Fenolne spojine iz listov in cvetov hibiscus roseus: potencialne kozmetične uporabe premalo raziskane vrste

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Uporaba rastlinskih izvlečkov v negovalni kozmetiki je sodoben trend zaradi njihove bogatosti s polifenoli, ki delujejo kot molekule proti staranju. hibiskus vrtnica je trajnica, naturalizirana v Italiji, s čudovitimi nežno rožnatimi cvetovi; njegova fenolna sestava in biološke aktivnosti še niso raziskane. Namen te študije je bil opredeliti in kvantificirati fenole ter ovrednotiti antioksidativno delovanje, zaščitni faktor pred soncem (SIPF) in anti-kolagenazne aktivnosti etanolnih izvlečkov listov in cvetov H. roseus (HL) in cvetov (HE). Derivati ​​kumarinske, klorogenske in transferulne kisline ter flavonoida kvercetina in kemferola so bile glavne odkrite fenolne spojine. Odkriti so bili katehin, epikatehin, kaempferol-3-O-rutinozid, kaempferol-3-O-glukozid, kaempferol-7-O-glukozid, salidrozid, oenin in peonidin-3-O-glukozid le pri HF, medtem ko je bil floridzin izključen iz HL, ki je pokazal tudi večje količine derivatov hidroksicimetne kisline. HF je bil bogatejši s flavonoidi in skupnimi fenoli, prav tako je pokazal večjo antioksidativno zmogljivost.bioflavonoidiSPF in antikolagenazna aktivnost obeh izvlečkov sta bili podobni in primerljivi s tistimi pri sintetičnih standardih. Skupni rezultati kažejo, da so izvlečki H. roseus obetavni viri bioaktivnih fenolnih spojin, ki bi jih lahko uporabili kot sredstva proti staranju v kozmetiki za nego kože.

Ključne besede:proti kolagenazi; antioksidant; flavonoidi; rože; zeliščna kozmetika; hidroksicimetne kisline; LC-MS/MS-MRM; listi; nega kože; zaščito pred soncem

1. Uvod

Uporaba kozmetike je starodavna in njena zgodovina se oblikuje vzporedno s zgodovino človeštva [1,2]. Kozmetični izdelki za nego kože so nekateri najpomembnejši izdelki, glavna kategorija v tej industriji [1,3]. Zato je zanimanje za nego kože postalo zelo razširjeno, kar je sprožilo povpraševanje po učinkovitih izdelkih iz naravnih virov [2].

Za več informacij kliknite tukaj

Nedavna ozaveščenost o okolju, skrbi za zdravje in manjši uporabi sintetičnih kemikalij je povzročila vse večje zanimanje za rastlinsko kozmetiko, ki zdaj predstavlja eno tretjino celotnega kozmetičnega sektorja [1A]. Tako je uporaba rastlinskih izvlečkov in njihovih fitokomponent kot učinkovin sodoben »proekološki« pristop [5,6]. Naraščajoče povpraševanje po teh izdelkih je lahko posledica zmanjšanih stranskih učinkov, širokega spektra delovanja v kombinaciji z visoko učinkovitostjo in na splošno nizkih cen [7,8].

Rastline so bogate z več razredi bioaktivnih spojin, saj so eden najbogatejših virov novih sestavin, odgovornih za zdravljenje številnih bolezni [9,10]. Poleg tega so rastline tudi viri naravnih vlažilcev, arom in pigmentov, zaradi česar so zelo zanimive za kozmetične aplikacije [5]. Nazadnje, rastlinski izvlečki na splošno veljajo za varne in izpolnjujejo zahteve regulativnih organov [10,11].

Med spojinami, prisotnimi v rastlinskih izvlečkih, so fenoli pridobili posebno pozornost kot aktivne sestavine [12,13], predvsem zato, ker izstopajo kot protivnetna, protimikrobna in antioksidativna sredstva [14,15]. Zaradi teh lastnosti so idealne preventivne in zdravilne molekule za kožne bolezni, ki se uporabljajo v kozmetologiji in dermatologiji [16]. Opazna antioksidativna aktivnost fenolov je delno odgovorna tudi za njihove učinke proti staranju, ki so verjetno posledica njihove sposobnosti zmanjšanja razgradnje kolagena in zagotavljanja UV zaščite [16]. Zato so raziskovali in spodbujali uporabo naravnih izvlečkov, bogatih s fenoli, z visoko antioksidativno zmogljivostjo za nadomestitev sintetičnih antioksidantov v izdelkih za kožo [12].

