Vsebnost fenolnih spojin in genetska raznolikost na populacijski ravni v naravnem območju razširjenosti medvejke (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) na Iberskem polotoku

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Povzetek:Medvejka (Arctostaphylos uva-ursi) je zdravilna rastlina, ki se tradicionalno uporablja za zdravljenje okužb sečil zaradi visoke vsebnostiarbutin(hidrokinon -D-glukozid), ki se danes večinoma uporablja kot naravno sredstvo za beljenje kože v kozmetiki. Medvejka je bila predlagana tudi kot naravnaantioksidantdodatek zaradi visoke vsebnosti fenolnih spojin v listih. Preučevali smo variacije fenolnih spojin v 42 divjih populacijah medvejke, da bi razjasnili, ali intrinzični biološki, podnebni in/ali geografski dejavniki vplivajo na vsebnost fenolov v njeni naravni porazdelitvi na Iberskem polotoku. Liste medvejke so nabirali jeseni v triletnem obdobju (2014–2016) v populacijah po zemljepisni širini in nadmorski višini. Ekstrakti metanola so pokazali širok razpon variacij v vsebnosti skupnih fenolov in različne fenolne profile gledearbutin(ravni te glavne sestavine so se gibale od 87 do 232 mg/g suhe teže), ampak tudi vsebnosti katehina in miricetina, na katere so vplivali geografski in podnebni dejavniki. Med populacijami so bile odkrite tudi zmerne stopnje variacije velikosti genoma – ocenjene s pretočno citometrijo – in dveh plastidnih regij DNA. Genetska in citogenetska diferenciacija populacij je bila šibka, vendar v veliki meri povezana s fitokemično raznolikostjo. Elitni genotipi medvejke z višjoantioksidantzmogljivosti so bile naknadno ugotovljene.

Ključne besede: arbutin; genetska in fitokemična variabilnost; velikost genoma; haplotipi;naravniantioksidanti

cistanche so naravni antioksidanti

1. Uvod

Sinteza presnovkov, specializiranih za rastline, se spreminja v času (tj. ontogeneza, fenologija in inducirana obramba) in prostoru, saj igra ključno vlogo pri prilagajanju rastlin na okoljske razmere, medtem ko tudi genetske variacije predstavljajo kemodiverziteto [1]. Med temi spojinami imajo fenoli raznoliko paleto mono- in polimernih struktur, ki izpolnjujejo širok spekter fizioloških vlog [2]. Na biosintezo specializiranih metabolitov močno vplivajo okoljski dejavniki, kot so temperatura, padavine ali sončno sevanje, ki so nato pogosto podvrženi širinskim, vzdolžnim ali višinskim gradientom. Zlasti kopičenje fenolnih spojin je splošni odziv na povečane ravni sevanja UV-B (280–315 nm). Poročali so o specifičnih variacijah spojin v rastlinah, ki rastejo v sredozemski regiji poleti in na velikih nadmorskih višinah, kjer je večja pojavnost UV-B, cimetove kisline in flavonoidi pa so pokazali najvišjo stopnjo UV-absorpcije [3].

Arbutin(hidrokinon -D-glukozid) je preprosta fenolna spojina z omejeno prisotnostjo v listih nekaterih vrst, ki pripadajo rodovom, kot so Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus ali Vaccinium. Glavni naravni vir arbutina je medvejka (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) se že stoletja uporablja za zdravljenje okužb sečil in drugih ledvičnih bolezni [4], zeliščne formulacije pa se pripravljajo še danes [5]. V zadnjih letih se je spekter uporabearbutinse je razširil predvsem kot naravno sredstvo za beljenje kože v kozmetični industriji [6] in v kliničnih terapijah zaradi svojeantioksidant, antibiotične, protivnetne in protitumorske lastnosti [7]. Posledično se povečuje zanimanje za iskanje dodatnih naravnih virovarbutin, kot tudi biotehnološki procesi, ki lahko nadomestijo kemično sintezo [8,9]. V tem kontekstu je proizvodnja arbutina in vitro z uporabo celičnih kultur Datura inoxia dosegla pilotni obseg [10].

Polegarbutin, druge fenolne spojine prispevajo k aktivnim lastnostim A. uva-ursi, kot so flavonoidi in tanini [11,12], od katerih sta katehin in korilagin najpomembnejša v listih [13]. V živilski industriji naravne spojine kot rastlinske fenole nadomeščajo sintetičneantioksidantkonzervansi [14]. A. uva-ursi se uporablja kot dodatek, zlasti v mesnih izdelkih [15–19], pa tudi v aktivni embalaži [20]. Nazadnje je bil nedavno predlagan potencial A. uva-ursi kot vira strojilnih sredstev za usnjarsko industrijo [21].

Monografija Evropske agencije za zdravila [5] o "listih medvejke" je predlagala najmanj 7 odstotkovarbutinvsebnost v posušenih listih kot zahteva za zeliščne pripravke. Študije, ki so bile izvedene v zadnjih desetletjih, so opisale vsebnost arbutina v listih medvejke od 0 odstotkov do 18 odstotkov, kar je razloženo z analitičnimi postopki, naravno spremenljivostjo, pogoji rasti in datumom obiranja [4]. Vsebnost arbutina se običajno določi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti [4,12,22–24], prejšnje študije pa so odkrile višjoarbutinvsebnosti v rastlinah medvejke, nabranih jeseni, kot v tistih, nabranih spomladi [4]. Opisani so bili različni kemotipi medvejke, povezani z geografsko porazdelitvijo in intraspecifično diferenciacijo v podvrsti A. uva-ursi. Najbolj presenetljiva fitokemična variacija, o kateri poročajo, je odsotnost arbutina v A. uva-ursi subsp. stipitata Packer in Denford, omenjene pa so bile tudi razlike v vsebnosti metil-arbutina, elagične kisline ali miricetina. Kvercetin je prisoten tudi v listih medvejke, v katerih so tako aglikoni kot tudi njihovi 3-O-glikozidi najpogosteje najdeni flavonoidi [4]. Vendar je bila večina teh raziskav opravljena pred nekaj desetletji in danes velja, da je znotrajvrstna variabilnost medvejke neprekinjena. 14 opisanih podvrst, vključno z eno iz Španije (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre, Alcaraz in MB Crespo), so trenutno nesprejeta imena in sinonim za A. uva-ursi [ 25]. Zato so potrebne nove raziskave, da bi izboljšali naše znanje o spojinah, ki so dejansko prisotne v surovinah, pridelanih z različnih lokacij za industrijske namene, saj je bilo opisano, da kemični profil listov A. uva-ursi vključuje raznoliko paleto fenolov, taninov, in flavonoidi v novejših študijah, izvedenih za raziskovanje razlik na medvrstni ravni [23,26,27].

Genetska (vključno s citogenetsko) raznolikost na populacijski ravni spodbuja prilagajanje na različne okoljske razmere [28]. Nedavno so bili pregledani učinki poliploidizacije na proizvodnjo specializiranih metabolitov v zdravilnih in aromatičnih rastlinah [29]. V tem kontekstu je velikost genoma pogosto uporabljen parameter pri ocenah variabilnosti rastlin, saj je pogosto zaznana intraspecifična variacija ([30] in tamkajšnje reference), korelirana s številnimi drugimi biološkimi lastnostmi in ima pomembno vlogo v evolucijskih procesih [31–35]. ]. Vendar pa so študije, ki obravnavajo povezavo med količino jedrske DNK (tj. velikostjo genoma) in fitokemično raznolikostjo, zelo redke [36,37]. Razmerje med fitokemično in genetsko raznovrstnostjo je bilo ocenjeno z uporabo jedrskih, predvsem pa plastidnih markerjev DNA [38], zlasti pri vrstah zdravilnih [39] in gojenih [40] rastlin.

