Tretji del DsbA-L sodeluje z VDAC1 pri mitohondrijsko posredovani apoptozi tubularnih celic in prispeva k napredovanju akutne ledvične bolezni

7. Generacija miši PT-VDAC1-KO

Da bi raziskali vlogo VDAC1 pri AKI, smo vzpostavili mišji model, ki prikazuje izločitev VDAC1 v proksimalnih tubulih ledvic. Slika 7a prikazuje protokol razmnoževanja, uporabljen za ustvarjanje PT-VDAC1-KO. RT-PCR smo uporabili za genotip miši PT-VDAC1-KO; to je bilo narejeno z ojačanjem alela floxed 416-bp DNA fragment in 370-bp DNA fragmenta gena Cre (slika 7, b; progi 4 in 6). Miši divjega tipa (PT-VDAC1-WT) niso imele gena Cre (slika 7, b, progi 2 in 3). Imunoblot analiza je pokazala, da so bile ravni izražanja VDAC1 v ledvični skorji miši PTVDAC1-KO nižje od tistih pri miših PTVDAC1-WT po ishemičnem ali lažnem zdravljenju (slika 7 c in d). To je bilo nadalje potrjeno z imunohistokemičnim barvanjem VDAC1 (slika 7e). Ti podatki so potrdili, da smo uspešno vzpostavili model miške PT-VDAC1-KO.

Slika 7. Izdelava in značilnosti modela miške PT-VDAC1-KO. (a, b) Protokol vzreje za generacijo miši PTVDAC1-KO in detekcija PCR genotipa divjega tipa in floksiranih alelov VDAC1 in alela PEPCK-Cre. (c) Imunoblot analiza VDAC1 in b-tubulina z uporabo ledvičnih kortikalnih tkiv miši iz legla PT-VDAC1-KO in PT-VDAC1-WT po poškodbi IR. (d) Analiza sivine slike med njimi. ( e ) Imunohistokemično obarvanje VDAC1 v kortikalnih tkivih ledvic divjega tipa in miši VDAC1 po poškodbi IR. Originalna povečava x 400. Barva brazgotin: 100 µM. Vsak poskus (c & e) je bil neodvisno ponovljen 6-krat s podobnimi rezultati. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena za primerjave več skupin (d). # str<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti o prednostih Cistanche

8. Z I/R povzročena poškodba ledvic, apoptoza tubularnih celic in mitohondrijska poškodba so se izboljšale pri miših PTVDAC1-KO

Sorodniki miši PT-VDAC1-WT in PT-VDAC1-KO so bili zdravljeni z ishemijo (28 min), ki ji je sledila reperfuzijska poškodba (48 h). Nato smo odvzeli vzorce krvi in ​​ledvično tkivo za nadaljnje preiskave. Ugotovili smo, da je PT-VDAC1-KO izrazito zmanjšal z I/R povzročeno zvišanje ravni BUN in kreatinina (slika 8 a in b). Drugič, histološke analize in analize TUNEL so nadalje pokazale, da je PT-VDAC1-KO izrazito oslabil z I/R povzročeno poškodbo tkiva in apoptozo ledvičnih celic (slika 8 c, d, f in g). Tretjič, analize EM so pokazale, da je PT-VDAC1-KO znatno oslabil poškodbe mitohondrijev, ki jih povzroči I/R (slika 8 e in h). Končno je imunobloting potrdil, da so miši PT-VDAC1-KO pokazale zmanjšane ravni razcepljene kaspaze-3, manjše kopičenje Bax v mitohondrijih in nižje stopnje sproščanja Cyt-c v citosol (slika 8 I- o). Ti podatki so pokazali, da je VDAC1 posredoval tudi pri I/R-inducirani AKI.

