0 [28]. Medtem ko je nevtralnost tega kompleksa idealna za mobilizacijo železa iz celice, konstanta stabilnosti zanj, ~1037, naredi DFP pravi čistilec železa; v tem kontekstu je njegovo zaviranje železovega encima, kot je lizin demetilaza, predvidljivo [27]. Ta skrb odraža potrebo po razvoju kelatorjev železa, ki imajo prepustnost membrane kot DFP, vendar znatno šibkejšo afiniteto za Fe2 plus in Fe3 plus. Ta zadnja značilnost omejuje odstranjevanje zdravila iz protetične kovine in termodinamični potencial kelatnega sredstva za kataliziranje avtooksidacije železovega železa, ki ima za posledico proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst. V bistvu močni kelatorji železovega železa katalizirajo prooksidativno lastnost Fe2 plus [29]. V tej študiji poročamo, kako takšen kelator železa z zmernimi afinitetami do železa in železa modulira pretok železa v možganskih mikrovaskularnih endotelijskih celicah, ki tvorijo krvno-možgansko pregrado (BBB).

Cistanche tablete

To zdravilo, PBT434 [5,7-dikloro-2-((metilamino)metil)-8-hidroksi-3-metilkinazolin-4 (3H)-on, slika 1A] , tvori kompleks bis-železa s konstantami stabilnosti log ~11 in ~15 za Fe^{2 plus}in Fe^{3 plus}, oziroma [30]. PBT434 je preprečil izgubo nevronov substantia nigra pars compacta (SNpc), zmanjšal kopičenje nigral-sinukleina, zmanjšal vsebnost železa v srednjih možganih, povezano z modelom bolezni PD, in rešil motorično zmogljivost pri dveh mišjih modelih Parkinsonove bolezni brez kakršnega koli očitnega izčrpanja sistemskih zalog železa [30]. PBT434 je učinkovit tudi pri mišjih modelih večsistemske atrofije (MSA) [30, 31], motorične motnje, ki je po predstavitvi podobna Parkinsonovi bolezni, vendar je zanjo značilno napačno zvijanje -sinukleina in kasnejše kopičenje, ki povzroči nastanek glialnih citoplazemskih vključkov, ki so značilni znak patologija bolezni [32]. Pomembno je, da je PBT434 zmanjšal označevalce oksidativnega stresa pri mišjih modelih PD [30], kar kaže, da 1) PBT434 cilja na zaloge železa, ki so bile sicer pripravljene za delovanje kot prooksidanti, in 2) PBT434 ni okrepil te nastajajoče citotoksičnosti, ki temelji na oksidaciji. PBT434 je zadovoljivo zaključil študijo 1. faze [33].

Tukaj predstavljeno delo je bilo zasnovano za preučevanje vpliva PBT434 na promet z železom v pregradnih celicah možganov, mikrovaskularnih endotelijskih celicah, ki skupaj z osnovno glijo tvorijo krvno-možgansko pregrado. Te študije so uporabile dobro potrjeno imortalizirano endotelijsko celično linijo tako v enoslojni kot transwell obliki kulture [34–37]. Primarni cilj teh študij je bil določiti kinetiko privzema in iztoka železa iz teh celic ter njihovo modulacijo s PBT434. Model transwell BBB je bil uporabljen tudi za prikaz dvosmernega transceličnega toka PBT434 preko pregrade endotelijskih celic. Model je v molekularnem smislu pokazal, da PBT434 zavira privzem železa s kelacijo, hkrati pa spodbuja iztok železa. Študije slikanja celic kažejo, da PBT434 dostopa do istega labilnega bazena železa, ki ga je sondirala klasična Fe^{2 plus}kelatno sredstvo, 2,2'-bipiridin ali bipiridil, in fluorescentna sonda za železovo železo. Rezultati nakazujejo možen mehanizem delovanja za PBT434, ki vključuje zaviranje privzema sistemskega železa pri BBB in poznejšo sekvestracijo možganskega železa v intersticijskem prostoru.

