Fitokemična analiza, in vitro antiproliferativni, antioksidativni del 1

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Ozadje:Rumex rothschildianus je edini član edinstvenega oddelka rodu Rumex v družini Polygonaceae. Ta vrsta je zelo redka majhna dvodomna enoletnica, endemična za Palestino, ki se tradicionalno uporablja kot hrana in za zdravljenje različnih bolezni. Zato je bila trenutna preiskava namenjena pregledu kemičnih sestavin, antioksidantov, anti-a-amilaze, anti-a-glukozidaze, predvidevanja in citotoksičnih učinkov štirih frakcij topil listov R. rothschildianus.

Metode:Posušen prah listov R. rothschildianus smo ekstrahirali v štirih topilih z različnimi polarnostmi. Za določitev sestavin izvlečkov je bilo izvedenih več kvalitativnih in kvantitativnih fitokemičnih testov. Za kvantitativno določanje fenolov, flavonoidov in taninov smo uporabili kolorimetrično analizo. Izvedeni so bili testi in vitro za ovrednotenje izvlečkov za antioksidant, anti-a-amilazo, anti-a-glukozidazo in predvidevanje inhibitornih aktivnosti ter citotoksičnosti s testom MTS proti celični liniji karcinoma materničnega vratu (HeLa) in celični liniji raka dojke (MCF7).

Za več informacij kliknite tukaj

Rezultati:Najpomembnejša je bila frakcija acetona v listih R. rothschildianusantioksidantaktivnost zaradi najvišje vsebnosti flavonoidov in fenolov z vrednostjo ICso 6,3±0,4 ug/ml v primerjavi s 3,1±0,9 ug/ml za Trolox in glede aktivnost inhibicije lipaze je frakcija acetona pokazala najmočnejšo aktivnost z vrednostjo ICso 26,3±{{10}},6 ug/ml v primerjavi s pozitivno kontrolo orlistata ICso 12,3 ug/ml. Isti ekstrakt je bil najmočnejši zaviralec a-amilaze in a-glukozidaze, z vrednostmi ICso 19,1±0,7 ug/ml oziroma 54,9±0,3 ug/ml v primerjavi do 28,8, 37,1±0,3 ug/in akarboze. Heksanska frakcija je pokazala 99,9-odstotno inhibicijo celic HeLa in 97,4-odstotno inhibicijo celic MCF7.

Zaključek:Acetonska frakcija listov R. rothschildianus je lahko vir bioaktivnih spojin za zdravljenje oksidativnega stresa. Podobno heksanska frakcija kaže na obetaven protitumorski potencial bakterije R. rothschildianus. Jasno je, da te začetne indikacije potrebujejo nadaljnje čiščenje potencialno aktivnih spojin in na koncu študije in vivo za določitev njihove učinkovitosti.

Ključne besede:Rumex rothschildianus, antioksidant, lipaza, amilaza, troloks, fitokemija, antiproliferativno delovanje

Ozadje

Rastline so že od antičnih časov uporabljali kot terapijo. Korenine, semena, lubje, listi in cvetovi so bili uporabljeni v zdravilne namene. V današnjem času so na voljo sintetična zdravila, ki so učinkovita pri zdravljenju najrazličnejših bolezni; vendar nekateri ljudje še vedno raje uporabljajo zeliščna zdravila, saj menijo, da so manj škodljiva za človeško telo [1,2]. Zdravilne rastline so po definiciji vir fitokemičnih spojin, ki imajo terapevtske lastnosti. Te lastnosti so odvisne od prisotnosti različnih sekundarnih metabolitov, kot so fenoli, terpenoidi in alkaloidi [3]. Rumex rothschildianus Aarons. je edini član edinstvenega oddelka rodu Rumex v družini Polygonaceae. Ta vrsta je zelo redka majhna dvodomna enoletnica, endemična v Palestini. Ima povprečno višino 45 cm, zanj pa so značilna pokončna stebla, ki imajo radikalne pecljate liste, ki so na dnu kratko zašiljeni in na vrhu kratko zašiljeni. Cvetovi imajo premer 3-4 mm, pestičasti cvetovi pa imajo premer približno 2 mm in imajo skorjasto membransko plast [4]. Rumex spp. so razširjene v različnih regijah Turčije in jih predstavlja 22 vrst. Nekatere najpogostejše vrste so R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus in R. caucasicus so trajnice, razširjene v srednji in vzhodni Anatoliji na nadmorski višini {{10 }} m nad morsko gladino. Rod Rumex se pogosto uporablja v tradicionalni medicini v Turčiji za zdravljenje motenj, kot so zaprtje, driska in ekcem [5, 6]. Rod ima tudi nekatere odvajalne, diuretične, antipiretične, celjenje ran in protivnetne učinke. Veliko ljudi v vzhodnem delu Turčije uporablja mlade liste Rumex spp. kot konzervans v siru, pa tudi za aromo hrane [7].