Cistanche lahko upočasni staranje

Naravni izdelki, pridobljeni iz rastlin družine Malvaceae, se uporabljajo po vsem svetu, rod Hibiscus pa je pridobil veliko pozornosti zaradi številnih farmakoloških aktivnosti svojih izvlečkov in visoke vsebnosti fenolov [17-19]. Hibiskus spp. vsebuje približno 240 vrst enoletnih ali trajnih cvetočih zelišč, grmovnic ali dreves, ki so razširjene v različnih regijah sveta [20]. Izvlečke hibiskusa so v tradicionalni medicini uporabljali kot mehčala za zdravljenje številnih kožnih bolezni in opeklin [19,21].kupi cistancheNa podlagi teh literaturnih podatkov so izvlečki iz Hibiscus sp. rastline so lahko zanimive učinkovine za kozmetične formulacije za kožo, ki ščitijo celice pred oksidativnim stresom, razgradnjo kolagena in škodljivimi učinki UV sevanja.

Čeprav rod Hibiscus obsega veliko vrst, jih je bilo doslej raziskanih manj kot 10 odstotkov [17]. Hibiscus roseus Thore (syn. H.palustris L., H.moscheutos subsp. palustris (L.) RT Clausen.) je zelnata trajnica, naturalizirana v Italiji [22,23] O identifikaciji in opisu H. roseus še vedno potekajo razprave[ 20,23]. Po literaturi je vrsta H. moscheutos subsp. palustris je bil v Evropo uveden že zelo zgodaj, medtem ko ga je v Franciji kot novo vrsto, H. roseus, opisal Thore leta 1807 [23]. Ta vrsta ni bila označena zaradi svoje fenolne sestave in preučevana zaradi njenih bioloških aktivnosti, zaradi česar je potencialno nerazkrit vir bioaktivnih spojin za izdelke za nego kože.

Ljudska uporaba pri zdravljenju kože in širok spekter bioaktivnosti vrst hibiskusa upravičujeta pomen novih študij, osredotočenih na ta rastlinski rod [17]. Zato je bil cilj te študije karakterizirati fenolno sestavo in ovrednotiti antioksidativno sposobnost, zaščito pred soncem in inhibicijsko aktivnost kolagenaze etanolnih izvlečkov listov in cvetov H. roseus. Naši rezultati prvič predstavljajo fenolno sestavo in bioaktivnost H. roseus, povezano s staranjem, kar kaže na potencial te premalo raziskane vrste v medicinski in kozmetični uporabi kot antioksidant in dodatek proti staranju.

2. Rezultati in razprava

2.1.Fenolna karakterizacija in kvantifikacija

Ciljna analiza, ki je temeljila na LC-MS/MS-MRM (tekočinska kromatografija, povezana s tandemsko masno spektrometrijo, ki deluje v načinu spremljanja več reakcij), je bila izvedena za okvirno identifikacijo fenolnih spojin, prisotnih v etanolnih ekstraktih H. roseus, saj fenolna sestava H. roseus ta vrsta še ni bila opisana v literaturi. Devetnajst fenolnih spojin, predhodno opisanih v rodu Hibiscus, je bilo uporabljenih kot standardi (dodatna tabela S1) za razvoj metode MRM, pri čemer je bila izbira najboljših prehodov zasnovana z optimizacijo instrumentalnih parametrov in literaturnimi podatki [24].

The main classes of compounds detected in H.roseus leaf and flower extracts were chlorogenic, p-coumaric, and trans-ferulic acids derivatives and flavonoid derivatives (Figure 1,Table 1), similarly to the previous phytochemical characterization of other Hibiscus species[25-29]. Although the phenolic profile was quite similar, some qualitative differences were observed between flowers (HF) and leaves (HL)(Figure 1 and Table 1). While leaves showed richness in p-coumaric acid derivatives (Figure 1, blue line, peaks with Rt from 2 to 9 min), flowers were especially rich in flavonoid derivatives such as catechins, dihydrochalcones, and anthocyanins (Figure 1, red line, Rt>9,3 min, tabela 1).