Medvejka je široko razširjena po celotnem cirkumborealnem območju, vendar je večina zbranih divjih populacij v Evropi v vzhodnih državah, Avstriji, Švici, Italiji in Španiji. Arctostaphylos uva-ursi raste v vzhodnem srednjem delu Španije, v gorah, v nadmorske višine od 550 do 2350 m. Pogostejša je na severu, saj so populacije, ki se nahajajo na nižjih zemljepisnih širinah, manj pogoste in imajo običajno manj posameznikov. Obstoječe študije o variabilnosti vsebnosti arbutina v Španiji so se sklicevale na vrednosti od 8 odstotkov v severovzhodnih populacijah [41] do 19 odstotkov v španskem rastlinskem materialu, ocenjenem v študiji, izvedeni v Nemčiji [42]. Namen naše študije je pojasniti dejavnike, vključno z velikostjo genoma in genetsko raznolikostjo, ki pojasnjujejo fitokemične variacije po naravni razširjenosti medvejke v Španiji. Naši rezultati bi lahko prispevali k izbiri rastlinskega materiala za farmacevtsko, kozmetično in prehrambeno industrijo.

hrana za beljenje kože: CISATNCHE

2. Rezultati in razprava

2.1. Analiza kemijske raznolikosti

Listi medvejke, vzorčeni iz skupno 249 rastlin, ki rastejo na 42 španskih lokacijah, in v triletnem obdobju, 2014–2016 (slika 1, tabela S1), so pokazali različne odstotke suhe teže (dr wt), ki segajo od 46,7 (LO) do 55,1 odstotka (CP), s povprečjem 50,1 ± 2,7 odstotka (podatki niso prikazani). Za določanje vsebnosti skupnih fenolov in arbutina so bili uporabljeni metanolni ekstrakti, pripravljeni iz vzorcev, zbranih v letih 2014 in 2015. Opazili smo širok razpon zveznih variacij za oba parametra z značilnimi razlikami (p < 0,001)="" med="" rastlinami.="" izvlečki="" listov="" 80="" rastlin,="" vzorčenih="" jeseni="" 2014="" (slika="" 2a),="" so="" pokazali="" skupno="" vsebnost="" fenolov="" v="" razponu="" od="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" suhe="" mase="" (vzorec="" li-4)="" do="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" suhe="" mase="" (sr="" -2),="" medtem="">arbutinvsebnosti so nihale od 92.0 ± 3.0 mg/g suhe mase (AN-6) do 194,2 ± 5,6 mg/g suhe mase (SE-8). Analiza izvlečkov, pripravljenih iz listov, zbranih v 2015 iz 94 rastlin (slika 2b), je prav tako pokazala široko fitokemično variacijo, od 110,5 ± 3,6 mg GAE/g suhe mase (PI-4) do 200,9 ± 9,8 mg GAE/g suhe mase (LO-4) v skupni vsebnosti fenolov, medtem ko se je vsebnost arbutina gibala med 87,1 ± 0,4 mg/g suhe mase (ET-2) in 211,5 ± 5,9 mg/g suhe mase (LI -2). Poleg tega so ne glede na leto zbiranja znatne razlike v skupnih fenolih inarbutinvsebnost je bila odkrita med rastlinami medvejke, ki rastejo na istem mestu za večino populacij (podatki niso prikazani). Raven arbutina je bila v pomembni korelaciji s skupno vsebnostjo fenolov v izvlečkih listov medvejke, saj smo ocenili pomembne Pearsonove koeficiente {{0}} 0,332 (p=0.003) za leto 2014 in 0,289 za podatke za leto 2015 (p=0.005). Vsebnost arbutina v 48 rastlinah, vzorčenih v obeh letih, se ni pomembno razlikovala (p=0.380).

Kljub variabilnosti, ugotovljeni znotraj populacij, in ne glede na leto obiranja je analiza variance pokazala, da je vsebnost arbutina v izvlečkih listov medvejke prav tako odvisna (p < {{0}}.00="" 1)="" na="" populacijski="" lokaciji="" (slika="" 3a,b),="" kot="" se="" je="" zgodilo="" za="" celotno="" vsebnost="" fenolov="" v="" listih="" medvejke,="" analiziranih="" v="" 2015="" (p="">< 0.001,="" slika="" 3b).="" nasprotno="" pa="" pomembne="" razlike="" v="" vsebnosti="" skupnih="" fenolov="" niso="" bile="" opažene="" (p="0.080)" med="" 10="" populacijami,="" vzorčenimi="" leta="" 2014,="" ki="" so="" bile="" na="" razmeroma="" majhnem="" območju,="" vendar="" porazdeljene="" v="" širokem="" razponu="" nadmorske="" višine,="" od="" 424="" (ba="" prebivalcev)="" do="" 1410="" m="" nadmorske="" višine="" (pa="" prebivalcev).="" ta="" razlika="" v="" nadmorski="" višini="" je="" bila="" povezana="" z="" razlikami="" v="" podnebnih="" razmerah="" (tabela="" s1),="" saj="" so="" bile="" za="" lokacije="" na="" višji="" nadmorski="" višini="" značilne="" nižje="" srednje="" temperature="" (pearsonov="" korelacijski="" koeficient,="" r="−0,666," p="">< 0,001)="" in="" višje="" letne="" padavine="" (="" r="0.485," p="">< 0,001),="" kar="" je="" posledično="" povzročilo="" nižje="" globalne="" ravni="" sevanja="" (r="−0,390," p="">< 0,001).="" poleg="" tega="" smo="" iz="" tega="" nabora="" podatkov="" ocenili="" nizko,="" a="" pomembno="" pozitivno="" korelacijo="" med="" letno="" količino="" padavin="" in="" skupno="" vsebnostjo="" fenolov="" v="" rastlinah="" medvejke="" (spearmanov="" koeficient="" rho="0.256," p="0.022)," medtem="" ko="" iz="" nabora="" podatkov="" iz="" leta="" 2015="" ko="" smo="" vzorčili="" populacije="" na="" večjem="" območju,="" smo="" zaznali="" pomembno="" pozitivno="" korelacijo="" med="" letno="" količino="" padavin="" in="" vsebnostjo="" arbutina="" (rho="0.246," p="0.017)." ta="" pomembna="" korelacija="" kaže,="" da="" so="" rastline="" medvejke,="" ki="" rastejo="" na="" severnih="" lokacijah="" in="" na="" relativno="" višjih="" nadmorskih="" višinah,="" pogosto="" pokazale="">arbutinvsebine (rho=0.217, p=0.035 oziroma rho=0.269, p=0.009). Kot že omenjeno, so bile te višje vsebnosti arbutina pomembno povezane z višjo vsebnostjo skupnih fenolov v listih medvejke, ki so bile podobne (v povprečju 154,4 ± 19,6 mg GAE/g suhe teže) tistim, ki jih najdemo v vodnih izvlečkih iz drugih rastlinskih vrst, ki se uporabljajo kotantioksidantdodatki v prehrambeni industriji [43], kot je rožmarin (185.0 mg GAE/g suhe mase), čaj (149,3 mg GAE/g suhe mase) ali guava (154,4 mg GAE/g suhe mase). Ti rezultati so v skladu s prejšnjimi referencami in so bili potrjeni v študiji, ki so jo izvedli Wrona et al. [20] z uporabo nekaterih vzorcev listov španske medvejke, zbranih leta 2015, za katere višjaantioksidantzmogljivost je bila povezana z večjoarbutinvsebine. V ta namen je bilo mogoče identificirati tudi elitne genotipe medvejke, kot so posamezniki 1, 4, 7 in 8 iz populacije LO, ki so v dveh letih študije v povprečju nabrali 183,3 ± 16,4 mg GAE/g suhe mase.

Da bi dodatno razjasnili podnebne in geografske dejavnike, ki vplivajo na vzorce fenolnih variacij, smo jeseni 2016: 140 izvedli bolj izčrpno zbiranje vzorcev rastlin medvejke, ki rastejo na 29 lokacijah, in kvantificirali pet fenolnih spojin (Slika S1a), ki so bili identificirani s ko-elucijo s standardi v gradientu acetonitril/voda (Slika S1b). Analiza je pokazala širok razpon nenehnih variacij vsebnosti arbutina, kofeinske kisline, katehina, miricetina in kvercetin glukozida, s pomembnimi razlikami med rastlinami, ki so bile na splošno opažene tudi znotraj populacij (podatki niso prikazani). Za glavne fenolne sestavine smo ugotovili, da je vsebnost arbutina v razponu od 91,1 ± 5.0 (LB{{10}}) do 232,4 ± 2,8 mg/g suhe mase (PT{{15 }}), medtem ko je vsebnost katehina znašala od 4,1 ± 0.1 (AF{{20}}) do 45,5 ± 1,4 mg/g suhe teže (LB-5). Kar zadeva druga dva ugotovljena flavonoida, miricetin ni bil odkrit v nekaterih rastlinah iz več populacij, medtem ko je dosegel 21,2 ± 1,2 mg/g suhe mase v PO{{30}}, kvercetin glukozid pa je nihal od 3,8 ± 0,1 (CO -3) do 22,8 ± 0,8 mg/g suhe teže (BT-3). Nižje vsebnosti kofeinske kisline so bile ugotovljene v izvlečkih listov medvejke, ki so se gibale od 1,8 ± 0,0 (IZ-1) do 7,1 ± 0,3 mgRastline /g suhe mase (SI-4).