Različne raziskave so bile izvedene na vrstah Rumex, na primer o protimikrobnem delovanju nekaterih vrst. Nekatere bioaktivne fitokemikalije so bile že odkrite v Rumex vicarious L, kot so karotenoidi, tokoferoli, polifenoli, flavonoidi in askorbinska kislina, ki imajo vlogo antioksidantov in naravnih sredstev za razstrupljanje. Prehranski vnos antioksidantnih fitokemikalij, kot so karotenoidi,fenoli, inflavonoidilahko zaščiti pred nenalezljivimi boleznimi pri ljudeh, kot so rak, kardiovaskularne motnje in druge zdravstvene težave, povezane z oksidativnim stresom [5, 8]. Znano je, da imajo škodljivi prosti radikali pomembno vlogo pri številnih večjih zdravstvenih težavah, kot so rak, bolezni srca in ožilja, revmatoidni artritis, siva mrena,Alzheimerjeva bolezenin druge degenerativne bolezni, povezane s staranjem. Antioksidanti so koristne sestavine, ki nevtralizirajo te proste radikale, preden lahko napadejo celice, in tako preprečujejo poškodbe celičnih beljakovin, lipidov inogljikovi hidrati. Za zdravljenje človeških bolezni so predlagali različne naravne in sintetične antioksidante. Takšno zanimanje za vlogo antioksidantov pri zdravju ljudi je spodbudilo raziskave na področju živilske znanosti in zdravilnih zelišč, ki ocenjujejo delovanje zelišč kot antioksidantov. Antioksidativno delovanje vključuje sposobnost lovljenja prostih radikalov, zaviranje peroksidacije lipidov, sposobnost keliranja kovinskih ionov in tudi sposobnost zmanjševanja [9,10].

Rak je eden najbolj globalnih zdravstvenih problemov. Razvoj in odkritje novih zdravil proti raku ostajata izjemno pomembna zaradi različnih dejavnikov. Ti dejavniki vključujejo zdravljenja, ki lahko povzročijo velike neželene učinke ali so lahko precej draga. Alternative, ki so biološko varnejše in cenovno dostopnejše, so še vedno zelo zaželene [11-14].

Številne rastlinske vrste veljajo za potencialne vire bioaktivnih molekul, kot so atropin iz listov Belladonna, kokain iz listov koke, vinkristin iz rastline Vinca in mnoge druge, ki imajo še vedno pomembno vlogo v sodobni medicini [15,16].

Koristni terapevtski učinki lahko izhajajo iz mešanja sekundarnih produktov, ki so prisotni v zdravilnih rastlinah. Te spojine so večinoma sekundarni metaboliti, kot so alkaloidi, steroidi, tanini, flavonoidi in fenoli, ki se sintetizirajo in odlagajo v določenih delih teh rastlin [17,18]. Ta študija in vitro raziskuje anti-a-amilaze, anti- -glukozidaze, anti-lipaze, anti-proliferativne in antioksidativne aktivnosti različnih frakcij, ekstrahiranih iz listov R. rothschildianus.