Trinajst od devetnajstih ciljnih fenolnih spojin je bilo avtentično identificiranih v ekstraktih, analiziranih z LC-MS/MS v načinu MRM (tabela 1).cistanchMRM je močan način za hkratno določanje več komponent, ki temelji na razmerju med maso in nabojem (m/z) molekularnega iona (((MH]) in njegovega ustreznega hčerinskega iona. Omogoča izboljšanje selektivnosti in občutljivost analiz LC-MS/MS [30] Ta metodologija je zelo zanesljiva in primerna za analize rastlinskih izvlečkov in drugih kompleksnih mešanic, kar zagotavlja najvišjo specifičnost, odlično občutljivost in izjemno zmogljivost multipleksiranja zahvaljujoč možnosti razlikovanja spojin, ki imajo isti matični ioni, vendar različni fragmenti [31, 32] Z uporabo te metode smo dosegli znatno zmanjšanje kromatografskih serij, večjo specifičnost in natančnost, zagotovljeno z dobrim ločevanjem spojin, zaznanih z enakimi prehodi, hkrati pa smo se izognili izgubi občutljivosti v primeru različnih soeluiranih spojin ali za spojine, prisotne v zelo nizki koncentraciji [24,334].

Med 13 fenolnimi spojinami, identificiranimi z uporabo avtentičnih standardov (dodatna tabela S1), jih je bilo deset izključno prisotnih v cvetnih izvlečkih (slika 1 rdeča črta, tabela 1 HF): katehin in epikatehin (vrhovi 16b in 23), klorogenska kislina (vrh 18), peonidin-3-O-glukozid in oenin (vrhova 21 in 22), trans-ferulinska kislina (vrh 27), trije derivati ​​kemferolnega glikozida (kemferol-3-O-rutinozid, kemferol-7-O- glukozid in kaempferol-3-O-glukozid; vrhovi 30, 31b in 32) in salidrozid (vrh 34). Poleg tega je bil floridzin (vrh 33b) odkrit samo v izvlečkih listov (slika 1 modra črta, tabela 1 HL), medtem ko sta bila rutin in kvercetin-3-O-glukozid (vrhova 26b in 28a) identificirana v obeh vrstah izvlečkov (slika 1, tabela 1HF/HL). Podobne derivate kvercetina, kot sta kvercetin-3-O-sambubiozid in izokvercitrin, so že prej opazili v izvlečkih H.sabdariffa [26,29,35,36]in H. rosa-sinensis [18]. Nekateri od teh glikozidov bi lahko ustrezali derivatom kvercetina, ki smo jih odkrili v H. roseus. Poleg tega so tilirozid predhodno odkrili tudi v fenolnih izvlečkih H. cvetovi sabdariffe [37,38]. Oenin (malvidin-3-O-glukozid) in peonidin-3-O-glukozid, dva antociana, ki sta tukaj prvič identificirana v cvetovih H. roseus, sta se razlikovala od prej opisanih v cvetovih H. sabdariffa, delfinidin 3-sambubiozid, delfinidin-3-glukozid in cianidin-3-O-sambubiozid [27,35,39,40]. Vendar je pomembno omeniti, da je najbolj raziskan del cvetov H. sabdariffa je čaša (čašni listi), ne cvetni listi, kot smo jih tukaj preiskali za H.roseus.

Poleg spojin, identificiranih in potrjenih z avtentičnimi ciljnimi standardi, je bilo domnevno identificiranih še 27 spojin v izvlečkih listov in cvetov H.roseus na podlagi njihovega MRM (m/z) in njihovih hčerinskih ionov, tako da so upoštevani dobljeni produkti fragmentacije. iz prekurzorja (dodatna tabela S1). Zlasti je bila v obeh ekstraktih ugotovljena prisotnost derivatov p-kumarne, trans-ferulne in klorogenske kisline ter derivatov kvercetina, pa tudi derivatov floretina in floridzina (tabela 1).

Kvantifikacija fenolov, identificiranih v teh ekstraktih, je bila izvedena z analizo HPLC-DAD (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti, povezana z detekcijo diodnih nizov; tabela 2). Vsebnost derivatov hidroksicimetne kisline (THC) je bila večja v listih kot v cvetovih, medtem ko so bile v cvetovih najdene večje količine flavonoidov (TFC) kot v listih (p<0.001,table 2).catechin="" derivatives(tcd),dihydrochalcones(tdc),and="" anthocyanins="" (tac)="" were="" quantified="" only="" in="" flower="" extracts(table=""><0.001).therefore, flowers="" represent="" a="" greater="" source="" of="" phenolics="" compared="" to="" leaves="" (tpc,p="0.02," table="" 2).="">cistanche AvstralijaPodobno kot pri izvlečkih H. sabdariffa so bili glavni razredi spojin, najdenih v listih H. roseus, derivati ​​klorogenske in p-kumarinske kisline ter kafeoilkininske in p-kumaroilkininske kisline [26,40,41]. Poleg tega so o antocianinih poročali izključno pri Hibiscus spp. cvetov in čaš, skupaj s katehini [19,28,35].