Rezultati

1. PBT434 nima citotoksičnih učinkov na možganske mikrovaskularne endotelijske celice

Za določitev ustreznega obsega delovnih koncentracij za PBT434 v naši in vitro celični kulturi smo uporabili test MTT za spremljanje mitohondrijske funkcije hBMVEC kot odziva na PBT434. Na podlagi prejšnjih poročil [30] so bili zdravljeni z razponom koncentracij PBT434 do 100 μM 24 ur. Pri nobeni testirani koncentraciji nismo opazili pomembnih sprememb v sposobnosti preživetja hBMVEC (slika 2).

2. PBT434 se hitro absorbira in prenaša prek pregrade hBMVEC

PBT434 je peroralno biološko razpoložljivo zdravilo, ki lahko zlahka prodre skozi BBB, kot je razvidno iz študij, izvedenih na miših in ljudeh [30, 38, 39]. Spremljali smo kopičenje PBT434 v hBMVEC, gojenih v enoslojih, z uporabo PBT434, označenega s 14C, kot radiosledilca. Podatki so pokazali, da se je v prvi fazi 14C-PBT434 hitro uravnotežil med sprejemnim medijem in celico. Temu začetnemu privzemu je sledilo dodatno počasno kopičenje v 3 urah, ki je pokazalo hitrost 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (slika 3A). V protokolu privzema se privzem pogasi in celice se sperejo pri 4˚C pred obdelavo za kopičenje 14C-PBT434 (metode). V ločenem poskusu smo pregledali iztok 14C-PBT434 iz hBMVEC po 30-minutnem obdobju nalaganja. V protokolu efluksa celice speremo pri 25˚C. Podatki na sliki 3B kažejo, da se je pri izpiranju pri 25 °C izgubilo približno 92 odstotkov 14C-PBT434, nabranega v celicah (prim. 550 pmol 14C-PBT434/mg proteina v 3A pri 30 minutah do 43 pmol 14C-PBT434/mg beljakovine pri t=0 v 3B). Prišlo je do nadaljnje počasne izgube preostalega 14C-PBT434 (slika 3B). Podatki kažejo na dva vidika kopičenja in iztoka PBT434 s hBMVEC. Tok skozi plazemsko membrano hitro doseže tisto, kar se zdi ravnotežje, bodisi med privzemom ali izlivom. Vendar pa se v obeh procesih pojavi še en počasnejši proces. To nakazuje, da je znotraj celice del celice PBT434 na lokaciji/stanju, ki je v kinetičnem razmerju v stanju dinamičnega ravnovesja s frakcijo v ravnovesju z zunajceličnim okoljem. Kinetična analiza, prikazana na sliki 3B, je ocenila, da je ta skupek PBT434 predstavljal 27±4 pmol/mg proteina v celičnem lizatu, ko so bile celice obdelane z 20 μM reagentom.

