PGC-1 zavira vnetje NLRP3 z ohranjanjem viabilnosti mitohondrijev za zaščito fibroze ledvic
Dec 15, 2023
UVOD
Kronična ledvična bolezen(CKD) je svetovni zdravstveni problem in njegova razširjenost narašča po vsem svetu [1–3].Bolniki s kronično ledvično boleznijopovečano tveganje za napredovanje do končne ledvične bolezni in umrljivosti [4, 5]. Zato je pomembno najti učinkovite terapevtske cilje za preprečevanjenapredovanje kronične ledvične bolezni. Ledvični tubulointersticijskivnetja in fibrozeso ključni patološki znaki vnapredovanje kronične ledvične bolezni[6–8]. Epitelijske celice ledvičnih tubulov(RTEC) so bistveni za vzdrževanje homeostaze tekočin in elektrolitov in predstavljajo 90 % mase ledvic. RTEC zagotavljajo obilo mitohondrijev in imajo visoko raven receptorja, aktiviranega s peroksizomalnim proliferatorjem (PPAR) in koaktivatorja peroksizomskega proliferatorja-1 (PGC-1), da izpolnijo svoje presnovne in funkcionalne potrebe po energiji [9]. Vse več dokazov kaže, da disfunkcija mitohondrijev, za katero je značilno zmanjšanje števila ter depolarizacija, otekanje in motnje krist, močno prispeva k fibrozi ledvic [10, 11]. Poškodovani mitohondriji ne proizvajajo učinkovito adenozin trifosfata (ATP) in sproščajo prekomernoreaktivne kisikove spojine(ROS) in mitohondrijske DNA (mtDNA), ki posledično sprožijo vnetne odzive navzdol in povzročijo celično smrt in poškodbo tubulov.
NOD-podobna receptorska družina-pirinska domena, ki vsebuje 3 (NLRP3), je vključena v različne prirojene imunske odzive gostitelja na mikrobne in nemikrobne dražljaje [12, 13]. Številni patogeni in endogeni signali nevarnosti, ki se sproščajo iz poškodovanih in umirajočih celic, aktivirajo NLRP3 in vodijo do tvorbe proteinskega kompleksa, imenovanega "inflammasome" [14]. Inflamasom NLRP3 nato inducira samodejno obdelavo in aktivacijo kaspaze-1, kar ima za posledico cepitev procitokinov v zrela IL-1 in IL-18. V zadnjem času je bil inflammasom NLRP3 vpleten v patogenezo poškodbe ledvic in fibroze [15–17]. V različnih živalskih modelih bolezni ledvic se aktivira vnetna pot NLRP3 in njeni končni produkti, IL-1 in IL-18, lahko povzročijo poškodbo ledvičnih tubulov [16–19]. Zanimivo je, da ledvične intrinzične celice, kot so RTEC in podociti, izražajo NLRP3, kar kaže na potencialno vlogo signalizacije inflamasoma NLRP3 pri celični poškodbi [20, 21]. Poleg tega so nedavne študije pokazale potencialno interakcijo med mitohondrijsko disfunkcijo in aktivacijo inflamasoma NLRP3 v modelih poškodb ledvičnih tubulov [22–24]. Vendar pa ni znano, ali lahko PGC-1, ključni regulator mitohondrijske biogeneze, uravnava pot NLRP3 z modulacijo mitohondrijske dinamike.
Tako smo raziskali vlogo PGC-1 pri regulaciji aktivacije inflamasoma NLRP3 v RTEC. Zlasti smo preučili, ali lahko spremenjena sposobnost preživetja in dinamika mitohondrijev, povzročena z aktivacijo ali supresijo PGC-1, uravnava vnetno pot NLRP3 in takovpliva na poškodbo ledvic.
Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Trgovina za več podrobnosti o specifikacijah:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
PRIDOBITE NARAVNI ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 25 % EHINAKOZIDA IN 9 % AKTEOZIDA ZA OKUŽBO LEDVIC
METODE
Celične kulture, obdelava aktivatorja TGF- 1, PGC-1 in transfekcija v primarne RTEC RTEC so izolirali iz miši C57BL/6. Jedrnata metoda je opisana v Dodatnih metodah. Subkonfluentne RTEC so bile 24 ur omejene s FBS, nato pa je bil medij nadomeščen z 1 % medijem FBS DMEM za kontrolno skupino in istim medijem s TGF- 1 (5 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN , ZDA) za skupino TGF- 1. RTEC so bili pobrani za analizo RNA in beljakovin 48 ur po spremembi medija. PGC-1 aktivator, metformin (1 mM) je bil zdravljen tako za kontrolno kot za TGF- 1 skupino. Odmerke zdravil smo določili na podlagi naših predhodnih testov. Poleg tega so bile celice transficirane tudi s plazmidom Ppargc1a (1 ug) (Addgene, Cambridge, MA, ZDA) in Ppargc1a majhno motečo RNA (siRNA) z uporabo reagentov Lipofectamine 2000 in Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Nato, 6 ur po transfekciji, smo medij spremenili v medij brez seruma in celice inkubirali dodatnih 48 ur. Za zaviranje ekspresije Drp1 zrušimo gen Drp1 z lentivirusom, ki vsebuje Drp1 in cilja na kratko ostrino RNA (shRNA), da okužimo RTEC (prijazno darilo dr. Yu J, Yonsei University College of Medicine) [25]. Za nadaljnje raziskovanje razmerja med vnetjem NLRP3 in mitohondrijsko poškodbo smo pridobili tudi RTEC iz izločenih miši Nlrp3 (prijazno podaril dr. Yu J, Yonsei University College of Medicine).
Preučevanje in zdravljenje živali
Samci miši C57BL/6 (stari 6 tednov, začetna teža 20 g) so bili kupljeni pri The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, ZDA). Živali so vzdrževali v sobi z nadzorovano temperaturo (22 stopinj) v 12-urnem ciklu svetloba/tema. Vse živali so bile naključno razporejene. En teden po prihodu so bile živali razdeljene v dve skupini in do 4 tedne hranjene z običajno dieto (ND; n=10) ali 0,2-odstotno dieto z adeninom (Ade; n=10). Obe skupini ND in Ade sta bili tudi dnevno zdravljeni z intraperitonealno injekcijo metformina (250 mg/kg), en teden pred začetkom diete. Po 4 tednih ND ali Ade so bile živali žrtvovane in ledvice ekstrahirane med anestezijo z Zoletilom (10 mg/kg) (Virbac, Carros, Francija). Jedrnata metoda za pripravo miši z enostransko obstrukcijo sečevodov (UUO) je opisana v dopolnilnih metodah. Vzorce ledvic smo nato takoj zamrznili v tekočem dušiku in do uporabe shranili pri –80 stopinjah.
Kvantitativna verižna reakcija polimeraze v realnem času, Western blot analize
Ravni transkriptov genov, vključno s Ppargc1a, vnetno potjo NLRP3, mitohondrijsko dinamiko, proteinom 3, ki ga povzroča faktor tumorske nekroze (TNFAIP3), markerjem oksidativnega stresa in profibrotičnimi markerji, so primerjali s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR). Sekvence primerjev, uporabljene v tej študiji, so bile opisane v dodatni tabeli 1. Podrobnejše metode so opisane v dodatnih metodah. Ravni izražanja beljakovin PGC-1, vnetne poti NLRP3, TNFAIP3, markerja oksidativnega stresa in profibrotičnih markerjev so pregledali z analizami Western blot. Podrobne metode in informacije o protitelesih so ločeno opisane v Dopolnilnih metodah.