Kljub opaženim razlikam med posamezniki so bile za teh pet spojin ocenjene tudi pomembne razlike med populacijami (Kruskal–Wallisovi testi, p < {{0}}.001="" in="" p="0)." 009="" vsebnost="" kofeinske="" kisline).="" višje="" vsebnosti="" arbutina="" so="" bile="" v="" povprečju="" določene="" v="" rastlinah="" iz="" ab,="" gu,="" ln="" in="" lo="" naravnih="" populacij="" (slika="" 4a),="" ki="" so="" se="" bistveno="" razlikovale="" (po="" bonferronikorekciji)="" od="" nizkih="" vsebnosti,="" ugotovljenih="" v="" rastlinah="" iz="" lb="" populacije="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,="" 169,5="" ±="" 10,0="" oziroma="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" suhe="" mase="" spredaj="" do="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" suhe="" mase).="">arbutinvsebnosti rastlin, ki so bile vzorčene tudi v 2015, se med leti niso bistveno razlikovale (p=0.821). Populacijski LB je pokazal višjo povprečno raven katehina (slika 4b), ki se je znatno razlikovala od nizkih povprečnih vsebnosti tega flavonoida, odkritih v populacijah AF in LC (32,8 ± 9,8 spredaj do 5,7 ± 1,9 in 5,3 ± {{2{{62} }}}.5 mg/g suhe mase). Povprečne vsebnosti miricetina in glukozidov kvercetina so prikazane na sliki 4c, s pomembnimi razlikami med populacijami AB, CG, LB in PO z višjo vsebnostjo miricetina (15,1 ± 4.0, 14,6 ± 5,7, 10 0,7 ± 2,8 oziroma 17,2 ± 3,9 mg/g suhe mase) v primerjavi z nizkimi ravnmi, ki so se kopičile na povprečnih rastlinah iz populacij CO in OD (1,2 ± 1,5 oziroma 2,4 ± 3,6 mg/g suhe mase) , in tudi pomeni vsebnost kvercetin glukozida, določeno v populacijah AA, BT, CP, IZ in LB (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 in 13,1 ± 4,6 mg/g suhe teže, v tem zaporedju), se pomembno razlikujejo. od CO v populaciji (4.0 ± 0,1 mg/g suhe teže). Nasprotno pa je povprečna vsebnost kofeinske kisline nihala od 2,1 ± 0,2 mg/g suhe mase v populacijah AB, CE, PT in SA do 3,5 ± 1,2 mg/g suhe mase v populaciji AF ali 3,4 ± 2,2 mg/g suhe mase v prebivalstvo SI; zato pomembne razlike niso bile opažene zaradi variacije znotraj populacije (povprečna vsebnost 2,7 ± 0,8 mg/g suhe teže). Ti rezultati dopolnjujejo variacijo fenolnih metabolitov, ki so jih opazili Wrona et al. [20], za osem lokacij medvejke, vzorčenih leta 2015, ki so bile analizirane s tehnologijo UPLC®-ESI-Q-TOF withMSE.

V nasprotju z rezultati analize vzorcev medvejke iz let 2014 in 2015,arbutinvsebnosti, določene v 2{{10}}16 vzorcih, so pokazale nizko, a pomembno pozitivno korelacijo s sevanjem (rho=0.256, p=0.002) in najvišjimi srednjimi temperaturami (rho{ {5}}.183, p=0.030), zato so bili v obratni korelaciji z letnimi vrednostmi padavin (rho=−0.265, p=0.002). Te razlike so bile povezane tudi z variacijo nadmorske višine (rho=−0,192, p=0.023), vendar je bila ta negativna korelacija pojasnjena z omenjeno nizkoarbutinvsebnosti rastlin iz populacije LB, ki se nahajajo na 1720m. Podoben vzorec variacije so opazili pri vsebnosti miricetina, saj so bile višje ravni te spojine pomembno povezane z rastlinami medvejke, ki rastejo na lokacijah z višjimi ravnmi sevanja (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). Za katehin so opazili nasprotni vzorec kot pri arbutinu, saj je bila ocenjena pozitivna korelacija med tem flavonoidom in letno količino padavin (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" zato="" so="" bile="" negativne="" korelacije="" zaznane="" s="" sevanjem="" in="" z="" najvišjo="" srednjo="" temperaturo="" (rho="−0.307," p="">< 0,001="" in="" rho="−0,470," p="">< 0,001,="" oz.).="" ta="" razlika="" v="" podnebnih="" dejavnikih="" je="" pojasnila,="" da="" tako="" nadmorska="" višina="" kot="" zemljepisna="" širina="" vplivata="" na="" vsebnost="" katehinov="" v="" listih="" medvejke="" (rho="0,410" oziroma="" 0,490,="" p="">< 0,001).="" analiza="" glavnih="" komponent,="" izvedena="" s="" fitokemičnimi,="" podnebnimi="" in="" geografskimi="" podatki,="" ki="" ustrezajo="" 29="" lokacijam,="" vzorčenim="" leta="" 2016,="" v="" katerih="" sta="" prvi="" dve="" komponenti="" pojasnili="" 60="" odstotkov="" opaženih="" variacij,="" je="" potrdila="" te="" rezultate="" (slika="" 5).="" nismo="" odkrili="" nobene="" pomembne="" korelacije="" med="" vsebnostjo="" kofeinske="" kisline="" ali="" kvercetinskega="" glukozida="" v="" rastlinah="" medvejke="" in="" podnebnimi="" ali="" geografskimi="" dejavniki,="" čeprav="" smo="" ocenili="" rahle,="" a="" pomembne="" korelacije="" med="" vsebnostjo="" miricetina="" in="" kvercetinskega="" glukozida="" (rho="0.184," str="" {{31}="" }.030)="" in="" med="" vsebnostjo="" miricetina="" in="" kofeinske="" kisline="" (rho="−0.176," p="0.037)" rastlin="">

Opaženi kontrastni podnebni vzorci variacije varbutinVsebnost rastlin medvejke nakazuje, da je verjetno pomanjkanje vode omejevalni dejavnik za A. uva-ursi v Sredozemlju in južnih regijah, čeprav se biosinteza tega metabolita verjetno poveča v pogojih višjega sevanja in temperature. Del Valle et al. [44] so poročali o širinskem vzorcu kopičenja flavonoidov Silene littorea (Caryophyllaceae) v Španiji, kjer so bile določene višje vsebnosti flavonoidov pri južnih populacijah, saj je zemljepisna širina negativno korelirala z UV-B sevanjem in temperaturo ter pozitivno s padavinami. Globalno sevanje kaže jasen širinski gradient z večjo pojavnostjo na jugu in vzhodu Iberskega polotoka, obstaja pa tudi pomemben orografski učinek, saj obstojnost oblakov spreminja pojavnost tega sevanja na višjih nadmorskih višinah. Zemljevid UV-sevanja Španije [45] navedena visoka korelacija (r > 0.9) med podatki o UV-B in globalnem sevanju. Glede na to referenco so populacije medvejke, ki so pokazale višjo srednjo vrednostarbutinVsebina v naši študiji se večinoma nahaja na območjih z ravnmi sevanja UV-B 2403–2451 J/m2.