Da bi preučili transcelularni tok PBT434, smo uporabili dobro preverjen in vitro model BBB, pri čemer smo zrasli na apikalni strani transwell membrane [35, 36, 40, 41]. Pregradne lastnosti teh transwell kultur so bile preverjene s kvantifikacijo njihove transendotelne električne upornosti (TEER) in neprepustnosti za dekstran, označen s FITC (Sl. S1). Primerjali smo privzem 14C-PBT434 na luminalni (ali apikalni, krvni strani) (slika 4A) z privzemom na abluminalni (ali bazolateralni, možganski strani) (slika 4C) membrani. V istem poskusu je bil ustrezen iztok (transcelularni tok) kvantificiran s pojavom 14C-PBT434 v iztočni komori (slika 4, plošči B in D). Hitrosti teh procesov so podane v tabeli 1. Podatki o masi, prikazani na sliki 4 (plošči B in D), kažejo, da je bil neto tok PBT434 skozi ta model krvno-možganske pregrade enak v obe smeri. V bazalni komori se je nabralo 976±185 pmol 14C-PBT434 (slika 4B) in kvantificirano 1033±210 pmol v bazalni komori (slika 4D). Ta skorajšnja enakovrednost se je odražala tudi v zelo podobnih stopnjah iztoka PBT434 na obeh pregradnih membranah (tabela 1). Vendar pa je prišlo do znatno večjega privzema PBT434 na bazolateralni membrani v tem pregradnem modelu, kot je prikazano s približno 50-odstotno večjo izgubo spojine iz bazalne komore (slika 4C), kar je ustrezalo približno 40-odstotni večji stopnji navideznega privzema celic. (Tabela 1). Predvideva se, da bo močnejši vnos povzročil večje kopičenje. Analiza celic po 3 urah je pokazala, da so ohranile ~6 μM PBT434 ne glede na smer toka. Vrednosti so bile 8,1 ± 1,3 μM (apikalno do bazalno) in 4,7 ± 1,2 μM (bazalno do apikalno). Kot je navedeno zgoraj, ta analiza sledi izpiranju celic pred lizo in kvantifikacijo celotnega celičnega proteina in 14C-PBT434. Poleg tega je medij v apikalni komori vseboval RPMI plus 10 odstotkov FBS in 10 odstotkov NuSeruma, medtem ko je bazalna, 'možganska' komora vsebovala samo RPMI (metode). Razumen sklep je bil, da je večji "privzem" na bazalni membrani odraz adsorpcije PBT434 na celični površini, ki je bila v apikalni komori omejena s prisotnostjo beljakovinskih komponent v serumu. Po izpiranju celic za kopičenje PBT434 je bil ta adsorbirani material (ki je bil registriran kot "privzem") odstranjen. Ponavljanje tega eksperimenta s pretokom, vendar s serumom v bazalni komori, je pokazalo, da je serum res zavrl to verjetno adsorpcijo PBT434 na celični površini (slika S2).

3. PBT434 za razliko od bipiridila ne omejuje intracelularne razpoložljivosti labilnega železa

Ker ima PBT434 zmernejšo afiniteto za železo v primerjavi s klasičnimi kelatorji železa, kot sta deferipron ali bipiridil, smo preučili, kako se ta razlika odraža v učinku PBT434 na celični labilni železovi bazen (LIP) hBMVEC. Za to smo izkoristili prepustnost, Fe^{2 plus}-specifično fluorescentno barvilo FerroOrange, ki reagira z dobrodelnim citoplazemskim železom. Videli smo znatno ablacijo fluorescence v celicah, ko smo jih zdravili z bipiridilom, kar je skladno s kelacijo LIP s tem kelatorjem železovega železa z visoko afiniteto in tako blokira delovanje fluorescenčnega indikatorja železa (slika 5A). Nasprotno pa PBT434 ni tekmoval s FerroOrange za Fe^{2 plus}, vedenje, ki je skladno z njegovo bolj zmerno afiniteto [30]. Rezultati so pokazali, da je PBT434, ne pa neaktivni derivat PBT434-met, povzročil 34 ± 9-odstotno povečanje železa, dostopnega za FerroOrange^{2 plus}kar nakazuje, da je ta kelator mobiliziral železo v celici brez sočasne toksičnosti. Spodaj predstavljeni podatki nakazujejo, da je železo izviralo iz feritina.