Nasprotno pa so o ferulinski kislini in njenih derivatih manj poročali kot o sestavinah Hibis-cus spp. izvlečki, vendar so lahko zelo pomembni za njihove biološke aktivnosti [6,42-44]. Dejansko so derivati ​​ferulinske kisline, pridobljeni iz različnih vrst hibiskusa, pokazali pomembne farmakološke lastnosti, kot so protivirusne in inhibitorne aktivnosti angiotenzinske konvertaze [43, 44]. Poleg tega je bila ferulinska kislina opisana kot aktivna molekula v izvlečkih H. mutabilis, H. taivanensis [45, 46] in v izvlečkih čašice H. sabdariffa [28, 38].

Kar zadeva možne kozmetične aplikacije, je bilo dokazano, da ferulinska kislina zavira tvorbo melanina [6,42], medtem ko imajo derivati ​​p-kumarinske kisline depigmentacijo [47,48], protivnetno in inhibicijo tirozinaze [49]. Poleg tega številne raziskave poudarjajo dodatne vloge flavonolov in antocianinov, ki lahko delujejo kot zaščitne spojine za kožo, zlasti pri zaviranju melanogeneze [50,51] in s svojim delovanjem kot spojine proti staranju ter preprečujejo melanom [52,53]. Poleg tega bi lahko potencialno uporabo izvlečkov listov H. roseusleaf za kožne motnje povečala tudi prisotnost floridzina, ki je pokazal, da zmanjša izražanje vnetnih citokinov, ki jih povzročajo UVB, na koži, izpostavljeni UV [54].

2.2. Testi antioksidativne aktivnosti

Dandanes je na splošno dokazano, da je kopičenje reaktivnih kisikovih vrst (ROS) odgovorno za procese staranja kože, kar vodi v suhost, izgubo podkožnega tkiva in nastajanje gub [55,56]. Zato je iskanje naravnih potencialnih antioksidantnih spojin, ki jih je mogoče uporabiti v izdelkih za nego kože, zelo pomembno za kozmetično industrijo.

Naši rezultati so pokazali, da imajo izvlečki listov H. roseus nižjo antioksidativno aktivnost (izraženo kot vrednosti ECso) kot cvetovi (tabela 3). Dejansko so bile antioksidativne aktivnosti izvlečkov spodnjic vsaj dvakrat večje od tistih izvlečkov listov v obeh testih (tabela 3). Ti rezultati se ujemajo s fenolno sestavo in vsebnostjo teh ekstraktov (slika 1, tabeli 1 in 2), saj so bili ekstrakti HF bogatejši s fenolnimi spojinami (tabela 2). Dejansko se je korelacijska analiza med vrednostmi ECso in vsebnostjo različnih razredov fenolov izkazala za pomembno in negativno za vse spojine, razen za THC. Tako večje količine flavonoidov, katehinov, antocianinov, dihidrohalkonov in skupne vsebnosti fenolov prispevajo k večjim antioksidativnim zmogljivostim (nižje vrednosti EC50 – tabela 4).

Med flavonoidi so kvercetin in njegovi derivati ​​najbolj uveljavljeni antioksidanti in lovilci prostih radikalov, delujejo pa tudi kot učinkoviti zaviralci oksidaz in lipoksigenaz [57]. Poleg tega so bili dihidrohalkoni, kot je floretin, opisani tudi kot močni antioksidanti v testih za odstranjevanje 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) in odstranjevanja OH [58]. Poleg tega so se antocianini, izolirani iz izvlečkov hibiskusa, izkazali za glavne antioksidativne spojine v človeških celicah [59].

Izvlečki različnih delov vrst hibiskusa so pokazali visoko antioksidativno zmogljivost [18,21,27,35,40]. Frakcije etanolnih ekstraktov H. sabdariffa so pokazale zelo nizke vrednosti EC50 v testih antioksidantov, ki so bile povezane z visoko vsebnostjo protokatehuinske kisline [21,59], klorogenske kisline, flavonoidov in antocianov [24,60]. Poleg tega je študija o H. esculentus pokazala in vitro antioksidativni potencial derivatov kvercetina in katehinov, prisotnih v njegovih izvlečkih[61]. Nazadnje, pri H.acetosella je bila antioksidativna aktivnost močno povezana z vsebnostjo antocianinov [62].