Naši rezultati za variacijo katehinov v medvejki so pokazali geografski vzorec (slika 5) in se ujemajo s študijami, izvedenimi na drugih rastlinskih vrstah iz severnih evropskih držav. V rastlinah, ki rastejo na višjih zemljepisnih širinah, so poročali o višjih vsebnostih specializiranih presnovkov, kot so flavonoidi in antocianini, verjetno zaradi daljših obdobij dnevne svetlobe in nižjih nočnih temperatur [46]. Tako se je vsebnost topnih fenolov v iglicah Juniperus communis povečevala z zemljepisno širino in nadmorsko višino v populacijah na Finskem [47], poleg tega pa so na višji zemljepisni širini v plodovih treh Ribes spp. sorte, analizirane na dveh finskih lokacijah [48]. Ti avtorji povezujejo nižjo vsebnost fenolov z višjimi stopnjami sevanja in temperature. Vsebnost flavonoidov v plodovih dveh vrst Vaccinium (prav tako iz družine Ericaceae) je pokazala geografski gradient, z večjimi količinami flavonoidov v severnih zemljepisnih širinah [49, 50].

Glede na nadmorsko višino so bile višje ravni flavonoidov ugotovljene v populacijah drugih vrst Ericaceae, Calluna vulgaris, ki rastejo na višjih nadmorskih višinah [51]. Višinski gradienti so vplivali tudi na specializiran metabolizem španskih populacij Arnice montana [52] in Quercus robur [53]. Zadnje delo je navedlo pomembno pozitivno povezavo med koncentracijo skupnih fenolov v listih in višino, saj je gradient odvisen samo od flavonoidov, kar nakazuje, da ti spojine so povzročile razmerje za skupne fenole. Ti rezultati se ujemajo z našimi ocenami za vzorec vsebnosti katehinov. Končno je bil gradient padavin povezan s pomembnimi razlikami v sestavi polifenolov v afriškem zdravilnem grmu (Myrothamnus flabellifolia), pri katerem so bile presnovne razlike skladne z genetsko strukturo populacij [54].

CISTANCHE LAHKO PROTI STARANJU

2.2. Analiza podatkov o velikosti genoma in zaporedju

Vrednosti velikosti genoma 2C rastlin medvejke so bile od 2,50 do 3,15 pg (tabela 1). Med populacijami so bile ugotovljene majhne razlike v količini jedrske DNK (Kruskal–Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Dunnov test z Bonferronijevim popravkom je pokazal statistično značilne razlike med: populacijami AL in SI (Z=−3,972, p=0.024), LE in SI (Z=−4,196, p {{ 21}}.009) in SE in SI (Z=−4.236, p=0.008). Populacija Pontil (PO) je tipsko nahajališče A. uva-ursi var.crassifolius, ki je bila kasneje združena v A. uva-ursi subsp. crassifolius, ki trenutno ni taksonomsko obravnavan (glej uvod), ima vmesno vrednost (2,88 pg) znotraj razpona vrednosti, pridobljenih v drugih populacijah te vrste. To je prva obsežna populacijska študija količine jedrske DNA v vrsti in celotnem rodu, saj edini do danes dostopni podatki prihajajo iz ene balkanske populacije istega taksona [55]. Tam navedena vrednost 2C, 2,49 pg, je postavljena ravno na spodnjo mejo razpona variacije tukaj raziskanega niza podatkov. Med vrednostmi velikosti genoma in nadmorsko višino prebivalstva ni bilo ugotovljene povezave. Količina DNK posameznikov je pokazala šibko pozitivno pomembno korelacijo zarbutinvsebnost, ko so primerjali podatke iz 158 rastlin medvejke (rho=0.187, p=0.018), medtem ko ni bila najdena nobena druga pomembna korelacija med velikostjo genoma in drugimi spremenljivkami. Ta rezultat se ujema s poročanim povečanjem proizvodnje specializiranih metabolitov, ki so na splošno opaženi v zdravilnih in aromatičnih rastlinah po poliploidizaciji [29].

Novo proizvedena zaporedja za medgenske distančnike rpl{0}}trnL in psbE-petN so bila poravnana v dve matriki (ki sta vsebovali 566 oziroma 874 bp), ki sta bili povezani v eno matriko 1440 bp. Zmerno odkrite so bile stopnje variacije v teh plastidnih regijah (šest nukleotidnih substitucij in štirje indeli). Najdenih je bilo deset različnih haplotipov s skupno haplotipsko raznolikostjo (Hd) 0.468 (tabela 1). Večina populacij (21) je vsebovala le en haplotip, medtem ko jih je pet med posamezniki pokazalo nekaj raznolikosti. Najpogostejši haplotip 1 je pokazal največjo frekvenco (71,4 odstotka), sledil mu je haplotip 2 (15,2 odstotka), medtem ko so ostali pokazali precej nižje frekvence (0,04–0,01 odstotka). Geografska porazdelitev haplotipov je prikazana na sliki 6. Haplotip 1 je bil najden v 32 populacijah - fiksiran je bil v 18 od njih - porazdeljenih po vseh vzorčenih regijah, razen v najbolj južnih krajih. Haplotip 2 je bil najden v desetih populacijah in je bil izključni haplotip v dveh najjužnejših populacijah (HU in LV) ter v PR. Haplotip 4 je bil zaseben iz treh populacij iz Pirenejev, medtem ko se je haplotip 8 pojavil v dveh populacijah iz vzhodnega Iberskega polotoka. Kar zadeva evolucijska razmerja, prikazana v omrežju parsimony (slika 6), je večina haplotipov povezanih z enim ali dvema korakoma mutacije. Haplotip 1 zavzema osrednji položaj, z njim je povezanih sedem haplotipov.

Mantelov test med genetsko in kemično parno matrico razdalje pDNA je pokazal šibko, a pomembno korelacijo (r=0.301; p=0.048) med genetsko diferenciacijo in koncentracijo petih kemičnih komponent, izmerjenih za nabor podatkov za leto 2016. Mantelov test ni pokazal nobene pomembne korelacije med genetsko in geografsko razdaljo med 25 populacijami, vzorčenimi leta 2016 (r=0.103, p=0.207) ali med kemičnimi in geografskimi parnimi razdaljami med temi 25 populacij (r=0.191, p=0.050). Tukaj poročana fitokemična variabilnost divjih populacij medvejke po vsej Španiji je torej dopolnjena z zmernimi stopnjami variacije haplotipa pDNA, saj je genetska diferenciacija sever-jug v populacijah medvejke primerljiva s filogeografskimi vzorci, ki jih najdemo v drugih rastlinah (npr. [56–58]. Vso to homogenost pričakujemo pri rastlinah z nizko sposobnostjo razmnoževanja [59], kot je A. uva-ursi, ki kaže slabo stopnjo kalitve in visoko stopnjo umrljivosti mladih sadik [4].Kljub temu je skromna genetska diferenciacija, ki jo je pokazala pDNA, povezana z biokemičnimi. razdalje po parih, ocenjene iz profilov petih fenolnih Slika 6. Geografska porazdelitev haplotipov pDNA na iberskih populacijah Arctostaphylos uva-ursi. Kode populacije ustrezajo tistim v tabeli S1, tortni grafikoni pa predstavljajo odstotek posameznikov, ki prikazujejo vsak haplotip v vsaki populaciji. pravokotnik, statistično varčno omrežje, ki prikazuje evolucijska razmerja te Predstavljenih je n plastidnih haplotipov, najdenih v populaciji A. uva-ursi. Vsak trak vzdolž črt, ki povezujejo haplotipe, označuje en mutacijski korak v regijah pDNA, sekvenciranih v tej študiji. Mantelov test med genetskimi in kemičnimi parnimi matrikami razdalje pDNA je pokazal šibko, a pomembno korelacijo (r=0.301; p {{28 }}.048) med genetsko diferenciacijo in koncentracijo petih kemičnih komponent, izmerjenih za nabor podatkov za leto 2016. Mantelov test ni pokazal nobene pomembne korelacije med genetsko in geografsko razdaljo med 25 vzorci populacij leta 2016 (r=0.103, p=0.207) ali med kemičnimi in geografskimi razdaljami v parih med temi 25 populacijami ( r=0.191, p=0.050). Fitokemijska variabilnost, o kateri poročajo tukaj za populacije medvejke v Španiji, je torej dopolnjena z zmernimi stopnjami variacije haplotipa pDNA, saj je genetska diferenciacija sever-jug, ki jo najdemo v populacijah medvejke, primerljiva s filogeografskimi vzorci, ki jih najdemo v drugih rastlinah (npr. [56–58]. Vsa ta homogenost se pričakuje pri rastlinah z nizko sposobnostjo razmnoževanja [59], kot je A. uva-ursi, ki kaže slabo stopnjo kalitve in visoko stopnjo umrljivosti mladih sadik [4].Kljub temu je skromna genetska diferenciacija, ki jo je pokazala pDNA, povezana z biokemičnimi parnimi razdaljami, ocenjenimi iz profilov Ta vzorec genetske in fitokemične variabilnosti (ki, kot je bilo omenjeno, ni bil povezan z geografskimi razdaljami), kot tudi šibka, a pomembna korelacija med velikostjo genoma in vsebnostjo arbutina, lahko kaže, da naravna genomska variabilnost vpliva na izkoristek fenolnih spojin v A. uva-ursi Vendar hipervariabilna molekularna m arkerji v obsežnejšem vzorčenju populacije so potrebni za potrditev teh filogeografskih vzorcev in povezave med genetsko in biokemično variabilnostjo.