Prej je bilo dokazano, da PBT434 obnavlja osiromašeno ekspresijo proteina feroportina pri miših, zdravljenih z MPTP, na raven, podobno tisti pri miših brez poškodb [30]. Ta rezultat, skupaj s povečanjem znotrajceličnega obarvanja železa z železom kot odziv na PBT434, je nakazal potencialni učinek na sistem odziva na celično železo in delovanje proteinov, povezanih z železom. Da bi to ocenili, smo najprej izvedli kvantitativno PCR (qPCR) analizo učinka PBT434 na številčnost transkriptov za več proteinov, ki delujejo z železom (slika 6). Medtem ko transkripti za protein iztoka železa, feroportin (Fpn), in dva citoplazemska železova spremljevalca, PCBP1 in 2, niso bili prizadeti, je bila številčnost mRNA za transferinski receptor (TfR) in feroksidazo, ceruloplazmin (Cp). sprememba. Prepisi TfR in Cp so se povečali za 2,8 oziroma 3{13}}krat. Ekspresija receptorja za transferin (TfR) je povezana s sistemom elementov, ki se odzivajo na železo (IRE)/regulacijskih proteinov železa (IRP) [42–44]. Povečanje TfR mRNA nakazuje, da PBT434 tekmuje z dostavo železa, ki je odvisna od PCBP1-, za sestavljanje grozda Fe, S, ki pretvori regulatorni IREBP iz proteina, ki veže RNK, v citosolno akonitazo [45]. Tako PBT434 premakne to regulativno modulacijo proti vezavi RNA in ustrezni inhibiciji razgradnje mRNA TfR. Pri pomanjkanju železa v celicah izražanje Cp delno uravnava HIF-1 [46]. Povečanje funkcije HIF-1 izhaja iz zmanjšanja njegove hidroksilacije z aktivnostjo prolil hidroksilaze v reakciji, odvisni od železa [47]. Tako kot v primeru IREBP se zdi, da PBT434 zmanjšuje količino železa, ki služi kot kofaktor pri hidroksilaciji in razgradnji HIF-1. V tem modelu povečanje ravni stabilnega stanja tega transkripcijskega aktivatorja poveča transkripcijo Cp.

S kombinacijo analize ELISA in western blottinga smo testirali izražanje proteinov, ki obdelujejo železo, v hBMVEC, zdravljenem s PBT434 ali PBT434-met; primeri analiz WB so podani na sliki 7A. Podatki so pokazali, da se je številčnost monomera in dimera TfR znatno povečala za 24 ur, prav tako Cp (sliki 7B in 7C). Obe povečanji sta bili vzporedni s PBT434-odvisnim povečanjem ustreznih transkriptov (slika 6). Nasprotno pa je bila ekspresija železovega iztočnega proteina, Fpn, neobčutljiva na zdravljenje s PBT434 (slika 7D).

Uporabili smo ELISA kot dodatno metodo za količinsko opredelitev sprememb gube, ki jih kažejo podatki Western blota. Tako smo hBMVEC 24 ur obdelali s PBT434 in celične lizate testirali z ELISA za TfR (slika 8A). Kratno povečanje TfR kot odziv na zdravljenje s PBT434, kvantificirano z ELISA, je bilo enakovredno tistemu, pridobljenemu z analizo Western blotov (slika 7B). ELISA je bila uporabljena tudi za oceno izločenega in GPI-povezanega proteina Cp, pri čemer so uporabili celice HepG2 kot pozitivno kontrolo. Kar zadeva Cp, izločen v rastne medije, je bil ta pristop omejen, saj je bila številčnost sCp v kondicioniranih medijih HepG2 in hBMVEC na ali pod spodnjo mejo občutljivosti tega testa (S3, slika). Vendar pa je omogočil oceno številčnosti GPI-Cp. Pri tej metodi so celice obdelali s fosfatidilinozitol specifično fosfolipazo C (PI-PLC), ki cepi GPI sidro; tako kondicioniran medij je bil koncentriran in analiziran s Cp-ELISA. Čeprav je ta pristop pokazal, da je PBT434 povečal količino GPI-Cp v celicah HepG2, ponovno ni zaznal nobenega Cp, ki ga je sprostil PI-PLC (slika 8B). ELISA je omogočila tudi neposredno metodo za kvantifikacijo feritina. Da bi to naredili, smo hBMVEC polnili z 1 uM Fe-citratom 24 ur, čemur je sledilo zdravljenje v odsotnosti ali prisotnosti PBT434 dodatno 1 uro. Dobljene celične lizate smo podvrgli ELISA analizi za feritin (slika 8C). V nasprotju s povečanjem TfR je zdravljenje s PBT434 podrlo protein feritina (Ft) za ~18 odstotkov. Dejansko je bila ta izguba Ft proteina očitna že po 1 uri obdelave z reagentom. Časovno naravo tega rezultata je mogoče povezati z zgoraj navedenim povečanjem dobrodelnega Fe2 plus po 30-minutnem zdravljenju s PBT434. Kot je bilo razloženo kasneje, je bilo uničenje feritina dokazano po zdravljenju z drugimi celično permeantnimi Fe2 in kelatnimi sredstvi [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 plus}privzem zavira kompleksiranje s PBT434