Test sestavljanja inflamasoma NLRP3
Za določitev oligomerizacije z apoptozo povezanega pegastega proteina, ki vsebuje kaspazno rekrutacijsko domeno (ASC), je bil izveden test navzkrižnega povezovanja, posredovan z disukcinimidil suberatom (DSS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA), kot je opisano prej [26]. Na kratko, RTECS in celice iz vzorcev ledvičnega tkiva so bile peletirane s centrifugiranjem in lizirane v 0.5 ml liznega pufra, ki je vseboval 20 mM Hepes KOH, pH 7,5, 150 mM KCl, 1 % NP40, 0,1 mM PMSF in koktajl inhibitorja proteaze na ledu. Celične lizate centrifugiramo pri 6000 obratih na minuto pri 4 stopinjah 10 minut. Pelete smo dvakrat sprali s PBS in nato resuspendirali v 500 µl PBS. Resuspendirane pelete smo zamrežili s svežim DSS (2 mM) 30 minut in nato peletirali s centrifugiranjem pri 6000 rpm 10 minut. Premrežene pelete smo resuspendirali v 30 µl SDS vzorčnega pufra in frakcionirali na 12 % SDS poliakrilamidnem gelu, čemur je sledilo imunoblotiranje z ASC protitelesom (Cell Signaling Technology, MA, ZDA).
Merjenje ravni oksidativnega stresa
Ravni oksidativnega stresa (malondialdehid [MDA]) so bile izmerjene v RTEC in ledvičnih tkivih z uporabo kompleta za testiranje MDA (Abcam, Cambridge, MA, ZDA). 10 mg RTEC smo homogenizirali na ledu v 300 ul pufra za lizo MDA (Abcam, Cambridge, MA, ZDA), nato centrifugirali (13, 000 × g, 10 min), da smo odstranili netopne materiale. 10 ml plazme smo mešali s 500 ul 42 mM H2SO4 in 125 ul raztopine fosfovolframove kisline pri sobni temperaturi 5 minut. Po centrifugiranju (13,000 × g, 3 min) smo pelet resuspendirali na ledu s 100 ul dvakrat destilirane H2O. Nato smo 200 ul raztopine in 600 ul raztopine 2-tiobarbiturne kisline inkubirali pri 95 stopinjah 60 minut, preden smo jih ohladili na sobno temperaturo v ledeni kopeli 10 minut. Intenzivnost absorbance pri 532 nm je bila sorazmerna z nivojem MDA.
Izolacija mitohondrijev
RTEC so frakcionirali v citosol in mitohondrije z uporabo kompleta za izolacijo mitohondrijev (BioVision, Inc. CA, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca. Skratka, celice smo zbrali in sprali z 1 0 ml ledeno mrzlega PBS. Celice smo centrifugirali pri 600 × g 5 minut pri 4 stopinjah in resuspendirali v 1,0 ml 1 × citosolnega ekstrakcijskega pufra. Homogenizacijo smo izvedli na ledu in centrifugirali pri 1200 × g 10 minut pri 4 stopinjah, da smo odstranili jedra in nedotaknjene celice. Zbrani supernatant smo centrifugirali pri 10, 000 × g 30 minut pri 4 stopinjah. Nastale pelete smo resuspendirali v 1,0 ml 1 × citosolnega ekstrakcijskega pufra in centrifugirali pri 10, 000 × g 30 minut pri 4 stopinjah, da smo dobili mitohondrije. Dobljene mitohondrije smo lizirali v 30 ul pufra za mitohondrijsko lizo in dodali k 100 ul mešanice encimov (vključeno v izolacijski komplet) s 100 ul absolutnega etanola. Po centrifugiranju je nastala peleta mtDNA. Citosolno mtDNA smo pridobili iz supernatanta po obarjanju z etanolom. Koncentracijo mtDNA smo določili s testom qPCR.
