Fitokemična analiza, in vitro antiproliferativni, antioksidativni del 2

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

test zaviranja a-glukozidaze

Naredili smo serijo razredčitev frakcij, da smo dobili koncentracije 100, 200, 300, 400 in 500 mg/ml. Reakcijske zmesi so vsebovale 0,1 ml raztopine 1U/ml -glukozidaze, pomešane z 0,2 ml razredčine ekstrakta in 0,5 ml 100 mM fosfatnega pufra, pH 6,8. Mešanice smo inkubirali pri 37 stopinjah 15 minut. Nato 0,2 ml 5 mM p-nitrofenila-D-galaktopiranozidReakcijski zmesi smo dodali PNPG in inkubacijo podaljšali za nadaljnji 20 minuti pri 37 stopinjah. Reakcijo smo zaključili z dodatkom 0,1 M NazCO3. Za vse vzorce smo zabeležili absorbanco pri valovni dolžini 405 nm. Akarbozo smo uporabili kot pozitivno kontrolo v enakih koncentracijah kot rastlinski izvlečki. Rezultati so bili izraženi kot odstotek inhibicije v skladu z naslednjo enačbo:

kjer je Ag absorbanca brez encimskega inhibitorja, As pa je absorbanca v prisotnosti encimskega inhibitorja [26].

Celične linije in test MTS

Rakave celične linije HeLa in MCF7 so bile pridobljene iz ATCC, celice so bile gojene v mediju RPMI-1640, dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma, 1 odstotkom penicilinskih/streptomicinskih antibiotikov in 1 odstotkom L-glutamina. Celice so gojili v vlažnem ozračju s 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah. Celice so bile zasejane pri 2,6 × 10* celic/vdolbinico v 96-ploščo z vdolbinicami. Po 48 urah so bile celice konfluentne, medij smo zamenjali. Celice smo nato 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami frakcij listov v razponu od 0.25-10 mg/ml R. rothschildianus. Ocenjena je bila viabilnost celic

s testom celične proliferacije (MTS) v 96-stopinjski vodni raztopini CellTilter v skladu z navodili proizvajalca (Promega Corporation, Madison, WI). Na kratko, na koncu zdravljenja smo v vsako vdolbino dodali 20 ul raztopine MTS na 100 ul medija in inkubirali pri 37 stopinjah 2 uri. Absorbance so bile izmerjene pri 490 nm [27, 28].

Za več informacij kliknite tukaj

Statistična analiza

Vsi dobljeni rezultati štirih proučevanih frakcij rastlin (antioksidant, proti lipazi,anti-amilaza, anti-glikozidaza, incitotoksičnostaktivnosti) so bile izražene kot povprečje ± SD standardni odklon; rezultat se je štel za pomembnega, ko je bila p-vrednost<0.05. data="" were="" compared="" using="" unpaired="">

Rezultati

Fitokemični pregled

Rezultati preliminarnih fitokemičnih testov na vodnih frakcijah R. rothschildianus so pokazali prisotnost saponina, fenolov, beljakovin, škroba in flavonoidov. Metanolni ekstrakt je pokazal prisotnost kompleksnih polisaharidov, fenolov, beljakovin in flavonoidov, medtem ko so bili v acetonski frakciji opaženi fenoli, tanini in flavonoidi, v heksanski frakciji pa fenoli, tanini in flavonoidi, glikozidi, terpenoidi in steroidi. kot je prikazano v tabeli 1. Vendar pa je za postopek ekstrakcije metanol pokazal najvišji odstotek izkoristka pri 29,4 odstotka, ki mu je sledila acetonska frakcija pri 16,5 odstotka. Izkoristek vodne ekstrakcije je bil 10,6-odstoten, medtem ko je bil najmanjši izkoristek (7,3-odstoten) heksanske frakcije (tabela 2).

Kvantitativna analiza TPC, TFC in TTC Za oceno TPC, TFC in TTC so bile pridobljene vrednosti absorpcije (Abs) več koncentracij standardov galne kisline, rutinske kisline in katehinov (STD) in glede na te točke , so bile pridobljene tri enačbe za vsako STD v primerjavi z njenimi koncentracijami za izračun celotne vsebnosti fenola, flavonoida in tanina v heksanu, acetonu, metanolu in vodni frakciji R. Rothschildove diagnoze so predstavljene v tabeli 3.