Glede na hitro vzpostavitev ravnovesja PBT434 v hBMVEC v 30 minutah v primerjavi s počasnim, dvofaznim prevzemom in uravnoteženjem Fe2 plus v 24 urah [49] smo domnevali, da PBT434 in Fe2 plus nimata enakega mehanizma prevzema. Da bi to preizkusili, smo monosloje inkubirali z radioaktivno označenim 55Fe2 plus v odsotnosti ali prisotnosti PBT434 ali PBT434-met in spremljali privzem 55Fe2 plus v 3 urah (slika 9A). PBT434 je občutno zmanjšal stopnjo privzema 55Fe2 plus, prav tako je zmanjšal skupno kopičenje 55Fe2 plus v celičnih lizatih (slika 9C). Tega učinka pri PBT434-metu niso opazili. Primerjava stopenj privzema PBT434 in 55Fe kaže, da PBT434 in Fe2 plus prevzameta ločeni transportni poti. Poleg tega inhibicija privzema 55Fe v prisotnosti PBT434, ne pa tudi PBT{30}}met, nakazuje, da zunajcelični kompleks železa PBT434- ni ligand za prenašalce železovega železa v hBMVEC, namreč ZIP8 in ZIP14.

Cistanche dodatki

Da bi nadalje preučili vlogo PBT434 pri kopičenju železa, smo preizkusili učinek njegove predizpostavljenosti na privzem 55Fe2 plus. Celice, predhodno obdelane s PBT434, ki so bile po pranju izpostavljene 55Fe2 plus, so po 3 urah pokazale povečanje stopnje privzema in kopičenja 55Fe2 plus (slika 9, plošči B in D). To povečano kopičenje se je ohranilo vsaj 24 ur. Ti podatki kažejo, da predhodna izpostavljenost celic PBT434 začasno poveča privzem železa. Nepričakovano je predhodna obdelava s PBT434-met pokazala tudi povečanje vnosa in kopičenja (slika 9B), vendar ta učinek ni bil tako pomemben ali obstojen kot tisti, ki ga je pokazal PBT434.

Pokazali smo, da je privzem železa iz 59Fe-transferina podprt z redukcijo železa in permeacijo železa na plazemski membrani [50, 51]. Eden od eksperimentalnih rezultatov v podporo temu modelu privzema železa TBI je bila izključitev tega privzema z inhibicijo ekstracitoplazmatske aktivnosti ferireduktaze; drugi rezultat je bila 60-odstotna inhibicija privzema železa pri TBI s ferozinom, močnim kelatnim sredstvom za železovo železo [50]. Ta zadnja strategija je bila uporabljena za dokazovanje, da je PBT434, ne pa PBT434-met, prav tako zaviral privzem železa pri TBI (slika 10).