Ocena dinamike in delovanja mitohondrijev
Za vizualizacijo mitohondrijske dinamike je bilo uporabljeno imunofluorescentno barvanje za mitohondrije, MitoTracker Deep Red (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). RTEC so bili fiksirani v 4 % paraformaldehidu in blokirani v DPBS, ki je vseboval 5 % normalnega kunčjega seruma in 0.1% Tween- 20. Celice smo nato obarvali s protitelesi proti miši NLRP3, MitoTracker, ki so mu sledila AlexaFluor594-konjugirana kozja protitelesa proti kuncem (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) in končno stekelca namestili z DAPI in slikali. Nato smo pregledali mitohondrijsko strukturo s standardno transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Primarni RTEC so bili čez noč fiksirani z mešanico 2% paraformaldehida in 2,5% glutaraldehida, oprani, dehidrirani in vstavljeni v smolo v skladu s standardnimi postopki. Mitohondrije smo pregledali pod mikroskopom JEOL 1011 (JEOL, Tokio, Japonska). Za oceno hitrosti mitohondrijske respiracije je bil uporabljen analizator zunajceličnega toka Seahorse Bioscience × 24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, ZDA). Za merjenje proizvodnje mitohondrijskih ROS smo celice po ustreznih obdelavah resuspendirali v Hankovi uravnoteženi raztopini soli in 20 minut obarvali z MitoSOX (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) pri 37 stopinjah. Fluorescenco celic smo izmerili s pretočnim citometrom (FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA). Za testiranje potenciala mitohondrijske membrane je bil uporabljen tetrametilrodamin etil ester (TMRE) Mitochondrial Membrane Assay Kit (Abcam, Cambridge, MA, ZDA).
REZULTATI
Spremembe PGC-1, mitohondrijske dinamike in vnetne poti NLRP3 med poškodbo ledvic Najprej smo pregledali izražanje PGC-1, mitohondrijske dinamike in poti NLRP3 v RTEC, zdravljenih s TGF- 1 . V teh celicah je zdravljenje s TGF- 1 zmanjšalo raven transkriptov in beljakovin Ppargc1a (sl. 1A, B in dopolnilna slika 1A). V skladu s tem so bile ravni izražanja mRNA mitofusina (Mfn), gena, povezanega z mitohondrijsko fuzijo, in mitohondrijskega transkripcijskega faktorja A (Tfam), ki predstavlja mitohondrijsko maso, znatno zmanjšane, medtem ko se je raven izražanja dinamina povezanega proteina 1 (Drp1), mitohondrijskega gena, povezanega s fisijo, se je povečalo v primerjavi s kontrolo (slika 1C). Poleg tega je zdravljenje s TGF- 1 aktiviralo signalizacijo inflamasoma NLRP3, kar dokazujejo povečane ravni izražanja genov in proteinov, povezanih s potjo vnetja NLRP3 (sl. 1D, E in dopolnilna slika 1B). Koncentracije IL-1 in IL-18, končnih produktov poti NLRP3, v celičnih lizatih, obdelanih s TGF- 1-, izmerjene z ELISA, so bile povečane (slika 1F). Poleg tega so se povečali tudi nivoji izražanja fibrotičnih markerjev, vključno s fibronektinom in kolagenom 1, ter indeks apoptotične celične smrti razmerja Bax/bcl-2 in razcepljene kaspaze-3 (sl. 1G, H in dopolnilna slika 1C ). Te ugotovitve so bile podobne pri modelu poškodbe ledvic, ki jo povzroča adenin (sl. 2A–H in dopolnilna slika 1D–F). Tako med poškodbo ledvic pride do pomembnih sprememb v izražanju PGC-1 in mitohondrijski dinamiki, skupaj z aktivacijo vnetne poti NLRP3.