CISTANCHE IMA ANTIOKSIDACIJSKE UČINKE

3. Materiali in metode

3.1. Rastlinski material

Za fitokemično analizo je bilo jeseni 2014, 2015 in 2016 vzorčenih skupno 249 rastlin medvejke, ki rastejo v 42 populacijah, kar je reprezentativno za naravno razširjenost te rastlinske vrste na Iberskem polotoku (slika 1 in tabela S1). Najprej smo jeseni 2014 zbrali končne poganjke 80 rastlin v desetih španskih populacijah (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC in SE), ki se nahajajo na relativno majhnem območju (približno 80 × 50 km) v severni Španiji, vendar v širokem razponu nadmorske višine (424–1410 m nadmorske višine). Drugič, jeseni 2015 smo zbrali 48 rastlin iz šestih od teh populacij (AG, LI, LO, PA, SE in SR) in 46 rastlin medvejke iz šestih populacij na nižjih zemljepisnih širinah (AL, CH, ET, HU, LV). in PI). Za vsako populacijo smo vzorčili osem rastlin, ločenih vsaj 5 m, razen na HU, kjer smo našli le šest osebkov. Tretjič, jeseni 2016 je bilo vzorčenih skupno 140 rastlin na 29 različnih lokacijah (1–6 posameznikov iz vsake), vključno s 26 novimi španskimi kraji (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN in ZU). Naše vzorčenje zajema razpon nadmorske višine od 534 do 1750 m. Skupaj 42 populacij predstavlja širok razpon podnebnih pogojev (tabela S1): najvišja povprečna temperatura je pokazala 2-kratno variacijo (13–26 ◦C) in letna količina padavin je nihala od 399 (ZU) do 1589 mm (PT). Globalno sevanje je bilo od 4,2 do 5,1 kWh/m2d. Za vsako rastlino smo zbrali šest do deset končnih poganjkov (15–20 cm dolgih), da smo dobili 6–15 g zdravih listov, ki smo jih nato izrezali in posušili pri 60 ◦C do konstantne teže (3–4 dni). Po določitvi suhe teže so bili listi ročno homogenizirani v terilnici in do analize shranjeni pri 4 ◦C. Ta rastlinski material je bil uporabljen za določanje skupnih fenolov in HPLC.

Materiali listov za ocene pretočne citometrije so bili pridobljeni iz svežih listov 178 posameznikov, ki so pripadali skupno 37 populacijam (tabela 1). Vzorci so bili pridobljeni iz 33 zgoraj omenjenih populacij in iz štirih novih populacij (BE, JO in PR v Španiji ter EN v Andori), kjer so bili listi zbrani spomladi 2017, in zato niso bili vključeni v fitokemično analizo (slika 1 in Tabela S1). Izmerili so od enega do šest osebkov na populacijo v dvojnikih. Listne materiale za ekstrakcijo DNK smo posušili v silikagelu in shranili pri sobni temperaturi. Analize raznolikosti DNK so bile izvedene v skupno 105 rastlinah s 35 lokacij (tabela 1).

Rastlinski vavčerji 46 proučevanih populacij medvejke so deponirani v herbariju BC, Instituta Botànic de Barcelona, ​​v herbariju BCN, Center de Documentació de BiodiversitatVegetal, Universitat de Barcelona ali v herbariju JACA, Instituto Pirenaico de Ecología ( CSIC).

3.2. Priprava izvlečkov listov in določanje skupnih fenolov

Tri ponovitve izvlečkov listov medvejke smo pripravili z uporabo 50 mg posušenega vzorca in 10 mL 80 odstotnega metanola. Epruvete smo inkubirali 30 min v ultrazvočni kopeli, nato pa izvlečke filtrirali (0,45 mm) in shranili pri 4 ◦C do analize. Vsebnost skupnih fenolov smo določili v ekstraktih, pripravljenih iz vzorcev, zbranih v letih 2014 in 2015. Sledili smo metodi Folin–Ciocalteu [60,61] z majhnimi spremembami: na 0,1 ml ekstrakta, 0,4 ml metanola (80 odstotkov), 0,5 ml Folin– Dodali smo reagent Ciocalteu in 8 ml ultra čiste vode. Po 5 minutah v ultrazvočni kopeli je bil dodan 1 mL Na2CO3 20 odstotkov (w/v). Vzorce smo pustili v temi 30 minut, preden smo izmerili absorbanco pri 760 nm z UV-vidnim spektrofotometrom (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Rezultati so bili izraženi v ekvivalentih galne kisline (GAE); to je mg galne kisline/g suhe teže z uporabo standardne krivulje galne kisline (40–340 µg/g).

3.3. Določanje arbutina in drugih fenolnih metabolitov

Vsebnost fenolov v metanolnih izvlečkih listov medvejke je bila kvantificirana z RP-HPLC z uporabo HPLC-UV/Vis sistema (LaChrom Merck Hitachi L-7400) s Kinetex 5 µm-EVO C18(250 mm × 4,6 mm ) kolono in absorbanco, določeno pri 280 nm. Ekstrakti iz vzorcev, zbranih v letih 2014 in 2015, so bili razredčeni 1:10 (v/v) in vbrizgani z mobilno fazo metanola in acetonitrila. Gradientni program je obsegal 0–5 minut, 25 odstotkov metanola; 5–6 min, 100 odstotkov; 6–10 min, 100 odstotkov; in 10–20 minut, spet 25 odstotkov metanola. Hitrost pretoka je bila 1 ml/min in volumen injekcije 20 µL. V teh pogojih je retencijski časarbutinje bil 2,6 min, kar nam je omogočilo določitev koncentracije te spojine z uporabo umeritvene krivulje, ugotovljene s 6 razredčitvami standarda, od 40 do 340 µg/g, s korelacijskim koeficientom r=0. 9997. Izvlečki iz vzorcev, zbranih leta 2016, so bili analizirani z uporabo mobilne faze metanola in vode z naslednjim gradientnim programom: 0–5 min, 10 odstotkov metanola; 5–6 min, 20 odstotkov; 6–10 min, 20 odstotkov; 10–11 min, 30 odstotkov; 11–15 min, 30 odstotkov; 15–16 minut, 40 odstotkov; 16–20 min, 40 odstotkov; 20–21 min, 50 odstotkov; 21–25 min, 50 odstotkov; 25–26 min, 60 odstotkov; 26–30 min, 60 odstotkov; 30–31 minut, 10 odstotkov; in 31–36 min, spet 10 odstotkov metanola. V teh razmerah smo določiliarbutin indruge 4 fenolne spojine: kofeinska kislina, katehin, miricetin in kvercetin-3-O-glukopiranozid z uporabo ustreznih umeritvenih krivulj, določenih s 5 razredčinami standardov (25–500 µg/mL) , ki je pokazal korelacijske koeficiente {{10}}.9992 za katehin (retenzijski čas 12.0 min), 0,9924 za kofeinsko kislino (retenzijski čas 13,4 min), 0,9981 za kvercetin{{16} }O-glukozid (retenzijski čas 23,4 min) in 0,9997 za miricetin (retenzijski čas 25,1 min).