Metode

Rastlinski material, kemikalije in instrumenti

Listi R. rothschildianus so bili nabrani v zahodnih regijah Palestine med februarjem in marcem 2018. Identificiral jih je dr. Nidal Jaradat iz Laboratorija za farmakognozijo na Nacionalni univerzi An-Najah pod oznako vzorca kupona Pharm-PCT{{3} }. Vse kemikalije so bile kupljene pri Sigma-Aldrich. Spektrofotometer-UV/Visible (Jenway stopnja 7135, Stafford-shire, Združeno kraljestvo), filtrirni papirji (Whitman št. 1, Washington, ZDA), stresalna naprava (Memmert 531-25-1, Stockholm, Švedska), rotavap aparat (Heidolph) -VV 2000, Schwa-bach, Nemčija), mlinček (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Kitajska), elektronska tehtnica (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Poljska), zamrzovalni sušilnik-BT85 (Millrock Technology, Kitajska) in krio-eksikator (Mill-rock technology, BT85, Kingston, ZDA).

Priprava ekstraktov in frakcioniranje

Posušen prah listov R. rothschildianus smo ekstrahirali z zaporednim dodajanjem topil glede na njihovo polarnost, začenši z nepolarnim topilom heksanom in nato acetonom (polarno aprotično organsko topilo), metanolom (polarni alkohol) in končno destilirano vodo (a polarno protično topilo). Za vsako ekstrakcijo smo približno 25 g zmletih posušenih listov dali v 0.51 heksan za 72 ur v stresalni napravi pri 100 vrtljajih na minuto pri 25 stopinjah. Najprej je bil heksan nadomeščen z 0,5 L acetona, nato pa je zamenjava vključevala enake količine metanola in vode. Inkubacije v topilih so bile, kot je opisano zgoraj za heksan. Vsako organsko frakcijo smo filtrirali in koncentrirali pod vakuumom na rotacijskem uparjalniku, medtem ko smo vodno frakcijo posušili z uporabo zamrzovalnega sušilnika. Končno so bile vse surove frakcije shranjene pri 4 stopinjah [19, 20].

Dobitek vsake frakcije je bil izračunan po naslednji formuli:

Predhodna fitokemična ocena

Opravljeni so bili fitokemični presejalni testi listov bakterije R. rothschildianus v štirih frakcijah, da bi identificirali aktivne sekundarne metabolite. Kvalitativni rezultati so bili izraženi kot ( plus ) za prisotnost in (-) za odsotnost bioaktivnih fitokemikalij [10,21].

Določanje skupne vsebnosti fenolov (TPC)

Postopek za določanje TPC je temeljil na postopku Cheunga et al. TPC je bil izražen v miligramih ekvivalentov galne kisline na gram suhe teže listov (mg GA/g suhe teže). Sveže pripravljeno 7,5-odstotno raztopino natrijevega karbonata smo naredili tako, da smo v merilno bučko dali 7,5 g Na2CO3 in z destilirano vodo naravnali volumen na 100 ml. Standardno referenčno raztopino (raztopino galne kisline) smo pripravili z raztapljanjem 100 mg galne kisline v destilirani vodi do končne prostornine 100 ml. Iz tega smo izvedli serijsko redčenje, da smo dobili raztopine galne kisline pri 100, 70, 50, 40 in 10 ug/ml). Osnovne raztopine frakcij iz listov smo pripravili tako, da smo 100 mg rastlinskega izvlečka raztopili v destilirani vodi in naravnali na skupni volumen 100 ml. Reakcijske zmesi smo pripravili z mešanjem 0,5 ml vsake frakcijske raztopine z 2,5 ml 10-odstotnega Folin-Ciocalteujevega reagenta, ki smo ga raztopili v vodi z 2,5 ml 7,5-odstotnega natrijevega bikarbonata. Epruvete z vzorci smo inkubirali 45 minut pri 45 stopinjah. Nato smo absorbanco vsakega izmerili v spektrofotometru pri valovni dolžini 765 nm. Delovni vzorci so bili pripravljeni v treh izvodih za vsak analitski poskus, iz katerih so bile izračunane povprečne vrednosti in vrednosti standardnega odklona [21].