Slika 1 Spremembe PGC-1, mitohondrijske dinamike in vnetne poti NLRP3 v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-. Stopnje ekspresije mRNA in proteina B za PGC-1 so se zmanjšale v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-. Izražanje C mRNA genov, povezanih z mitohondrijsko dinamiko, vključno z Mfn, Tfam in Drp1, je bilo spremenjeno v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-. Raven izražanja mRNA D in proteina E vnetne poti NLRP3 je bila povečana v RTEC, zdravljenih s TGF{{10}}. F Koncentracije IL-1 in IL-18, ocenjene z ELISA, so bile povečane v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-. Ravni ekspresije G mRNA in proteina H fibrotičnih markerjev, vključno s fibronektinom in kolagenom 1, ter markerjev apoptotične celične smrti Bax/bcl-2 in razcepljene kaspaze-3 so bile povečane v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-. Opomba: *P < 0,05 v primerjavi s kontrolo. PGC-1 peroksisomski proliferator-koaktivator-1 ; NLRP3 NOD-podobna družina receptorjev, 3, ki vsebuje domeno pirina; ASC, z apoptozo povezan pegasti protein, ki vsebuje domeno rekrutiranja kaspaze; RTEC ledvične tubularne epitelne celice; Mfn mitofuzin; Tfam mitohondrijski transkripcijski faktor A; Drp1 dinaminu soroden protein 1; ELISA encimski imunski test.
PGC-1 obnovi oslabljeno mitohondrijsko dinamiko in morfologijo med poškodbo ledvic
Nato smo preverili, ali lahko PGC-1, ključni regulator mitohondrijske biogeneze, zmanjša mitohondrijsko dinamiko med poškodbo ledvic. Za modulacijo izražanja Ppargc1 smo dodatno uporabili plazmid Ppargc1a, siRNA proti Ppargc1 (siPGC-1) in metformin, posredni aktivator PGC-1. Kot je bilo pričakovano, so bili oslabljeni geni, povezani z mitohondrijsko dinamiko, obnovljeni s prekomerno ekspresijo Ppargc1. V nasprotju s tem je knock-down Ppargc1a s siPGC-1 zmanjšal izražanje Mfn in Tfam, vendar je povečal izražanje Drp1 (sl. 3A–C in dopolnilna slika 2A, B). Te ugotovitve so potrdili dodatni poskusi z metforminom (slika 3D–F in dopolnilna slika 2C, D). Takšne izboljšave so privedle do okrevanja mitohondrijske funkcije. Obnovitev PGC-1 s plazmidom Ppargc1a in metforminom je znatno izboljšala zmanjšan potencial mitohondrijske membrane in zmanjšano stopnjo porabe kisika v RTEC, zdravljenih s TGF- 1 (dodatna slika 3A–D). V skladu s spremembami v PGC-1 se je izražanje fosfo-AMP-aktivirane proteinske kinaze (p-AMPK) zmanjšalo v celicah, zdravljenih s TGF- -, medtem ko je zdravljenje z metforminom obnovilo to izražanje (sl. 3F in Dodatna slika 2E). Vendar pa metformin ni povečal ravni ekspresije mRNA in beljakovin PGC-1 v RTEC z utišanjem Ppargc1a. Te ugotovitve kažejo, da AMPK posreduje učinek metformina, PGC-1 pa je spodnji efektor AMPK (dodatna slika 2F, G, J). Koristni učinki metformina na mitohondrijsko dinamiko so bili prav tako razveljavljeni z utišanjem Ppargc1a (dopolnilna slika 2H–J). In vivo je zdravljenje z metforminom obnovilo tudi raven transkripta Ppargc1 in obrnilo spremenjeno izražanje genov, povezanih z mitohondrijsko dinamiko, pri miših, hranjenih z adeninom, in miših UUO (slika 3G–I in dopolnilna slika 2K, L, 4A–E). Aktivnost AMPK z metforminom je bila potrjena tudi in vitro v modelu, hranjenem z adeninom (slika 3I in dopolnilna slika 2M). Elektronski mikroskopski pregled je potrdil tudi izgubo celovitosti mitohondrijev v RTEC miši, hranjenih z adeninom, in miši UUO. Vendar jih je metformin znatno izboljšal (slika 3J in dopolnilna slika 4F). Te ugotovitve kažejo, da PGC-1 obnovi oslabljeno dinamiko, morfologijo in funkcije v mitohondrijih med poškodbo ledvic.