Rezultati naše študije o etanolnih izvlečkih H. roseus so pokazali antioksidativno aktivnost, ki je bila stokrat višja od tistih, o katerih so poročali za vodne izvlečke čašice H. sabdariffl, za katere je bila vrednost EC blizu 45 mg ml- v podobnem DPPH in vitro model [56] Vendar pa je bila za razliko od naših ugotovitev skupna vsebnost flavonoidov in antioksidativna zmogljivost izvlečkov listov H. sabdariffa višja kot pri cvetovih [63,64]. 2.3. In vitro zaščitni faktor pred soncem (SPF)

Ultravijolično sevanje je eden najbolj škodljivih dejavnikov okolja, ki vpliva na zdravje in fiziologijo kože, saj je pomemben zunanji vzrok staranja kože [65,6] Stalna izpostavljenost ultravijoličnemu sevanju poveča tveganje za motnje pigmentacije in fotostaranje kože [67]. To je večinoma posledica povečanja ravni ROS, kar vodi do stimulacije proizvodnje kolagenaze in povzroči znatno škodo celičnim funkcijam kože [56]. Zato se sestavine, ki ščitijo pred UV-žarki, vključno s tistimi, ki so prisotne v rastlinskih izvlečkih, pogosto uporabljajo v kozmetiki, da preprečijo prodiranje ultravijoličnega sevanja v kožo, hkrati pa preprečijo nastajanje ROS, tako da delujejo kot antioksidanti [56,

Enostavna metoda za preverjanje učinkovitosti različnih naravnih sestavin kot UV-filtrov je test zaščitnega faktorja pred soncem (SPF), ki je hitra in zanesljiva in vitro metoda, ki temelji na presejanju absorbance v UV-B spektralnem območju (med 290 in 320 nm), kar je uporabno v zgodnji fazi izbire aktivnih sestavin za fotozaščito [69].

Visoka vsebnost fenolov in antioksidativno delovanje H.koristi cistancheroseus extracts suggest that they may have also an UV absorbing activity. Both leaf and flower extracts of H. roseus at 0.1 mgmL-1 showed comparable SPF results (p>{{0}}.05): 2,6±0,15 za HL in 2,4±0,19 za HF. Ti rezultati so obetavni, saj je standardna formula za zaščito pred soncem, ki vsebuje 8 odstotkov homosalata (široko uporabljena kemična zaščita pred soncem), pokazala vrednost SPF 4[69,70]. Tu najdeni rezultati za H.roseus so bili podobni tistim za druge rastlinske vrste [68,69,71,72] in so pomembni glede na nizko koncentracijo izvlečkov, uporabljenih za testiranje tega učinka.

Izvlečki H. rosa-Sinensis so že pokazali pozitivne učinke proti poškodbam kože miši zaradi ultravijoličnega sevanja s pomočjo antioksidativne zaščite [73]. Naravni izdelki z zaščitnim faktorjem skupaj z visoko antioksidativno zmogljivostjo ter zaviranjem kolagenaze in elastaze so pomembni kandidati za zaščito kože pred fotopoškodbami in preprečevanje pojava gub [66,71]. Pravzaprav je povezava med odobrenim tradicionalnim sončenjem filtri in derivati ​​naravnih virov predstavljajo trend v kozmetični industriji, saj potrošniki te izdelke dojemajo kot varnejše zaradi stranskih učinkov sintetičnih UV-filtrov[72].

Višja vsebnost skupnih fenolnih spojin izvlečkov HF (TPC; tabela 2) bi lahko kazala na njihovo večjo UV absorpcijsko aktivnost. Vendar sta izvlečka listov in cvetov pokazala zelo podobne rezultate, kar kaže, da bi bil fenolni profil izvlečkov bolj kot skupna vsebnost fenolov povezan z zaščito pred UV žarki. Zlasti višja vsebnost derivatov hidroksicimetne kisline v HL( Tabela 2) lahko prispeva k povečanju njihove vrednosti SPF, saj imajo te spojine UV absorpcijo okoli 300-320 nm [74], kar je torej osredotočeno na UV-B območje. Nasprotno pa imajo flavonoidi in antocianini, ki so večinoma prisotni v izvlečkih cvetov, širši spekter absorbance, v katerem sta prisotna vsaj dva pasova, pri čemer je glavni pas v ali blizu vidnega območja, okoli 350 nm za flavonole in 505-550 nm za antociane [53,69]. Dejansko derivate hidroksicimetne kisline proizvajajo rastline, zlasti za njihovo zaščito pred UV sevanjem [75]. Zato lahko ti derivati ​​hidroksicimetne kisline močno prispevajo k absorpciji UV-B na človeški koži [6]. Glede na prisotnost antocianinov in flavonoidov, ki pokrivajo mejni obseg absorpcije valovnih dolžin, vključno z UV-A in vidnimi območji, so lahko izvlečki cvetov H. roseus obetavni za nadaljnjo analizo in razvoj kozmetičnih izdelkov za zaščito pred soncem. Poleg tega bi lahko večja antioksidativna aktivnost, opažena za HF (tabela 3), povečala učinke zaščite pred soncem v morebitnih nadaljnjih formulacijah [69].