Slika 8. Oslabitev z IR povzročene ledvične poškodbe, apoptoza tubularnih celic, poškodba mitohondrijev in izražanje Bax, Cyt-c in razcepljene kaspaze3 pri miših PT-VDAC1-KO. Dvostranske ledvične arterije miši iz legla PT-VDAC1-KO in PT-VDAC1-WT so bile stisnjene za 28 minut in nato sproščene za 48 ur, da se vzpostavi IR model. (a) ŽEMLJICA. (b) Kreatinin v serumu. (c) Barvanje s hematoksilinom in eozinom. ( d ) Reprezentativni odseki TUNEL-pozitivnih celic. (e) Zaznavanje morfologije mitohondrijev z elektronskim mikroskopom. (f) Ocena poškodb cevi. (g) Število TUNEL-pozitivnih celic. (h) Ocena poškodbe mitohondrijev. (i) Imunobloti analizirajo ekspresijo razcepljene kaspaze3, VDAC1 in DsbA-L kot tudi ekspresijo BAX in Cyt-c v mitohondrijskih in citosolnih frakcijah. b-tubulin in GAPDH sta bila uporabljena kot kontrola celotnega lizata ali citosolne obremenitve. COX IV je bil uporabljen kot kontrola obremenitve mitohondrijev. (j- p) Analiza sivine slike med njima. Prvotna povečava x 400. Vrstica brazgotin: 100 µM v c & d 20 µM v e. Vsak poskus (c-e&i) je bil neodvisno ponovljen 6-krat s podobnimi rezultati. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena za primerjave več skupin (a, b, f-h&j-p). # str<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. Prekomerna ekspresija DsbA-L poslabšane poškodbe ledvic, ki jo povzroči I/R, je bila oslabljena pri miših PT-VDAC1-KO

DsbA-L med ishemično poškodbo. En teden preden je bil vzpostavljen mišji model IR, smo v repno veno vsake miši injicirali plazmid DsbA-L (injekcija je bila izvedena dvakrat v tem tednu). Prekomerna ekspresija DsbA-L je poslabšala z IR povzročeno zvišanje izražanja BUN in kreatinina, poškodbo ledvic in ledvično apoptozo; ti učinki so bili oslabljeni pri miših PTVDAC1-KO (slika 9 a-d, e in f). Rezultati imunoblota so nadalje pokazali, da je čezmerna ekspresija DsbA-L povečala z IR povzročeno povečanje razcepljene kaspaze-3, kopičenje Bax v mitohondrijih in sproščanje Cyt-c v citosol; ti učinki so bili zmanjšani pri miših PT-VDAC1-KO (slika 9 g in h-l). Skupaj so ti rezultati nadalje pokazali, da je VDAC1 posredoval učinek DsbA-L med ishemično poškodbo.

Slika 9. Prekomerna ekspresija DsbA-L poslabšane poškodbe ledvic, ki jo povzroči I/R, je bila oslabljena pri miših PT-VDAC1-KO. Miši PT-VDAC1-KO in PT-DsbA-L-WT smo zdravili z ali brez DsbA-L plazmida in nato vzpostavili IR model. (a)BUN. (b) Kreatinin v serumu. (c) Barvanje s hematoksilinom in eozinom. ( d ) Reprezentativni odseki TUNEL-pozitivnih celic. (e) Ocena poškodb tubulov. (f) Število TUNEL-pozitivnih celic. ( g ) Imunobloti so analizirali ekspresijo razcepljene kaspaze3, VDAC1 in DsbA-L kot tudi ekspresijo BAX in Cyt-c v mitohondrijskih in citosolnih frakcijah. b-tubulin in GAPDH sta bila uporabljena kot kontrola celotnega lizata ali citosolne obremenitve. COX IV je bil uporabljen kot kontrola obremenitve mitohondrijev. (h- n) Analiza sivine slike med njima. Originalna povečava x 400. Barva brazgotin: 100 mM. Vsak poskus (c-e) je bil neodvisno ponovljen 6-krat s podobnimi rezultati. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena za primerjave več skupin (a, b in f-n). # str<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Cistanche dodatek

10. Oslabitev ledvične poškodbe, ki jo povzroči I/R, pri miših PTDsbA-L-KO je bila zmanjšana s prekomerno ekspresijo VDAC1