Poškodbe mitohondrijev lahko povzročijo smrt ledvičnih celic in fibrozo. Opazili smo povišane ravni izražanja fibrotičnih markerjev, vključno s fibronektinom in kolagenom 1, ter indeks apoptotične celične smrti razmerja Bax/bcl-2 in razcepljene kaspaze-3 v RTEC po zdravljenju s TGF- 1. Te povečane ekspresije markerjev celične smrti so bile oslabljene s prekomerno ekspresijo PGC-1 in metformina, medtem ko so se poslabšale s siPGC-1 (sl. 4A–D in dopolnilna slika 5A, B). V skladu s temi ugotovitvami so se ravni ekspresije fibrotičnih markerjev in indeks apoptotične celične smrti znatno povečali pri miših, hranjenih z adeninom, in miših UUO. V nasprotju s tem je metformin obrnil vse te izraze (sl. 4E, F in dopolnilna slika 5C, 6A, B). Massonovo trikromno barvanje je potrdilo tudi izboljšano fibrozo z metforminom (slika 4G). Zlasti povečane označevalce celične smrti in signalizacijo NLRP3 v RTEC, zdravljenih s TGF-, je obrnil Z-Asp-2,6- diklorobenzoiloksimetilketon (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, ZDA), pan-kaspaza zaviralec, kar kaže, da je poškodba, ki jo povzroči TGF- -, verjetno posredovana s poškodbo mitohondrijev in zgodnjo apoptozo (dodatna slika 7A–D). Te ugotovitve skupaj kažejo, da aktivacija PGC-1 zmanjša poškodbe mitohondrijev ter zmanjša celično smrt in fibrozo ledvic.
PGC-1 modulira
Inflammasomska signalna pot NLRP3 Nato smo nadalje raziskali razmerje med vnetno potjo PGC-1 in NLRP3 pri posredovanju poškodbe ledvic. Ko je bila čezmerna ekspresija PGC-1 inducirana s transfekcijo plazmida Ppargc1a, so se ravni izražanja NLRP3, ASC, IL-1 in IL-18 zmanjšale v RTEC, obdelanih s TGF- 1- ( sl. 5A, B in dopolnilna slika 8A). Koncentracije IL-1 in IL-18 v celičnih lizatih, obdelanih s TGF- 1-, izmerjene z ELISA, so se prav tako zmanjšale po transfekciji plazmida Ppargc1a (slika 5C). Zdravljenje z metforminom je dalo podobno ugotovitev (slika 5D, E in dopolnilna slika 8B). Vendar pa je knock-down Ppargc1a povzročil povišane ravni ekspresije genov in proteinov, povezanih z inflamasomsko potjo NLRP3 (sl. 5A, B in dopolnilna slika 8A). Poleg tega je bila aktivacija vnetne signalne poti NLRP3 pri miših, hranjenih z adeninom in UUO, sočasno zmanjšana z metforminom (sl. 5F, G in dopolnilna slika 6C, D, 8C). Koncentracije IL-1 in IL-18 v RTEC in lizatih ledvičnega tkiva so bile znatno znižane z zdravljenjem z metforminom, izmerjeno z ELISA (slika 5H).
Glede na sposobnost PGC-1, da uravnava mitohondrijsko dinamiko, smo nato testirali vlogo Drp1 pri aktivaciji inflamasoma NLRP3. Inflammasomsko signaliziranje NLRP3 je bilo znatno zmanjšano z uničenjem Drp1. Vendar se v RTEC z obema knockdownoma Ppargc1a in Drp1 ravni izražanja vnetnih komponent NLRP3 niso zmanjšale v primerjavi s tistimi v celicah, zdravljenih s TGF- 1-. V RTEC s prekomerno ekspresijo Ppargc1a in knock-downom Drp1 je bilo signaliziranje vnetja NLRP3 manj aktivirano (dodatna slika 9A, B). Te ugotovitve kažejo, da lahko Drp1 delno posreduje aktivacijo inflamasoma NLRP3, vendar so druga dejanja PGC-1 vključena v regulacijo signalne poti NLRP3.