Metanol in acetonitril sta bila razreda HPLC in kupljena pri Panreac (Barcelona, ​​Španija). Standardi (čistost večja ali enaka 98 odstotkom)arbutin, kofeinska kislina in galna kislina ter reagent Folin–Ciocalteu so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (Barcelona, ​​Španija). Katehin in kvercetin-3-O-glukopiranozidni standardi so bili kupljeni pri Extrasynthese (Genay Cedex, Francija), medtem ko je bil miricetin kupljen pri Alfa Aesar (Karlsruhe, Nemčija).

Rezultate kemijskih določitev smo analizirali s programsko opremo SPSS v. 25 in R 3.5.2. Po testiranju podatkov za normalnost in homoskedastičnost smo izvedli analizo variance različnih naborov podatkov in teste ločevanja srednjih vrednosti (Tukey in Tamhane) ali neparametrične teste kot Kruskal–Wallis in Dunn večkratni primerjalni test z Bonferronijevim popravkom. Ocenili smo tudi korelacijske koeficiente (Pearson ali Spearman, odvisno od tega, ali so podatki sledili normalni porazdelitvi) med spremenljivkami, vključno z velikostjo genoma.

CISTANCHE IMA ANTIOKSIDACIJSKE UČINKE

3.4. Ocene velikosti genoma in sekvenciranje DNK

Velikost genoma rastlin medvejke je bila ocenjena s pretočno citometrijo v Centers Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) po postopkih, razloženih v Pellicer et al. [62]. Petunia hybrida Vilm. Kot notranji standard je bil uporabljen 'PxPc6' (2C=2.85 pg). Semena standarda je zagotovila Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS—I2BC (Gif-sur-Yvette, Francija). Vsebnost jedrske DNK (2C) je bila izračunana tako, da se znana vsebnost DNK standarda pomnoži s kvocientom med položaje vrhov (način) ciljne vrste in standarda v histogramu intenzivnosti fluorescence, ob predpostavki linearne korelacije med fluorescenčnimi signali iz obarvanih jeder neznanega vzorca, znanim internim standardom in količino DNA [63].

Približno 20 mg s silicijevim dioksidom posušenega listnega tkiva je bilo uporabljeno za ekstrakcijo DNK z uporabo CTAB protokola [64] z manjšimi modifikacijami. Kakovost celotne DNK smo preverili s spektrofotometrom NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, ZDA). Plastidne medgenske regije rpl32-trnLand psbE-petN, kot tudi jedrska ribosomska DNA regija ITS, so bile pomnožene in sekvencirane za tri posameznike na populacijo. Sekvence ITS niso pokazale variabilnosti znotraj 105 analiziranih posameznikov, razen nekaj položajev, ki kažejo intragenomske nukleotidne polimorfizme. Zato je bila ta regija jedrske ribosomske DNK izključena iz nadaljnje analize. Testirana so bila tudi druga področja plastidne DNA (tj. ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; in trnL-trnF), vendar so bila zavržena zaradi majhne variabilnosti ali težav s sekvenciranjem. Postopek pomnoževanja je bil izveden, kot je opisano v Vitales et al. [65]. Neposredno sekvenciranje pomnoženih segmentov DNA je bilo izvedeno z Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, Kalifornija, ZDA) na Unitatde Genòmica, CCiTUB, na analizatorju DNA ABI PRISM 3700 (PE Biosystems). Sekvenci rpl32-trnL in psbE-petN sta bili sestavljeni z BioEdit različico 7.1.3.0 [66], poravnani s ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] in prilagojeni ročno. Pristopne številke GenBank so navedene v tabeli S2.

3.5. Velikost genoma in genetska analiza

Izveden je bil neparametrični Kruskal–Wallisov test, da bi preverili statistično pomembne razlike v vrednostih 2C med populacijami. Izvedeni so bili tudi Dunnovi večkratni primerjalni testi, da bi ugotovili, katere populacije so med seboj pokazale pomembne razlike. Bonferronijev popravek je bil uporabljen za zmanjšanje napake tipa I (lažno pozitivno).

Parametri genetske raznovrstnosti (polimorfna mesta, informativna mesta za varčevanje, število haplotipov in skupna raznolikost haplotipov) so bili ocenjeni z uporabo DnaSP v6 [68]. Plastidni haplotipi so bili določeni v kombiniranem naboru podatkov, ki je vključeval obe regiji rpl32-trnL in psbE-petN. Indeli so bili kodificirani s FastGap v.1.2 [69] in obravnavani kot dogodki z eno mutacijo. Evolucijska razmerja med haplotipi so bila sklepana na podlagi varčnega omrežja, zgrajenega z uporabo TCS [70], kot je implementirano v PopArt [71]. Največje število razlik, ki izhajajo iz posameznih substitucij med haplotipi, je bilo izračunano s 95-odstotnimi mejami zaupanja.

Za analizo razmerja med genetskimi in kemičnimi podatki je bil izveden Mantelov test. Najprej smo ocenili fenotipsko razdaljo med 25 populacijami z uporabo podatkov iz rastlin medvejke, zbranih leta 2016, ki so bili izmerjeni za pet fenolnih komponent (tj.arbutin, katehin, kofeinska kislina, kvercetin in miricetin). Uporabili smo R Commander za standardizacijo teh podatkov [72] in nato za izračun kemične razdalje, izpeljane iz standardizirane matrike s funkcijo "Dist" na R na podlagi evklidskih razdalj. Drugič, Neijeva populacijska genetska matrika razdalje v parih je bila izračunana med 25 populacijami z uporabo DnaSP v6. Nazadnje smo izračunali parne geografske razdalje med temi populacijami z uporabo paketa "geodist" v R. Parne korelacije med matrikami razdalj smo izračunali z uporabo Mantelovega testa z 10,000 permutacijami s funkcijo mantel, ki je na voljo v paketu R "vegan" [ 73].

4. Sklepi

Vse analizirane rastline medvejke so pokazalearbutinvsebnost nad 7 odstotkov; zato je ta rastlinski material primeren za zeliščne pripravke. Naša analiza je pokazala višje vsebnosti arbutina od tistih (do 9 odstotkov), ki so jih navedli Parejo et al. [40], ki je analiziral štiri populacije v severovzhodnih Pirenejih na nadmorski višini 1580–2030 m in zaznal majhne razlike v vsebnosti arbutina med populacijami. Poleg tega je večina tukaj določenih vrednosti v območju rastlinskega materiala, izbranega za gojenje na Poljskem [74], in v skladu z visokoarbutinVsebnost španskih vzorcev listov medvejke sta poročala Sonnenschein in Tegtmeier [42] pri izbiri rastlin za gojenje v Nemčiji. Elitne genotipe A. uva-ursi je bilo mogoče vegetativno razmnoževati, vendar je večina pridobljenih klonov propadla med vzpostavitvijo polja, kar je omejevalo izkoriščanje teh virov. Opisali smo tudi obstoječe razlike v vsebnosti treh flavonoidov (katehin, miricetin in kvercetinglukozid) ter kofeinske kisline med španskimi populacijami medvejke in kako podnebni dejavniki (predvsem globalno sevanje in padavine), ki so povezani z zemljepisno širino in nadmorsko višino prelivi, vplivajo na to variacijo. Hkrati je bila genetska in citogenetska diferenciacija populacij kljub nizki stopnji variabilnosti haplotipa in velikosti genoma, določeni pri iberski A. uva-ursi, šibko, vendar pomembno povezana s fitokemično raznolikostjo. Na splošno ti rezultati poudarjajo, da je treba upoštevati učinek tako genetskih kot abiotskih dejavnikov, da bi razložili intraspecifično fitokemično variabilnost, ki jo najdemo v rastlinah iz divjih populacij.

CISTANCHE UČINKI

Reference

1. Moore, BD; Andrej, RL; Külheim, C.; Foley, WJ Razlaga intraspecifične raznolikosti v sekundarnih metabolitih rastlin v ekološkem kontekstu. Novi Phytol. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier, V.; Comte, G.; Davies, KM; Lattanzio, V. Rastlinski fenoli: nedavni napredek pri njihovi biosintezi, genetiki in ekofiziologiji. Plant Physiol. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. Bernal, M.; Llorens, L.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. Višinske in sezonske spremembe fenolnih spojin v listih in kožicah Buxus sempervirens. Plant Physiol. Biochem. 2013, 70, 471–482 [CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (ur.) List Uva-ursi. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Standard za analizo, nadzor kakovosti in terapevtiko; Ameriška zeliščna farmakopeja: Scotts Valley, CA, ZDA, 2008; 30p.