Za nadaljnjo potrditev, ali je tubularna poškodba, ki jo povzroča DsbA-L, odvisna od VDAC1, so bile miši iz legla PTDsbA-L -WT in PT-DsbA-L -KO miši najprej izpostavljene zdravljenju z I/R in nato injicirane preko repne vene s prekomerno ekspresijskim plazmidom VDAC1. I/R-inducirano povečanje ravni BUN in kreatinina je bilo izboljšano pri miših PT-DsbA-L-KO; vendar je ta učinek preprečila čezmerna ekspresija VDAC1 (slika 10 a in b). Barvanje s HE in TUNEL je pokazalo, da so bili relativni obsegi z IR povzročene poškodbe ledvičnega tkiva in apoptoze ledvičnih celic zmanjšani pri miših PT-DsbAL-KO in da je te učinke blokirala prekomerna ekspresija VDAC1 (slika 10 c-f). Imunobloting je pokazal, da so imele miši PT-DsbA-L-KO nižje ravni razcepljene kaspaze-3, nižje ravni kopičenja Bax v mitohondrijih in nižje stopnje sproščanja Cyt-c v citosol; vendar so bili ti učinki odpravljeni s prekomerno ekspresijo VDAC1 (slika 10 g-m). Ti podatki so podprli dejstvo, da je DsbA-L spodbujal ishemično poškodbo na način, ki je bil odvisen od VDAC1.

Slika 10. PT-DsbA-L-KO izboljšana z IR povzročena poškodba ledvic pri miših je bila zmanjšana s prekomerno ekspresijo VDAC1. Miši PT-DsbA-L-KO in PT-DsbA-L-WT smo zdravili z ali brez VDAC1 plazmida in nato vzpostavili IR model. (a) ŽEMLJICA. (b) Kreatinin v serumu. (c) Barvanje s hematoksilinom in eozinom. ( d ) Reprezentativni odseki TUNEL-pozitivnih celic. (e) Ocena poškodb tubulov. (f) Število TUNEL-pozitivnih celic. ( g ) Imunobloti so analizirali ekspresijo razcepljene kaspaze3, VDAC1 in DsbA-L kot tudi ekspresijo BAX in Cyt-c v mitohondrijskih in citosolnih frakcijah. b-tubulin in GAPDH sta bila uporabljena kot kontrola celotnega lizata ali citosolne obremenitve. COX IV je bil uporabljen kot kontrola obremenitve mitohondrijev. (hm) Analiza sivine slike med njima. Originalna povečava x 400. Barva brazgotin: 100 mM. Vsak poskus (c, d in g) je bil neodvisno ponovljen 6-krat s podobnimi rezultati. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena za primerjave več skupin (a, b, e, f in h-m). # str<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. S CLP povzročena ledvična poškodba je bila oslabljena pri miših PT-DsbA-LKO ali PT-VDAC1-KO

S sepso povzročeno AKI je še en pogost vzrok AKI v klinični praksi. Sorodniki iz legla PT-DsbA-L ali VDAC-WT in PT-DsbA-L ali VDAC1-KO so bili izpostavljeni modelu CLP in nato evtanazirani 18 ur po operaciji. Rezultati so pokazali, da so miši PT-DsbA-L ali VDAC1- KO izrazito zmanjšale s CLP povzročena zvišanja ravni BUN in kreatinina ter povečane ravni poškodb ledvičnega tkiva in apoptoze ledvičnih celic (sliki S1 in S2 a-f ). Imunobloting je potrdil, da so miši PTDsbA-L ali VDAC1-KO pokazale tudi zmanjšane ravni razcepljene kaspaze-3, nižje ravni kopičenja Bax v mitohondrijih in nižje stopnje sproščanja Cyt-c v citosol (slike S1 in S2 g- n). Skupaj so ti podatki pokazali, da sta DsbA-L in VDAC1 posredovala pri napredovanju septičnega AKI.

12. Z VAN povzročena ledvična poškodba je bila oslabljena pri miših PT-DsbAL-KO ali PT-VDAC1-KO

AKI, ki jo povzroča vankomicin (VAN), je prav tako pomemben model za AKI. Sorodnikom iz legla PT- DsbA-L ali VDAC1-WT in PT-DsbA-L ali VDAC1-KO je bil intraperitonealno injiciran VAN (600 mg/kg) 7 zaporednih dni. Rezultati so pokazali, da so miši PT-DsbA-L ali VDAC1-KO izrazito zmanjšale z VAN povzročeno zvišanje ravni BUN in kreatinina, poškodbe ledvičnega tkiva in apoptozo ledvičnih celic (sliki S3 in S4 an-f). Imunoblot analize so dodatno potrdile, da so miši PTDsbA-L ali VDAC1-KO pokazale tudi zmanjšane ravni razcepljene kaspaze-3, manjši obseg kopičenja Bax v mitohondrijih in nižje stopnje sproščanja Cyt-c v citosol (sliki S3 in S4 g-m). Če povzamemo, ti podatki so pokazali, da sta DsbA-L in VDAC1 posredovala AKI, ki jo povzroča VAN.