Nadalje smo preučili, ali obstaja povratni signal iz inflamasoma NLRP3. V ta namen smo pridobili RTEC s primarno kulturo iz izločenih miši Nlrp3. V teh celicah, zdravljenih s TGF - 1, je prišlo do manjše aktivacije signalizacije NLRP3 kot v nasprotnih celicah, kar je privedlo do izboljšav mitohondrijske dinamike (dodatna slika 10A–E). V skladu s tem je prišlo do sočasnih izboljšav fibrotičnih sprememb in celične smrti v odsotnosti Nlrp3 (dodatna slika 10F, G). Te ugotovitve kažejo na možno dvosmerno razmerje med mitohondrijsko poškodbo in signalizacijo NLRP3.
Oligomerizacija NLRP3 z adapterskim proteinom, ASC, je ključni korak tvorbe inflamasomskega kompleksa. Tako smo preverili, ali PGC- 1 vpliva na sestavljanje inflammasoma NLRP3. Pri RTEC, zdravljenih s TGF- 1-, so opazili vezavo ASC na NLRP3. To oligomerizacijo je znatno zmanjšala prekomerna ekspresija PGC-1 ali metformina, medtem ko je bila vezava obnovljena s siPGC-1 (sl. 6A–C). Pri miših, hranjenih z adeninom, sta bili oligomerizacija in aktivacija NLRP3 potrjeni z vezavo ASC na NLRP3 in to je bilo odpravljeno z metforminom (sl. 6D, E).
Končno smo nadalje pregledali vsebino mitohondrijev in sočasno spremembo izražanja NLRP3. Konfokalna mikroskopska preiskava je pokazala, da je prišlo do recipročne spremembe v intenzivnosti MitoTracker Red in izražanju NLRP3 v RTEC z ali brez PGC-1. TGF- 1 je zmanjšal intenzivnost obarvanja MitoTrackerja in te so bile obnovljene s prekomerno ekspresijo PGC-1 in metforminom. Nasprotno pa je bila povečana ekspresija NLRP3 v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-, zmanjšana s prekomerno ekspresijo PGC-1 in metforminom. Vendar je siPGC-1 te ugotovitve obrnil (slika 7). Skupaj te ugotovitve kažejo, da je bilo sestavljanje inflamasomskega kompleksa NLRP3 inducirano med poškodbo ledvic, aktivacijo te poti pa je oslabil PGC-1.
Slika 5 PGC-1 modulira inflamasomsko signalno pot NLRP3. Raven ekspresije mRNA in proteina B vnetne poti NLRP3 je bila zmanjšana v RTEC, obdelanih s TGF- 1-, s transfekcijo plazmida Ppargc1a, medtem ko se je povečala s siPGC-1. C Koncentracije IL- 1 in IL-18, ocenjene z ELISA, so bile zmanjšane v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-, s prekomerno ekspresijo Ppargc1a. Raven ekspresije D mRNA in E proteina vnetne poti NLRP3 je bila oslabljena v RTEC, zdravljenih s TGF- 1-, z metforminom. Stopnje ekspresije F mRNA in G proteina vnetne poti NLRP3 ter koncentracije H IL-1 in IL-18, ocenjene z ELISA, so bile oslabljene pri miših, hranjenih z adeninom, z metforminom. Opomba: *P < 0.05 proti kontroli; **P < 0,05 v primerjavi z RTEC, zdravljenimi s TGF- 1-, ali mišmi, hranjenimi z adeninom. PGC-1 peroksisomski proliferator-koaktivator-1 ; NLRP3 NOD-podobna družina receptorjev, 3, ki vsebuje domeno pirina; ASC, povezan z apoptozo, pegam podoben protein, ki vsebuje rekrutacijsko domeno kaspaze; RTEC ledvične tubularne epitelne celice; ELISA encimski imunski test; Ade adenin; Metformin.