Določanje skupne vsebnosti flavonoidov (TFC)

TFC v štirih frakcijah listov R. rothschildianus je bil ocenjen z uporabo umeritvene krivulje rutina (standardna referenčna spojina). Rezultati so bili izraženi kot miligram rutinskega ekvivalenta na gram suhe teže ekstrakta listov (mg RU/g suhe teže). Umeritvena krivulja za rutin je bila določena z uporabo serijskih razredčitev, ustvarjenih iz osnovne raztopine 1{{10}}0 ug/ml. Za pripravo osnovne raztopine smo 10 mg rutina raztopili v 10 ml destilirane vode in nato razredčili na 100 ml. Nato smo osnovno raztopino razredčili, da smo dobili rutin v koncentracijah 10, 30, 40, 50, 70 in 100 ug/ml. Za pripravo delovne raztopine smo 0,5 ml vsake frakcijske raztopine zmešali s 3 ml metanola, 0,2 ml 10-odstotnega AlCl3, 0,2 ml 1M kalijevega acetata in 5 ml destilirane vode ter nato inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut. Prejšnje korake smo ponovili za vsako od frakcij, nato pa smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 415 nm. Za slepo kontrolo smo namesto ekstrakta vzorca pripravili delovno raztopino z destilirano vodo. Vzorci so bili pripravljeni v treh izvodih za vsak analitični poskus, iz katerih so bile izračunane povprečne vrednosti in vrednosti standardnega odklona [22].

Določanje celotne vsebnosti tanina (TTC) Protokol Sun et al. je bil uporabljen za določanje TTC v štirih frakcijah listov R. rothschildianus, kar je najpogosteje uporabljen postopek. Katehin je bil uporabljen kot referenčna spojina za izdelavo umeritvene krivulje. Pripravili smo 100ug/ml zalogo v metanolu, iz katere smo ustvarili serijo razredčitve, da smo dobili koncentracije katehina 10, 30, 50, 70 in 100 ug/ml. Sveže smo pripravili 4-odstotno raztopino vanilina v metanolu. Založne raztopine frakcij pri 100 ug/ml smo pripravili z uporabo metanola kot topila. Za delovno raztopino smo 0,5 ml vsake frakcijske raztopine zmešali s 3 ml raztopine vanilina in 1,5 ml koncentrirane HCl. Zmes smo pustili stati 15 minut in nato izmerili absorbanco pri 500 nm z uporabo delovne raztopine z metanolom namesto ekstrakta vzorca kot slepega. Vse delovne vzorce smo analizirali v treh izvodih, iz katerih smo izračunali povprečne vrednosti in vrednosti standardnega odklona. Skupni tanin v vsaki frakciji je bil izražen v katehinskih ekvivalentih (mg CAE/g suhe teže listov) [23].

Metoda antioksidativne aktivnosti

Za merjenje antioksidativne aktivnosti v različnih frakcijah listov R. rothschildianus je bil uporabljen test za lovljenje prostih 2,2-difenil-pikrilhidrazil (DPPH) radikalov. 1000 ug/ml osnovne raztopine vsake rastlinske frakcije smo pripravili v metanolu. Dodatno smo pripravili tudi 1000 ug/ml raztopino Troloxa (referenčni standard). Za vsako frakcijo smo iz osnovnih raztopin pripravili serijo razredčitev, ki je dala šest serijskih razredčitev pri 2, 5, 10, 20, 50 in 100 ug/ml. En ml vsake raztopine ekstrakta smo zmešali z 1 ml 0,002 g/ml DPPH v metanolu. Dodali smo en ml metanola, da smo dobili končni delovni volumen 3 ml. Raztopina DPPH je bila sveže pripravljena, saj je bila zelo občutljiva na svetlobo. Slepa kontrola serijskih koncentracij je bila DPPH v metanolu v razmerju 1:2, brez dodatka ekstrakta. Vse delovne raztopine smo inkubirali pri sobni temperaturi (25 stopinj) v temi približno 30 minut. Optične gostote smo nato izmerili s spektrofotometrom pri valovni dolžini 517 nm. Naslednja enačba je bila uporabljena za izračun odstotka inhibicije DPPH za vsako rastlinsko frakcijo s Troloxom kot standardno spojino:

kjer je Ag zabeležena absorbanca slepe raztopine in Ats zabeležena absorbanca testirane raztopine vzorca [21].