Izvleček Cistanche

13. Apoptoza celic HK-2, posredovana z I/R, posredovana z DsbA-L, je bila povezana z VDAC1

Zgornji rezultat je pokazal, da je bil DsbA-L vključen v apoptozo celic BUMPT, vendar funkcija DsbA v človeških ledvičnih tubularnih celicah ostaja nejasna. DsbA-L siRNA je bila transficirana v celice HK2 in nato izpostavljena izčrpavanju ATP za 2 uri in okrevanju za 2 uri. Rezultati imunoblota so pokazali, da je siRNA DsbA-L opazno izboljšala z I/R povzročeno povečanje ekspresije razcepljene kaspaze-3 in VDAC1, povečano kopičenje Bax v mitohondrijih in povečano proizvodnjo Cyt-c v citosol ( Slika S5 an-h). Podatki tudi kažejo, da je bila vloga DsbA-L pri apoptozi celic HK2 povezana z VDAC1 med zdravljenjem z I/R.

14. Apoptoza celic HK-2, posredovana z DsbA-L, povzročena z I/R, je odvisna od VDAC1

Za nadaljnje preverjanje, ali je vloga DsbA-L pri apoptozi celic HK2 odvisna od VDAC1. Najprej so bile celice HK2 sotransficirane z DsbA-L siRNA plus z ali brez VDAC1 plazmida in nato izpostavljene izčrpanosti ATP za 2 uri in okrevanju za 2 uri. Rezultati imunoblota so pokazali, da je siRNA DsbA-L izrazito oslabila z I/R povzročeno povečanje izražanja razcepljene kaspaze-3 in VDAC1, povečano kopičenje Bax v mitohondrijih in povečano proizvodnjo Cyt-c v citosolu, ta učinek je bil obrnjen s prekomerno ekspresijo plazmida VDAC1 (slika S6a-h). Drugič, celice HK2 so bile sotransficirane z VDAC1 siRNA plus z ali brez DsbA-L plazmida in nato izpostavljene I (2 h) / R (2 h). Rezultati imunoblota so pokazali, da je siRNA VDAC1 opazno izboljšala z I/R povzročeno povečanje izražanja razcepljene kaspaze-3 in VDAC1, povečano kopičenje Bax v mitohondrijih in povečano proizvodnjo Cyt-c v citosolu, ta učinek ni bil povečan s prekomerno ekspresijo plazmida DsbA-L (slika S7a-h). Podatki so jasno potrdili, da je VDAC1 med zdravljenjem z I/R posredoval pri pro-apoptozni vlogi DsbA-L v celicah HK-2.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h in Dongshan Zhang a,b *

Oddelek za nujno medicino, Ljudska republika Kitajska

b Inštitut za nujno medicino in težke bolezni, Druga bolnišnica Xiangya, Central South University, Changsha, Hunan 410011, Ljudska republika Kitajska

c Oddelek za oftalmologijo, Ljudska republika Kitajska

d Oddelek za urinsko kirurgijo, Ljudska republika Kitajska

e Oddelek za prsno kirurgijo, Ljudska republika Kitajska

f Oddelek za splošno kirurgijo, druga bolnišnica Xiangya, Ljudska republika Kitajska

g Oddelek za javno zdravje, Central South University, Changsha, Hunan, Ljudska republika Kitajska

h Oddelek za endokrinologijo, Ljudska bolnišnica Shenzhen, Druga klinična medicinska fakulteta Univerze Jinan, Prva pridružena bolnišnica Južne univerze za znanost in tehnologijo, Shenzhen, Ljudska republika Kitajska

1 Xiaozhou Li in Jian Pan sta enako prispevala k tej študiji