5. PBT434 stimulira od Fpn odvisen 55Fe2 plus iztok

PBT434 ima približno 20 odstotkov sposobnosti deferiprona, da povzroči očitno stimulacijo Fe2 in iztok iz nevronskih celic [30]. Ocenili smo iztok 55Fe2 plus iz hBMVEC v odsotnosti ali prisotnosti PBT434 v kontrolnih celicah ali celicah, zdravljenih z mini-hepcidinom, PR73. Hepcidin je peptidni hormon, ki ga najdemo tako sistemsko kot v možganskem intersticiju, ki se veže na Fpn in cilja na transporter za razgradnjo. Učinke hepcidina na funkcijo izvoza železa Fpn so obsežno preučevali [52–54]. Prej smo pokazali, da je izliv Fe2 plus iz hBMVEC odvisen od Fpn [35, 49]. PR73 ima EC50 ~4 nM za razgradnjo Fpn v GFP reporter testu [55]. hBMVEC v enoslojih smo naložili s 55Fe2 plus 24 ur v odsotnosti ali prisotnosti PR73. Iztok 55Fe je bil nato kvantificiran v obdobju 5 ur v nadaljnji odsotnosti ali prisotnosti PR73 v kombinaciji z odsotnostjo in prisotnostjo PBT434 (slika 11). Medtem ko je PR73 zmanjšal iztok 55Fe iz kontrolnih kultur in kultur, obdelanih s PBT434-, je PBT434 delno zadušil inhibicijo zaradi minihepcidina. V odsotnosti PBT434 je bil izliv železa iz kultur, obdelanih s PR73-, zmanjšan za ~75 odstotkov, medtem ko je bil knockdown v kulturah, obdelanih s PBT434-, samo ~50 odstotkov (slika 11 in tabela 2). Iz teh rezultatov je mogoče potegniti dva sklepa. Prvič, knockdown Fpn s PR73 zmanjša iztok 55Fe v prisotnosti in odsotnosti PBT434. Drugič, pod katerim koli pogojem PBT434 podpira znatno, čeprav majhno stimulacijo izločanja železa.

Reference

1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Sintetični in naravni kelatorji železa: terapevtski potencial in klinična uporaba. Future Med Chem. 2009; 1(9):1643–70.

2. Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Nove perspektive v terapiji s kelacijo železa za zdravljenje nevrodegenerativnih bolezni. Farmacevtski izdelki (Basel). 2018; 11(4):109.

3. Tosato M, Di Marco V. Terapija s kelacijo kovin in Parkinsonova bolezen: Kritični pregled termodinamike tvorbe kompleksov med ustreznimi kovinskimi ioni in obetavnimi ali uveljavljenimi zdravili. Biomolekule. 2019; 9(7).

4. Hedera P. Posodobitev kliničnega zdravljenja Wilsonove bolezni. Appl Clin Genet. 2017; 10:9–19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Primerjalna učinkovitost in varnost deferoksamina, deferiprona in deferasiroksa pri hudi talasemiji: meta-analiza 16 randomiziranih kontroliranih preskušanj. PLoS One. 2013; 8(12):e82662.

6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalitske kovine, askorbat in prosti radikali: kombinacije, ki se jim je treba izogibati. Radiat Res. 1996; 145 (5): 532–41. PMID: 8619018

7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oksidativni stres: ključni modulator pri nevrodegenerativnih boleznih. Molekule. 2019; 24(8).

8. Ashraf A, Clark M, So PW. Staranje Iron Mana. Sprednja nevrologija staranja. 2018; 10:65.

9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, et al. R2* kartiranje za možgansko železo: povezave s kognicijo pri normalnem staranju. Nevrobiolno staranje. 2015; 36 (2): 925–32.

10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Železo, staranje možganov in nevrodegenerativne motnje. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.

11. Di Meo I, Tiranti V. Klasifikacija in molekularna patogeneza sindromov NBIA. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22 (2): 272–84.

12. Levi S, Finazzi D. Nevrodegeneracija z kopičenjem železa v možganih: posodobitev patogenih mehanizmov. Front Pharmacol. 2014; 5:99–.