Cistanche lahko izboljša imuniteto

Antioksidativno delovanje

Rezultati ocenjevanja aktivnosti lovljenja prostih radikalov štirih frakcij iz listov R. rothschildianus z uporabo Troloxa kot močne standardne reference antioksidanta so bili izraženi kot odstotek zaviranja DPPH (slika 1 in tabela 4). Zato bi lahko liste R. rothschildianus obravnavali kot rastlinski vir antioksidantov in acetonske frakcije, ki je pokazala vrednost ICso 6,3±0,4 ug/ml. Podobni rezultati so bili pridobljeni tudi za frakcijo heksana, ki je imela vrednost ICso 7,9±1,3ug/ml (tabela 4). Rezultate so primerjali s Troloxom, močno antioksidantno spojino, s prav tako enakim 3,1±0,9 ug/ml. Nasprotno pa je vodna frakcija pokazala le zmerno antioksidativno aktivnost z višjo vrednostjo ICso 19,9±0.7ug/ml, medtem ko je bil metanolni ekstrakt v tem testu neaktiven.

Inhibicijska aktivnost lipaze

V tem preizkusu je bila aktivnost frakcij izvlečka listov R. rothschildianus proti debelosti primerjana z aktivnostjo

orlistat, močno sredstvo za zaviranje lipaze (slika 2 in tabela 4).R. listi rothschildianus so bili odličen alternativni naravni vir zaviralcev lipaze. Acetonska frakcija je pokazala vrednost ICso 26,3±0.6ug/ml, kar je bilo zelo blizu vrednosti referenčne spojine orlistata (12,3±0.3ug/ml). Frakcije heksana in metanola so zabeležile le zmerne vrednosti ICso, enake 39,8±0,3ug/ml oziroma 60,3±0,4ug/ml; medtem ko je bila vodna frakcija neaktivna.

inhibicijska aktivnost a-amilaze

V tem testu so anti-amilazno aktivnost frakcij iz ekstrakta listov R. rothschildianus primerjali z aktivnostjo akarboze, močnega zaviralca a-amilaze (slika 3). Acetonska frakcija je bila najmočnejši zaviralec -amilaze z ICso 19.0±0.7ug/ml v primerjavi z 28,8±1,2 ug/ml za akarbozo, referenčno spojino. To je nakazovalo, da je R. rothschildianus lahko močno zeliščno zdravilo za sladkorno bolezen. Vodna frakcija je v tem testu pokazala le zmerno aktivnost z vrednostjo ICso 45,7±0,3 ug/ml, medtem ko je heksan imel vrednost ICso 354,8±1,2ug/ml. Metanolna frakcija je bila neaktivna proti encimu -amilaza. prav tako so bile izračunane vrednosti za štiri frakcije (tabela 4).

inhibicijska aktivnost a-glukozidaze

Rezultate za a-glukozidazo smo primerjali s tistimi za akarbozo, močno sredstvo za zaviranje encimov, izračunali pa smo tudi vrednosti za štiri frakcije (tabela 4 in slika 4). Acetonska frakcija je imela največji zaviralni učinek na -glukozidazo z ICso 54,9±0,3 ug/ml v primerjavi z akarbozo, referenčno spojino, pri 37,1±{{10} },3 ug/ml. Nasprotno pa je frakcija metanolnega ekstrakta pokazala le zmerno inhibicijo -glukozidaze, z ICso 251,2±0,4ug/ml, medtem ko sta bili heksanska in vodna frakcija v tem testu neaktivni.

Protiproliferativno delovanje

Rezultati zdravljenja rakavih celic HeLa in MCF7 s petimi različnimi koncentracijami v mg/ml za različne izvlečke so pokazali, da je bila aktivnost proti celični liniji raka HeLa boljša kot proti liniji rakavih celic MCF7. Vendar je bil ekstrakt heksana najmočnejši

ekstrakt v koncentraciji 4 mg/ml z odstotki inhibicije 98,9 oziroma 97,4 odstotka proti rakavim celičnim linijam HeLa oziroma MCF7, medtem ko je metanolni ekstrakt v enaki koncentraciji pokazal močno aktivnost proti rakavim celičnim linijam HeLa in MCF7 s 97,2 oziroma 95,6 odstotnim odstotkom inhibicije. Dokumentirana je bila odstotna inhibicija celic HeLa pri izpostavljenosti frakcijam iz listov R. rothschildianus v primerjavi s pozitivnim kontrolnim doksorubicinom (slika 5a). Odstotek inhibicije celic MCF7 je bil podobno določen za štiri frakcije iz listov R. rothschildianus v primerjavi s kontrolo (slika 5b).