Slika 6 PGC-1 modulira oligomerizacijo vnetja NLRP3 med poškodbo ledvic. Oligomerne strukture A–C ASC, testirane z navzkrižnim povezovanjem, ki ga posreduje DSS, so opazili v RTEC, obdelanih s TGF- 1-, ki so bile oslabljene s prekomerno ekspresijo Ppargc1a in metformina, medtem ko so bile poslabšane s siPGC-1. D, E ASC oligomerne strukture so opazili pri miših, hranjenih z adeninom, ki so bile oslabljene z metforminom. Opomba: *P < 0.05 proti kontroli; **P < 0,05 v primerjavi z RTEC, zdravljenimi s TGF- 1-, ali mišmi, hranjenimi z adeninom. PGC-1 peroksisomski proliferator-koaktivator-1 ; NLRP3 NOD-podobna družina receptorjev, 3, ki vsebuje domeno pirina; ASC, povezan z apoptozo, pegam podoben protein, ki vsebuje rekrutacijsko domeno kaspaze; DSS disukcinimidil suberat; RTEC ledvične tubularne epitelne celice; Ade adenin; Metformin.
PGC-1 orkestrira sproščanje mtDNA, oksidativni stres in TNFAIP3 za uravnavanje vnetja NLRP3
Za nadaljnjo razjasnitev mehanične povezave med PGC-1 in vnetno potjo NLRP3 pri poškodbi ledvic smo najprej pregledali spremembe v mtDNA po poškodbi celice, ki je znana kot sprožilec aktivacije vnetja NLRP3. Število kopij mtDNA se je zmanjšalo v mitohondrijski frakciji in povečalo v citosolni frakciji po zdravljenju s TGF- 1, kar nakazuje, da se je mtDNA sprostila iz mitohondrijev v citosol. Predvsem so bile te spremembe obnovljene po čezmerni ekspresiji Ppargc1a (slika 8A).
Nato smo pregledali oksidativni stres, pozitivni regulator vnetja NLRP3. Pri RTEC, obdelanih s TGF- 1-, je bil oksidativni stres izrazito izrazit v primerjavi s kontrolami, kar dokazuje povečana intenzivnost obarvanja z MitoSOX in povečana raven MDA. Zdravljenje s plazmidom Ppargc1a in metforminom je zmanjšalo to čezmerno proizvodnjo mitohondrijskih ROS. Nasprotno pa je knock-down Ppargc1a dodatno povečal ravni oksidativnega stresa v RTEC, zdravljenih s TGF- 1- (sl. 8B–D). Podobno kot ugotovitve študije in vitro so bile ravni MDA znatno povečane pri miših, hranjenih z adeninom, in miših UUO. Izboljšan oksidativni stres je zmanjšal metformin (slika 8E in dopolnilna slika 6E).
Nazadnje smo nadalje preučili TNFAIP3, ki ga uravnava PGC-1 in je znan tudi kot negativni regulator vnetja NLRP3. TGF- 1 je zmanjšal nivoje transkripta Tnfaip3 in ta zmanjšana ekspresija Tnfaip3 je bila obnovljena z obnovitvijo PGC-1. Nasprotno pa je knock-down Ppargc1a povzročil nadaljnje zmanjšano izražanje Tnfaip3 (sl. 8F, G in dopolnilna slika 8D, E). Poleg tega je prišlo do zmanjšane ekspresije TNFAIP3 pri miših, hranjenih z adeninom in UUO, in metformin je obnovil to ekspresijo (slika 8H in dopolnilna slika 6F, 8F). Te ugotovitve skupaj kažejo, da lahko PGC-1 uravnava vnetje NLRP3 z modulacijo sproščanja mtDNA, mitohondrijskim ROS/oksidativnim stresom in TNFAIP3.
Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Trgovina za več podrobnosti o specifikacijah:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