13. Levi S, Tiranti V. Nevrodegeneracija z motnjami kopičenja železa v možganih: dragoceni modeli, namenjeni razumevanju patogeneze odlaganja železa. Farmacevtski izdelki (Basel). 2019; 12(1).

14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Nevrodegeneracija s kopičenjem železa v možganih: genetska raznolikost in patofiziološki mehanizmi. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16: 257–79.

15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Nevrodegeneracija z kopičenjem železa v možganih: pregled. Iran J Otroški nevrol. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Modeliranje nevroferitinopatije z matičnimi celicami razkriva železo kot determinanto staranja in feroptoze med staranjem nevronov. Poročila o matičnih celicah. 2019; 13 (5): 832–46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Železo in Alzheimerjeva bolezen: od patogeneze do terapevtskih posledic. Sprednji nevroni. 2018; 12:632.

18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Vloga železa pri Friedreichovi ataksiji: vpogled v študije človeških tkiv ter celičnih in živalskih modelov. Sprednji nevroni. 2019; 13:75.

19. Puschmann A. Novi geni, ki povzročajo dedno Parkinsonovo bolezen ali parkinsonizem. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Ciljanje na presnovo železa pri odkrivanju in dostavi zdravil. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.

21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Razširjenost anemije pri osebah, starih 65 let in več, v Združenih državah: dokazi za visoko stopnjo nepojasnjene anemije. kri. 2004; 104 (8): 2263–8.

22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Zdravljenje z deferasiroksom, deferipronom in desferioksaminom pri večjih bolnikih s talasemijo: srčno železo in primerjava funkcij, določena s kvantitativnim slikanjem z magnetno resonanco. Haematologica. 2011; 96 (1): 41–7.

23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferipron pri Friedreichovi ataksiji: 6--mesečno randomizirano kontrolirano preskušanje. Ann Neurol. 2014; 76 (4): 509–21.

24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Kelacija železa v možganih z deferipronom v 2. fazi randomiziranega, dvojno slepega, s placebom nadzorovanega kliničnega preskušanja pri Parkinsonovi bolezni. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Usmerjanje kelatnega železa kot terapevtskega načina pri Parkinsonovi bolezni. Antioksidni redoks signal. 2014; 21 (2): 195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Urinski presnovni profili 1,2-dimetil- in 1,2-dietil-substituiranih 3-hidroksipiridin-4-onov pri ljudeh in podganah. Presnova in razporeditev zdravil. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferipron: Vseselektivna inhibicijska aktivnost histon lizin demetilaze in študija razmerja med strukturno aktivnostjo. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. Nedavni razvoj osredotočen na oralno aktivne kelatorje železa. Poročila o talasemiji. 2014; 4 (2).

29. Kosman DJ. Presnova železa v aerobih: upravljanje hidrolize železovega železa in avtooksidacije železovega železa. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.

30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. Nova spojina PBT434 preprečuje z železom posredovano nevrodegeneracijo in toksičnost alfa-sinukleina pri več modelih Parkinsonove bolezni. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.

31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, uredniki. PBT434 ohranja dopaminergične nevrone, zmanjšuje oligomerizacijo alfa-sinukleina in izboljšuje motorično funkcijo v modelu transgene mišje atrofije več sistemov. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ ZDA.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Od osnovnih mehanizmov do eksperimentalne terapevtike. Motnja, povezana s parkinsonizmom. 2020; 73: 94–104.

33. Dawson VL, Dawson TM. Obetavne terapije za Parkinsonovo bolezen, ki spreminjajo bolezen. Znanost translacijska medicina. 2019; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Primerjalna študija štirih ovekovečenih endotelijskih celičnih linij kapilar človeških možganov, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 in BB19, in optimizacija pogojev gojenja za in vitro model krvno-možganske pregrade za študije prepustnosti zdravil. Tekočine in ovire CNS. 2013; 10(1):33.