Diskusija

Preizkus odstranjevanja radikalov DPPH je dobro znan kot preprosta metoda za odkrivanje antioksidativne sposobnosti v spojinah. DPPH je stabilen prosti radikal, ki daje vijolično barvo v alkoholnih raztopinah in ob redukciji v prisotnosti antioksidantov, ki dajejo vodik, obarva raztopino brezbarvno [29]. Zato bi lahko liste R. rothschildianus obravnavali kot naravni vir antioksidantov, zlasti za acetonsko frakcijo, ki je pokazala vrednost ICso 6,3±0.4ug/ml. Podobne rezultate smo dobili tudi za heksansko frakcijo, ki je imela vrednost ICso 7,9±1,3 ug/ml (tabela 4). Rezultate so primerjali s Troloxom, močno antioksidantno spojino, s prav tako enakim 3,1±0,9 ug/ml. Nasprotno pa je vodna frakcija pokazala le zmerno antioksidativno aktivnost z višjo vrednostjo ICso 19,9±0,7 ug/ml, medtem ko je bil metanolni ekstrakt v tem testu neaktiven. Ti rezultati so bili skladni s prisotnostjo fenolov in flavonoidov v rastlini, močnega lovilca prostih radikalov, kot je prikazano z DPPH v tej študiji. Ti rezultati so bili v skladu z raznolikostjo fenolnih spojin v rastlinah, preprostih fenolov, kot je galna kislina, in bolj sofisticiranih fenolnih kislin, kot so antocianini, hidroksilni derivati ​​cimetove kisline in flavonoidi. Vsi ti razredi spojin so bili deležni obsežne pozornosti zaradi svojih številnih fizioloških funkcij, zlasti lovljenja prostih radikalov, protimutagenega, protivnetnega in antikarcinogenega delovanja [30]. Kot je navedeno v tabeli 3, je acetonski ekstrakt zabeležil najvišjo vsebnost fenolnih spojin in flavonoidov, 28,2±0,8mg GAE/g oziroma 107,3±4,6mg RU/g. Prejšnje poročilo o nekaterih vrstah Rumexa je odkrilo fenolne spojine v etanolnem izvlečku iz listov Rumex vicarious L., ki so bile verjetno vpletene v reakcije prostih radikalov, pri čemer so stabilni uporabljeni radikal DPPH reducirali v rumenkasto obarvan derivat difenil pikrilhidrazina iz prvotne vijolice barva [31].

R. rothschildianus leaves were an excellent alternative natural source of lipase inhibitory agents. The acetone fraction showed an ICso value of 26.3±0.6μg/ml, which was very close to that of the reference compound orlistat （12.3±0.3μg/ml）. Hexane and methanol fractions only re-corded moderate ICso values, equal to 39.8±0.3 μg/ml and 60.3±0.4μg/ml, respectively; while the aqueous fraction was inactive. Pancreatic lipase is a major enzyme involved in enterocyte triglyceride absorption. Therefore, its inhibition represents an important strategy in the management of obesity [32]. Plants rich in phenolic compounds have been screened in several reports for anti-lipase activity. Lipase inhibitory activity ranging from 40 to >70 odstotkov je bilo odkritih s testi in vitro v številnih različnih družinah, vključno s Solanaceae (Solanum tuberosum), Brassicaceae (Brassica nigra in Raphanus sativus), Rosaceae (Malus Domestica Borkh. in Filipendula ulmaria (L.) Maxim.),

(Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. in Ericaceae Vaccinium myrtillus L.), in Fabaceae (Pisum sativum L. in Phaseolus vulgaris L.)[33].