2.4. Inhibicijska aktivnost kolagenaze

Both H.roseus extracts showed high collagenase inhibitory activity (>80%)at0.25mg mL-1, which is comparable to that of the synthetic inhibitor 1,10-phenanthroline 1M (Figure 2). The IC50 value of both extracts were very similar( >{{0}}.05), IC50cvetni izvlečki =0.14 ± 0.02 mg ml-1 in IC50 listov ekstrakti =0.13±0,01 mg ml-1, kljub razlikam v fenolni sestavi in ​​vsebnosti (tabeli 1 in 2). To je lahko posledica sinergističnih interakcij med fenoli in kolagenazo, ki bi lahko igrala pomembno vlogo v mehanizmu zaviranja. Poleg tega lahko druge spojine, ki so morda prisotne v izvlečkih H. roseus in tukaj niso analizirane, sodelujejo pri delovanju proti kolagenazi, vključno z vitaminom E in askorbinsko kislino [71,7]. Poleg tega sta dve testirani standardni spojini, klorogenska kislina in kvercetin, katerih derivati ​​so prisotni v izvlečkih listov in cvetov H. roseus (tabela 1), pokazali zelo visoko inhibicijo kolagenaze z vrednostmi ICso 5,8±0,5 in 5,6±0,7ug mL. -l oz. Zato so te spojine lahko odgovorne za opaženo anti-kolagenazno aktivnost. Pomembno je omeniti, da so različni razredi fenolov, ki so prisotni tudi v naših rastlinskih izvlečkih, že pokazali delovanje proti staranju z zaviranjem razgradnje kolagena in prispevanjem k vlaženju kože [78]. Na primer, dokazano je, da ferulinska kislina in njeni derivati ​​vlažijo kožo in spodbujajo sintezo kolagenskih vlaken, kar se uporablja v kozmetiki, kot so kreme proti gubam [6]. Poleg tega so flavonoli, zlasti derivati ​​kvercetina, močni zaviralci encima kolagenaze [79].

Naši rezultati kažejo obetaven učinek izvlečkov H. roseus proti razgradnji kolagena, ki je eden največjih proteinov, odgovornih za izgubo elastičnosti in celovitosti kože ter za nastanek gub [80,81]. Encim kolagenaza zavira ohranjanje elastičnosti in natezne trdnosti kože [82]. Različne študije so dejansko pokazale pomen naravnih antioksidantov zaradi njihove učinkovitosti pri odložitvi prezgodnjega staranja z zaviranjem aktivnosti kolagenaze [78,83].

Izvedene so bile prejšnje študije, ki so ocenjevale učinke vrst hibiskusa pri stimulaciji proizvodnje kolagena in pri zaviranju aktivnosti kolagenaze [56,84,85]. Zaviranje aktivnosti kolagenaze vodnih izvlečkov H. sabdariffa je bilo nedavno opisano v literaturi [56]. Podobno kot pri naših ugotovitvah avtorji niso opazili učinkov inhibicije kolagenaze pri nizkih koncentracijah ekstraktov, ampak le pri znatno visokih koncentracijah [56]. V drugi študiji je bila vrednost ICso pri inhibiciji kolagenaze etanolnih ekstraktov H. sabdariffin 0.75±0.04 mg ml-1[65], kar je aktivnost, ki je skoraj šestkrat nižje od tukaj opisanih za H. roseus.

3. Materiali in metode

3.1. Rastlinski material

Deset rastlin Hibiscus roseus Thore, kupljenih v komercialni drevesnici v Firencah (Italija), je bilo posajenih v 10-litrske lonce, napolnjene s peščeno zemljo (pesek/šota, 60:40, v/v) in vzdrževane v rastlinjaku Ministrstvo za kmetijstvo, prehrano, okolje in gozdarstvo (DAGRI)—Univerza v Firencah (UNIFD, Sesto Fiorentino (Italija,43949/N,1137/E). Rastline so bile ročno gojene v rastlinjaku od januarja do julija 2019 namakanje pri kapaciteti vode v loncu. Iz teh desetih različnih rastlin so bili listi in cvetovi v dveh skupinah zbrani konec julija med obdobjem cvetenja in takoj shranjeni pri -80 stopinjah do ekstrakcije. 3.2 Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka

Liofilizirane vzorce (900 mg) cvetov H.roseus (HF) in listov (HL) smo zmleti v tekočem dušiku in ekstrahirali s 3 × 15,0 ml 75-odstotnega etanola (pH 2,5, uravnan s HCOOH) z ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka (ZAE). ZAE je bil izveden v ultrazvočni kopeli (BioClass@ CP104) z uporabo konstantne frekvence 39 kHz in vhodne moči 100 W, 30 minut, pri 5 stopinjah. Po centrifugiranju (5 min, 9000 vrt/min, 5 stopinj; ALC@4239R, Milano, Italija) smo supernatante razdelili s 3 × 15 ml n-heksana, da odstranimo lipofilne spojine, ki bi lahko motile analizo. Etanolno fazo smo reducirali do suhega, stehtali na digitalni analizni tehtnici (Precisa [125A) in ostanek resuspendirali z nakisano raztopino metanol/voda (1:1 v/v, pH 2,5, uravnan s HCOOH). Postopek ekstrakcije je bil izveden v treh izvodih.

3.3.LC-MS analiza: fenolni profil ekstraktov

Analiza LC-MS je bila izvedena s trojnim kvadrupolnim masnim spektrometrom ABSciex API3000 (AB Sciex LC, Framingham, MA, ZDA), ki je povezan s sistemom HPLC Agilent 1100 z binarno črpalko in samodejnim vzorčevalnikom (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA, ZDA). ). Zajem in redukcija podatkov sta bila izvedena s programsko opremo Analyst 1.6.2 (AB Sciex LLC, Framingham, MA, ZDA).

Ločitev HPLC je bila izvedena na Agilent Phenyl Column (3 × 10 mm; 2,7 um), eluenti pa sta bili (A) nakisana voda (pri pH 2,5, uravnanem s HCOOH) in (B)acetonitril/ voda (90/10, pri pH 2,5, uravnanem s HCOOH). Uporabili smo gradientni sistem topil, kot sledi: 0-3 min, 5 odstotkov B; 3-18 min, 5-40 odstotkov B; 18-28 min, 40 odstotkov B;28-38min, 40-80 odstotkov B; 38-43min, 80 odstotkov B,43-45min, 80-5 odstotkov B, pri pretoku 0,4 mLmin -l. Analiza MS je bila izvedena pod naslednjimi eksperimentalnimi pogoji: Atmosferski tlak kemična ionizacija (APCI) z uporabo ogrevanega vmesnika nebulatorja; Igelni tok （NC）, -5 μA; Razpršilni plin （zrak）, 10 （poljubne enote）; Pomožni plin （zrak）, 3L min-l; Temperatura pomožnega plina (TEM), 550 stopinj; Zavesni plin (CUR, dušik), 6 (poljubne enote); Kolizijski plin (CAD, dušik),9 (poljubne enote, ki ustrezajo 2,6×10~ Torr tlaku trkovne celice).

Identifikacija različnih fenolnih komponent je bila izvedena z uporabo ciljnega pristopa z uporabo metode spremljanja več reakcij (MRM), optimizirane s standardi za 19 ciljnih spojin (izbranih na podlagi prejšnjih študij polifenolne sestave Hibiscus spp. [25,35] ): dva flavan-3-ola (katehin in epikatehin), sedem flavonolov (kvercetagetin-7-O-glukozid, rutin, kvercetin-3-O-glukozid, kemferol-3-O. rutinozid , kaempferol-7-O-glukozid, kaempferol-3-O-glukozid in kvercetin), en cinamat ester (klorogena kislina), dve hidroksicimetni kislini (p-kumarinska in trans-ferulna kislina), dva dihidrohalkona ( floridzin in floretin), en oksiflavon (salidrozid) in štirje antocianini (mirtilin, kuromanin, peonidin-3-O-glukozid in oenin). Retencijski čas in relativni prehodi MRM (kvantifikator in kvalifikator) so bili navedeni v dodatni tabeli S1. Poleg tega so bile predlagane dodatne začasne identifikacije z uporabo neciljanega pristopa, skeniranje kvadrupola od m/z 100 do 100 Da.