35. McCarthy RC, Kosman DJ. Ceruloplazmin in hepcidin glialnih celic različno uravnavata iztok železa iz možganskih mikrovaskularnih endotelijskih celic. PLoS One. 2014; 9(2):e89003.

36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Nosilca raztopine ZIP8 in ZIP14 uravnavata kopičenje mangana v možganskih mikrovaskularnih endotelijskih celicah in nadzirata ravni mangana v možganih. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.

37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Bakterijska invazija in transcitoza v transficiranih mikrovaskularnih endotelijskih celicah človeških možganov. Mikrobni patogen. 2001; 30 (1): 19–28.

38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Prva študija o PBT434 pri ljudeh, novem majhnem molekularnem zaviralcu agregacije -sinukleina (S4.001). Nevrologija. 2019; 92(15 Dodatek):S4.001.

39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Študija 1. faze o PBT434, novem majhnem molekularnem zaviralcu agregacije -sinukleina, pri odraslih in starejših odraslih prostovoljcih (4871). Nevrologija. 2020; 94(15 Dodatek):4871.

40. McCarthy RC, Kosman DJ. Aktivacija ekspresije ceruloplazmina celic glioblastoma C6 s sosednjimi interlevkini, pridobljenimi iz endotelija človeških možganov, v sistemu modela krvno-možganske pregrade in vitro. Celična komunikacija in signalizacija: CCS. 2014; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP modulira iztok železa iz možganskih mikrovaskularnih endotelijskih celic s stabilizacijo železovega izvoznika železa feroportina. Poročila EMBO. 2014; 15 (7): 809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Regulacija metabolizma železa pri sesalcih. Celica. 2010; 142 (1): 24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Zhou ZD, Tan EK. Signalna pot železovega regulatornega proteina (IRP) - elementa, ki se odziva na železo (IRE) pri nevrodegenerativnih boleznih pri ljudeh. Molekularna nevrodegeneracija. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112

44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Presnova železa v možganih in njene motnje pri nevroloških boleznih. J Neural Transm. 2011; 118 (3): 301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Kompleks spremljevalca PCBP1-BolA2 dovaja železo za sestavljanje citosolnih [2Fe-2S] grozdov. Nat Chem Biol. 2019; 15 (9): 872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Vloga dejavnika, ki ga povzroča hipoksija-1, pri transkripcijski aktivaciji ceruloplazmina zaradi pomanjkanja železa. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.

47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Hidroksilacija beljakovin s hidroksilazami faktorja, induciranega s hipoksijo (HIF): edinstvena ali vseprisotna? Celice. 2019; 8(5).

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. S feroportinom posredovana mobilizacija feritinskega železa je pred razgradnjo feritina s proteasomom. Embo j. 2006; 25 (22): 5396–404.

49. McCarthy RC, Kosman DJ. Feroportin in aktivnost eksocitoplazmatske feroksidaze sta potrebna za iztok železa iz možganskih mikrovaskularnih endotelijskih celic. Revija za biološko kemijo. 2013; 288(24):17932–40.

50. McCarthy RC, Kosman DJ. Mehanska analiza kopičenja železa v endotelijskih celicah BBB. Biokovine. 2012; 25 (4): 665–75.

51. Kosman DJ. Telos metalo-redukcije in metalo-oksidacije v evkariontskem trgovanju z železom in bakrom. Metalomika. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Strukturno-funkcijska analiza feroportina definira vezavno mesto in alternativni mehanizem delovanja hepcidina. kri. 2018; 131 (8): 899–910.

53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin in homeostaza železa. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.

54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. S hepcidinom povzročena endocitoza feroportina je odvisna od ubikvitinacije feroportina. Cell Metab. 2012; 15(6):918–24.

55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Tiol-derivatizirani minihepcidini ohranijo biološko aktivnost. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.

Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Oddelek za biokemijo, Jacobsova šola za medicino in biomedicinske vede, Državna univerza New York v Buffalu, Buffalo, NY, Združene države Amerike