Test inhibicije pankreasne lipaze prašičev

Založne raztopine 500 ug/ml so bile narejene iz vsake rastlinske frakcije v 10 odstotku DMSO. Iz teh je bila narejena serija razredčitev petih koncentracij 50, 100, 200, 300 in 400 ug/ml. 1 mg/ml osnovne raztopine prašičje pankreasne lipaze v pufru Tris-HCl smo pripravili sveže tik pred uporabo. Substrat, p-nitrofenil butirat (PNPB), smo pripravili z raztapljanjem 20,9 mg v 2 ml acetonitrila. Za vsako delovno raztopino smo 0,1 ml prašičje pankreasne lipaze zmešali z 0,2 ml rastlinske frakcije iz vsakega člana serije razredčitev. Dodali smo Tris-HCl, da je bil končni volumen delovnih raztopin 1 ml, in jih inkubirali pri 37 stopinjah C 15 minut. Po inkubaciji smo v vsako epruveto dodali 0,1 ml raztopine p-nitrofenil butirata. Zmes smo nato inkubirali nadaljnjih 30 minut pri 37 stopinjah. Aktivnost pankreasne lipaze je bila določena z merjenjem hidrolize PNPB v p-nitrofenolat pri 410 nm z UV spektrofotometrom. Isti postopek smo ponovili z uporabo orlistata kot standardne referenčne spojine. Odstotek inhibicije lipaze z rastlinskimi frakcijami je bil izračunan z naslednjo enačbo:

kjer je Ap zabeležena absorbanca slepe raztopine in Ats zabeležena absorbanca testirane raztopine vzorca [24]. test zaviranja a-amilaze

A100 mg vsake frakcije je bilo raztopljeno v nekaj milimetrih 10 odstotkov DMSO in nato nadalje raztopljeno do 100 ml v 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4, 0,006 M NaCl, pH 6,9, da končno dobimo osnovne raztopine s koncentracijo 1000 ug/ml. Iz teh smo pripravili naslednje razredčitve 10, 50, 70, 100 in 500 ug/ml z uporabo 10 odstotkov DMSO kot razredčila. 0,2 ml prostornine 2 enot/ml prašičje pankreasne amilaze smo zmešali z 0,2 ml

rastlinsko frakcijo in smo jo inkubirali 10minuto pri 30 stopinjah. Po inkubaciji smo dodali 0.2 ml sveže pripravljene 1-odstotne raztopine škroba v vodi in epruvete nato inkubirali še vsaj tri minute. Na tej točki smo reakcijo ustavili z dodatkom 0,2 ml barvnega reagenta 3,5-dinitro salicilne kisline (DNSA) in razredčili s 5 ml destilirane vode, preden smo jo 10 minut segrevali pri 90 stopinjah v vodi kopel. Zmes smo nato ohladili na sobno temperaturo in izmerili absorbanco pri 540 nm. Slepo kontrolo smo pripravili z uporabo istih količin, kot so opisane zgoraj, vendar z zamenjavo rastlinske frakcije z 0,2 ml pufra. Akarbozo smo uporabili kot standardno referenco po zgoraj opisanem postopku. inhibitorno aktivnost a-amilaze smo izračunali z naslednjo enačbo:

kjer je Ag: absorbanca slepega vzorca, Ar pa absorbanca preskusnega vzorca [25].

Ta članek je izvleček iz Jaradat et al. Komplementarna medicina in terapije BMC (2021) 21:107