5. Evropska agencija za zdravila. Poročilo o oceni Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. folij. EMA/HMPC/750266/2016; Evropska agencija za zdravila: Amsterdam, Nizozemska, 6. 2018. Kanlayavattanakul, M.; Lourith, N. Rastline in naravni izdelki za zdravljenje kožne hiperpigmentacije - pregled. Planta Med. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. Migas, P.; Krauze-Baranowska, M. Pomen arbutina in njegovih derivatov v terapiji in kozmetiki. Phytochem. Lett. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; Jung, JH; Lee, JE; Jeon, EJ; Kim, W.; Park, CS Biotehnološka proizvodnja arbutina (- in -arbutina), sredstev za posvetlitev kože in njihovih derivatov. Appl. Microbiol. Biotehnologija. 2012, 95, 1417–1425.[CrossRef]

9. Žu, X.; Tian, ​​Y.; Zhang, W.; Zhang, T.; Guang, C.; Mu, W. Nedavni napredek pri biološki proizvodnji -arbutina. Appl. Microbiol. Biotehnologija. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. Sekundarni metabolizem v rastlinskih celičnih kulturah. V Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 2. izdaja; Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, ur.; Elsevier: London, VB, 2017; 2. zvezek, str. 462–467. [CrossRef]

11. Kurkin, VA; Ryazanova, TK; Daeva, ED; Kadentsev, VI Sestavine listov Arctostaphylos uva-ursi. Chem. Nat. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. Panda, A.; Petrucci, R.; Marrosu, G.; Multari, G.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS presnovno profiliranje Arctostaphylos pungens in Arctostaphylos uva-ursi: primerjalna študija fenolnih spojin iz metaboličnega ekstrakta listov. Fitokemija 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Olennikov, DN; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein in druge fenolne spojine iz Arctostaphylos uva-ursi.Chem. Nat. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Brewer, MS Naravni antioksidanti: viri, spojine, mehanizmi delovanja in možne uporabe. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. Amarowicz, R.; Pegg, RB; Rahimi-Moghaddam, P.; Bare, B.; Weil, JA Sposobnost čiščenja prostih radikalov in antioksidativna aktivnost izbranih rastlinskih vrst iz kanadskih prerij. Food Chem. 2004, 84, 551–562.[CrossRef]

16. Carpenter, R.; O'Grady, MN; O'Callaghan, YC; O'Brien, NM; Kerry, JP Ocena antioksidativnega potenciala izvlečkov grozdnih pečk in medvejke v surovi in ​​kuhani svinjini. Meat Sci. 2007, 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Mekini´c, IG; Skroza, D.; Ljubenkov, I.; Katalini´c, V.; Šimat, V. Antioksidativni in protimikrobni potencial fenolnih metabolitov iz tradicionalno uporabljenih mediteranskih zelišč in začimb. Foods 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. Mohd Azman, NA; Gallego, MG; Segovia, F.; Abdullah, S.; Shaarani, SM; Almajano, MP Študija lastnosti izvlečka listov medvejke kot naravnega antioksidanta v modelni hrani. Antioksidanti 2016, 5, 11.[CrossRef] [PubMed]

19. Pegg, RB; Amarowicz, R.; Naczk, M. Antioksidativna aktivnost polifenolov iz ekstrakta listov medvejke (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) v mesnih sistemih. V fenolnih spojinah v hrani in naravnih zdravstvenih izdelkih; Shahidi, F., Ho, CT, ur.; American Chemical Society: Washington, DC, ZDA, 2005; str. 67–82.[CrossRef]

20. Wrona, M.; Blasco, S.; Becerril, R.; Nerín, C.; Prodaja, E.; Asensio, E. Antioksidativni in protimikrobni markerji UPLC®–ESI-Q-TOF-MSE nove večplastne aktivne embalaže na osnovi Arctostaphylos uva-ursi. Talanta 2019, 196, 498–509. [CrossRef]

21. Maier, M.; Olbermann, AL; Renner, M.; Weidner, E. Preverjanje vsebnosti taninov v evropskih zdravilnih zeliščih – nova potencialna sredstva za strojenje v usnjarski industriji. Ind. Prod. 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

22. Boroš, B.; Jakabová, S.; Madarász, T.; Molnár, R.; Galambos, B.; Kilár, F.; Fellinger, A.; Farkas, A. Preverjena HPLC metoda za hkratno kvantifikacijo bergenina, arbutina in galne kisline v listih različnih vrst Bergenia. Chromatographia 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. Miaw-Ling, C.; Chur-Min, C. Istočasno HPLC določanje hidrofilnega belilnega sredstva v kozmetičnem izdelku. J. Pharm. Biomed. Analno 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

24. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. En korak ekstrakcije v kvantitativni analizi listov arbutininske medvejke (Arctostaphylos uva-ursi) s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. MOČ. Rastline sveta na spletu. Dostopno na spletu: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (dostopano 29. aprila 2020).

26. Saleem, A.; Harris, CS; Asim, M.; Cuerrier, A.; Martineau, L.; Haddad, PS; Arnason, metoda JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD za karakterizacijo zdravilnih Ericaceae, ki jo uporabljajo prvi narodi Eeyou IstcheeCree. Phytochem. Analno 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; Szabo, K.; Močan, A.; Crisan, G. Fenolne spojine iz listov petih vrst Ericaceae in njihove povezane biološke uporabnosti in koristi za zdravje. Molecules 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Onda, Y.; Mochida, K. Raziskovanje genetske raznolikosti v rastlinah z uporabo visoko zmogljivih tehnik zaporedja.Curr. Genom. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Iannicelli, J.; Guariniello, J.; Tossib, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; van Barene, CM; Pitta Álvarez, SI; Escandón, AS "Poliploidni učinek" pri vzreji aromatičnih in zdravilnih vrst. Sci. Hortic. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR Raznolikost velikosti genoma in razvoj v kopenskih rastlinah. Raznolikost rastlinskega genoma, Zvezek 2, Fizična struktura, vedenje in razvoj rastlinskih genomov; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, ur.; Springer: Dunaj, Avstrija, 2013; strani 307–322. [CrossRef]

31. Bennett, MD; Leitch, IJ. Količine jedrske DNA v kritosemenkah – napredek, težave in možnosti. Ann. Bot. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. Gregory, TR (ur.) Evolucija genoma; Elsevier: San Diego, CA, ZDA, 2005.

33. Hoang, PN; Schubert, V.; Meister, A.; Fuchs, J.; Shubert, I. Spremembe v velikosti genoma, volumnu celice in jedra, številu kromosomov in lokusih rDNA med duckweeds. Sci. Rep. 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. Knight, CA; Molinari, N.; Petrov, DA Hipoteza omejitve velikega genoma: evolucija, ekologija in fenotip. Ann. Bot. 2005, 95, 177–190. [CrossRef]

35. Pellicer, J.; Hidalgo, O.; Dodsworth, S.; Leitch, IJ Raznolikost velikosti genoma in njen vpliv na razvoj kopenskih rastlin. Genes 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. Carev, I.; Rušˇci´c, M.; Skoˇcibuši´c, M.; Maravič, A.; Šiljak-Jakovlev, S.; Politico, O. Fitokemijska in citogenetska karakterizacija Centaurea solstitialis (Asteraceae) iz Hrvaške. Chem. Biodivers. 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. Cole, IB; Cao, J.; Alan, RA; Saxena, PK; Murch, SJ Primerjave Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora in Scutellaria racemosa: velikost genoma, antioksidativni potencial in fitokemija. Planta Med. 2008, 74, 474–481. [CrossRef]

38. Carvalho, YGS; Vitorino, LC; de Souza, UJB; Bessa, LA Nedavni trendi v raziskavah genetske raznovrstnosti rastlin: Posledice za ohranjanje. Raznolikost 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. Wei, S.; Yang, W.; Wang, X.; Hou, Y. Visoka genetska raznolikost v ogroženi zdravilni rastlini, Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), v zahodnem gorovju Tianshan, Kitajska. Ohranjanje Genet. 2017, 18, 1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; Zhang, JM; Tian, ​​LM; Dong, XG; Zhang, Y.; Qi, D.; Zhang, XS Študija o raznolikosti kloroplastne DNA gojenih in divjih hrušk (Pyrus L.) na severu Kitajske. Drevo Genet. Genomi 2017, 13, 44.[CrossRef]

41. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Sprememba vsebnosti arbutina v različnih divjih populacijah Arctostaphylos uva-ursi v Kataloniji, Španija. J. Zelišča Začimbe Med. Rastline 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. Sonnenschein, M.; Tegtmeier, M. Poskusi udomačitve medvejke (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. Začimbne rastline 2012, 17, 124–128.