3.4. Analiza HPLC-DAD: Kvantifikacija fenolov

Analiza HPLC-DAD je bila izvedena za kvantificiranje različnih razredov fenolov (derivati ​​hidroksicimetne kisline, katehini, dihidrohalkoni, flavonoidi in antociani) v ekstraktih. Alikvoti vzorcev (15 μL) so bili vbrizgani v tekočinski kromatograf Perkin Elmer Flexar, opremljen s kvaterna črpalka 200Q/410 in detektor niza diod (DAD) LC 200 (vsi od Perkin Elmer", Bradford, CT, ZDA). Kromatografski pogoji so bili enaki tistim, uporabljenim za HPLC-MS/MS analize (razdelek 3.3) .

Kromatogrami so bili pridobljeni pri 280,330,350 in pri 520 nm (za kvantifikacijo antocianinov). Identifikacija in kvantifikacija fenolnih spojin je bila izvedena na podlagi retencijskega časa, UV spektralnih karakteristik in primerjave s standardi ter na podlagi literaturnih podatkov [25] in predhodne analize LC-MS. Za kvantificirati različne polifenole, odkrite in identificirane v ekstraktih.Če komercialni standard ni bil na voljo, je bila kvantifikacija izvedena z uporabo umeritvene krivulje standardov iz istega fenolnega razreda, kar je dalo ocenjeno vsebnost.Linearnost krivulj je bila določena s koeficientom determinacije (R4), ki je za vse standarde višja od 0,99.

Vse ekstrakte smo analizirali v treh izvodih in kvantitativne rezultate fenolov podali v mg gl suhe teže (mg gl DW), izraženo kot skupna vsebnost derivatov hidroksi cimetove kisline (THC), skupna vsebnost flavonoidov (TFC), skupni derivati ​​katehina vsebnost (TCD), vsebnost skupnih dihidrohalkonov (IDC), vsebnost skupnih antocianinov (TAC) in vsebnost skupnih fenolov (TPC), ki so bile ocenjene kot vsota posameznih identificiranih spojin, ki pripadajo posameznemu razredu.

3.5. Testi antioksidativne aktivnosti

Test antioksidativne aktivnosti je bil izveden z dvema različnima metodama: DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) in testi odstranjevanja hidroksilnih radikalov (OH) (HRS).

Za test DPPH je bila uporabljena metoda Khandija in Charlesa [{{0}}]. Na kratko, razredčene vzorce ekstraktov (0.5 mL) smo dodali v 0.5 mL raztopine DPPH (0.1 mM v metanolu; Sigma-Aldrich@, St. Louis, MI, ZDA) in zmes pustili reagirati pri sobni temperaturi 40 min v temi. Ta čas (40 min) je bil določen na podlagi rezultatov kinetičnih analiz vsakega ekstrakta ter standardov klorogenske kisline in rutina. Po reakcijskem času smo izmerili absorbanco pri 518 nm s spektrofotometrom PerkinElmer§ Lambda 25UV/VIS. Ocenjeni sta bili tudi vpojnosti slepega (0,5 mL metanola in 0,5 mL vzorcev) in negativne kontrole (0,5 mL metanola in 0,5 mL raztopine DPPH). Vse analize so bile izvedene v treh izvodih. Odstotek antioksidativne aktivnosti je bil izračunan na naslednji način (1).

4. Sklepi

Sekundarni metaboliti so potencialne aktivne sestavine za nove kozmetične formulacije. Med njimi imajo lahko fenolne spojine, ekstrahirane iz rastlin, odlične antioksidativne lastnosti in lastnosti proti staranju, saj so učinkovite pri zaviranju dermalnih encimov (npr. kolagenaze) in pri absorpciji UV-žarkov. Zato lahko premalo raziskani rastlinski izvlečki, kot je H. roseus, predstavljajo nerazkrite vire bioaktivnih molekul.

Dokazali smo, da so listi in cvetovi H.roseus bogati z derivati ​​hidroksicimetne kisline in flavonoidi, cvetovi pa imajo večje količine kaempferol glikozidov, katehinov, dihidrohalkonov in antocianov, vse te spojine pa v literaturi za to vrsto še niso opisane. . Velika antioksidativna zmogljivost, zlasti cvetnih izvlečkov, skupaj z zaščito pred soncem in anti-kolagenazno aktivnostjo izvlečkov listov in cvetov, kaže na obetavno uporabo te slabo raziskane vrste v aplikacijah za nego kože. Za zaključek so naši rezultati pokazali potencial cvetov in listov H. roseus kot virov fenolov ter aktivnost njihovih izvlečkov kot sredstev proti staranju, ki bi jih lahko uporabili kot sestavine za funkcionalne kozmetične izdelke.

Ta članek je izvleček iz Plants 2021, 10, 522. https://doi.org/10.3390/plants10030522 https://www.mdpi.com/journal/plants