Acetonska frakcija je bila najmočnejši zaviralec -amilaze z ICso 19.0±0.7ug/ml v primerjavi z 28,8±1,2 ug/ml za akarbozo, referenčno spojino. To je nakazovalo, da je R. rothschildianus lahko močno zeliščno zdravilo za sladkorno bolezen. Vodna frakcija je v tem testu pokazala le zmerno aktivnost z vrednostjo ICso 45,7±0,3 ug/ml, medtem ko je heksan imel vrednost ICso 354,8±1,2 ug/ml. Metanolna frakcija je bila neaktivna proti -amilazi. Možna razlaga, da je vodna frakcija dober zaviralec encimov, je bila prisotnost saponinov. Prejšnje znanstvene raziskave so pokazale, da so saponini bioaktivni proti sladkorni bolezni [34]. Močan učinek frakcije acetonskega ekstrakta proti amilazi je lahko posledica visoke vsebnosti fenolnih spojin in flavonoidov. Strokovnjaki Corchorus olitorius zaviralni učinki na amilazo in -glukozidazo zaradi sestavin, zlasti fenolnih spojin, kot je kafeinska kislina [35].

Acetonska frakcija je imela največji zaviralni učinek na a-glukozidazo z ICso 54,9±0,3ug/ml v primerjavi z akarbozo, referenčno spojino, pri 37,1±0,3ug/ml . Nasprotno pa je frakcija metanolnega ekstrakta pokazala le zmerno inhibicijo a-glukozidaze, z ICso 251,2±0.4ug/ml, medtem ko sta bili heksanska in vodna frakcija v tem testu neaktivni. Tretja kategorija peroralnih hipoglikemikov vključuje zaviralce -glukozidaze. Obstajajo številni zaviralci -glukozidaze, kot sta akarboza in vogliboza, ki jih običajno najdemo v rastlinskih virih. Kažejo dragoceno stabilizacijo ravni glukoze v krvi po obroku in se klinično uporabljajo pri zdravljenju sladkorne bolezni [36, 37].

Rezultati zdravljenja obeh rakavih celic (HeLa in MCF7) z različnimi koncentracijami v mg/ml za različne izvlečke so pokazali, da je bila splošna aktivnost proti rakavi celični liniji HeLa boljša od rakave celične linije MCF7. Heksanski ekstrakt je pokazal močno protirakavo delovanje pri koncentraciji 4 mg/ml z odstotki inhibicije 98,9 oziroma 97,4 odstotka proti rakavim celičnim linijam HeLa oziroma MCF7, medtem ko je metanolni ekstrakt v enaki koncentraciji pokazal močno aktivnost proti rakavim celičnim linijam HeLa in MCF7 s 97,2. in 95,6-odstotni odstotek inhibicije. Iz prejšnjih rezultatov je heksanska frakcija imela pomemben citotoksični učinek na celice HeLa in MCF7, pri čemer so odstotki inhibicije dosegli 99 oziroma 92,4 odstotka pri 4 mg/ml koncentracije heksanske frakcije. To je bilo skladno s citotoksičnimi učinki terpenoidov in steroidov, ki so jih našli v heksanski frakciji. Diosgenin, naravno prisoten steroid in triterpenoid, ki ga najdemo v nekaterih rastlinah, dokazano zavira raka dojke [38, 39].

Zaključek

Rezultati te študije na listih R. rothschildianus so pokazali, da ima frakcija izvlečka acetona velik potencial pri zagotavljanju fitoterapije za sladkorno bolezen in debelost, na podlagi njegove močne inhibicije lipaze, a-amilaze in a-glukozidaze. Poleg tega je acetonska frakcija pokazala tudi pomembno aktivnost lovljenja prostih radikalov. Po drugi strani pa je heksanska frakcija pokazala znatno inhibicijo celičnih linij HeLa in MCF7, kar je lahko povezano z visoko vsebnostjo terpenov in steroidov. Ta opažanja v tej študiji bi lahko privedla do nadaljnjih študij in vivo za razvoj novih naravnih farmacevtskih formulacij, učinkovitih pri zdravljenju debelosti, sladkorne bolezni in nekaterih vrst raka.

Ta članek je izvleček iz Jaradat et al. Komplementarna medicina in terapije BMC (2021) 21:107