43. Chen, HY; Lin, YC; Hsieh, CL Ocena antioksidativne aktivnosti vodnega ekstrakta nekaterih izbranih prehranskih zelišč. Food Chem. 2008, 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Casimiro-Soriguer, I.; Whittall, JB; Narbona, E. O kopičenju flavonoidov v različnih rastlinskih delih: variacijski vzorci med posamezniki in populacijami v obalnem taborišču (Silene littorea). Spredaj. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Martínez-Cadenas, C.; López, S.; Ribas, G.; Flores, C.; García, O.; Sevilla, A.; Smith-Zubiaga, I.; Ibarrola-Villaba, M.; Pino-Yanes, MM; Gardeazabal, J.; et al. Hkratna čistilna selekcija na alelu MC1R prednikov in pozitivna selekcija na alelu v60l za tveganje za melanom pri južnih Evropejcih. Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

46. ​​Jakaoola, L.; Hohtola, A. Vpliv zemljepisne širine na biosintezo flavonoidov v rastlinah. Okolje rastlinskih celic. 2010, 33, 1239–1247. [CrossRef]47. Martz, F.; Peltola, R.; Fontana, S.; Duval, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. Vpliv zemljepisne širine in nadmorske višine na terpenoidno in topno fenolno sestavo iglic brina (Juniperus communis) in ocena njihove protibakterijske aktivnosti v borealnem območju. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. Yang, B.; Zheng, J.; Laaksonen, O.; Tahvonen, R.; Kallio, H. Učinki zemljepisne širine in vremenskih razmer na fenolne spojine v sortah ribeza (Ribes spp.). J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

49. Lätti, AK; Jaakola, L.; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Različica antocianina in flavonola v jagodah bogbil (Vaccinium uliginosum L.) na Finskem. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. Lätti, AK; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Analiza variacije antocianinov v divjih populacijah borovnice (Vaccinium myrtillus L.) na Finskem. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

51. Monschein, M.; Iglesias, J.; Kunert, O.; Bucar, F. Fitokemija rese (Calluna vulgaris (L.) Hull) in njena nadmorska višina. Phytochem. Rev. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. Perry, NB; Burgess, EJ; Rodríguez Guitián, MA; Romero Franco, R.; López Mosquera, E.; Smallfield, BM; Joyce, NI; Littlejohn, RP Seskviterpenski laktoni v Arnica montana: Helenalin in dihidrohelenalinski hemotipi v Španiji. Planta Med. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. Abdala-Roberts, L.; Assmann, S.; Berny-Mier, Y.; Terán, JC; Covelo, F.; Glauser, G.; Moreira, X. Biotski in abiotski dejavniki, povezani z višinskimi variacijami rastlinskih lastnosti in rastlinojedstva pri prevladujočih vrstah hrasta. Am. J. Bot. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. Bentley, J.; Moore, JP; Farrant, JM. Metabolomika kot dopolnilo k filogenetiki za ocenjevanje intraspecifičnih meja v zdravilnem grmu Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae), odpornem na izsušitev. Fitokemija 2019, 159, 127–136. [CrossRef] [PubMed]

56. Šiljak-Jakovlev, S.; Pustahija, F.; Šoli´c, EM; Boguni´c, F.; Muratovič, E.; Baši´c, N.; Catrice, O.; Brown, CS V smeri zbirke podatkov o velikosti genoma in številu kromosomov balkanske flore: C-vrednosti v 343 taksonih z novimi vrednostmi za 252. Adv. Sci. Lett. 2010, 3, 190–213. [CrossRef]

56. Garrido, JL; Alcántara, JM; Rey, PJ; Medrano, M.; Guitián, J.; Castellanos, MC; Bastida, JM; Jaime, R.;Herrera, CM Geografska genetska struktura iberskih kolumbov (gen. Aquilegia). Plant Syst. Evol. 2017, 303, 1145–1160. [CrossRef

57. Listl, D.; Poschlod, P.; Reisch, C. Filogeografija preživelega trdega kamna na evropskih suhih travnikih. PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

59. Olalde, M.; Herrán, A.; Espinel, S.; Goicoechea, P. Filogeografija belih hrastov na Iberskem polotoku.Ecol. Upravitelj 2002, 156, 89–102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH Vplivi klonalnosti na spolno razmnoževanje rastlin. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 2015, 112,8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. Skowyra, M.; Falguera, V.; Gallego, G.; Peiro, S.; Almajano, MP Učinek izvlečkov Perilla frutescens na oksidativno stabilnost modelnih živilskih emulzij. Antioksidanti 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. Pascoal, A.; Quirantes-Piné, R.; Fernando, AL; Alexopoulou, E.; Segura-Carretero, A. Fenolna sestava in antioksidativna aktivnost listov kenafa. Ind. Prod. 2015, 78, 116–123. [CrossRef]

62. Pellicer, J.; Garnatje, T.; Molero, J.; Pustahija, F.; Šiljak-Jakovlev, S.; Vallès, J. Izvor in razvoj južnoameriških vrst Artemisia (Asteraceae); dokazi iz molekularne filogenije, ribosomske DNK in podatki o velikosti genoma. Aust. J. Bot. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Pretočna citometrična analiza vsebnosti jedrne DNA v višjih rastlinah. Phytochem. Analno 1991, 2,143–154. [CrossRef]

64. Doyle, JJ; Doyle, JL Hiter postopek izolacije DNK za majhne količine svežega listnega tkiva. Phytochem. Bull.Bot. Soc. Am. 1987, 19, 11–15.

65. Vitales, D.; Feliner, GN; Vallès, J.; Garnatje, T.; Firat, M.; Álvarez, I. Novo obrobje sredozemskega rodu Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) na podlagi plastidnih in jedrnih označevalcev DNA. Phytotaxa 2018, 349, 1–17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: uporabniku prijazen urejevalnik in program za analizo bioloških zaporedij za Windows95/98/NT. Nukleinske kisline Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

67. Thompson, JD; Higgins, DG; Gibson, TJ CLUSTAL W: Izboljšanje občutljivosti progresivne poravnave večkratnih zaporedij z utežmi zaporedja, položajno specifičnimi kaznimi vrzeli in izbiro matrike uteži. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 4673–4680. [CrossRef]

68. Rozas, J.; Ferrer-Mata, A.; Sánchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Librado, P.; Ramos-Onsins, SE; Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: Analiza polimorfizma zaporedja DNA velikih podatkovnih nizov. Mol. Biol. Evol. 2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, različica 1.2; Oddelek za bioznanosti, Univerza Aarhus: Aarhus, Danska, 2009; Dostopno na spletu: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (dostopano 1. julija 2019).

70. Klement, M.; Posada, DCKA; Crandall, KA TCS: Računalniški program za oceno genealogij genov. Mol. Ecol. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: Programska oprema s polnimi funkcijami za gradnjo omrežja haplotipov. Metode Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. Kako začeti z ukazom R: grafični uporabniški vmesnik z osnovno statistiko za RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

73. Oksanen, J.; Blanchet, FG; Kindt, R.; Legendre, P.; O'Hara, RB; Simpson, GL; Solymos, P.; Stevens, M.; Wagner, H. Vegan: Ekološki paket skupnosti. R paket različica 1.17-4. 2010. Dostopno na spletu: http://CRAN.R-project.org/package=vegan (dostopano 19. septembra 2010).74. Malinowska, H. Izbor medvejke (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) iz naravnih populacij na Poljskem. Acta Soc. Bot. Pol. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]