Predhodno učenje strahu omogoča hitro asimilacijo novih spominov strahu neposredno v kortikalna omrežja 3. del

Eksperimentalna zasnova

Ponovljivost podatkov je bila ocenjena z različnimi ponovitvami (tabela S1). Prvi poskusi inaktivacije CNQX v Te2 (slika 1A–1C) so bili izvedeni v večjem številu ponovitev, ker so bili prvi poskusi, ki smo jih izvedli, in služili za testiranje glavne hipoteze naše študije. Živali so bile a priori razvrščene v različne vedenjske skupine na uravnotežen način teže. Samci iz istega zaroda so bili naključno razporejeni v vsako poskusno skupino. Najprej smo obravnavali glavno hipotezo naše študije, to je, da lahko kortikalna inaktivacija različno vpliva na konsolidacijo novega spomina na strah pri eksperimentalno naivnih podganah in pri živalih, ki so se naučile predhodnega dogodka strahu.

Samci imajo izjemno močan spomin, saj imajo močnejši preživetveni nagon in željo po razmnoževanju. Živali, ki preživijo v divjini, si morajo zapomniti veliko geografskih informacij, vrst hrane, sledi plenilcev in lokacij članov skupine, da se bolje prilagodijo okolju in zaščitijo življenje.

Na primer, levi moški si morajo zapomniti status celotnega ozemlja, članske odnose in lokacije tekmovalcev, da zaščitijo ozemlje in svoj status. Samci zeber si morajo za preživetje in razmnoževanje zapomniti lokacijo vodnih virov in hrane na travnikih. Podjetje s sodami je nekoč objavilo oglas, v katerem je prikazovalo, da se samec polarnega medveda lahko spomni potapljača in njegovega edinstvenega vonja, tako da ga lahko identificira, ko ga naslednjič vidijo.

Zato morajo samci imeti močan spomin v smislu zaščite svojega ozemlja, zagotavljanja dovolj hrane in razmnoževanja potomcev. Zaradi tega so tudi pomembni subjekti v raziskavah ljudi, na primer za raziskovanje bolezni, kot sta okvara spomina in Alzheimerjeva bolezen.

V človeškem svetu se lahko zgledujemo tudi po spominu samcev živali. Stalna izpostavljenost novim stvarem, nenehno učenje in razmišljanje lahko izboljšajo naš spomin in prilagodljivost ter izboljšajo naš življenjski standard in delovno učinkovitost. Zato se učimo od samcev, še naprej nabirajmo znanje in izkušnje, imejmo močne preživetvene nagone in želje po razmnoževanju ter ustvarjajmo boljšo prihodnost. Vidi se, da moramo izboljšati spomin. Cistanche deserticola lahko občutno izboljša spomin, saj je Cistanche deserticola tradicionalno kitajsko zdravilno sredstvo s številnimi edinstvenimi učinki, med katerimi je tudi izboljšanje spomina. Učinkovitost mletega mesa izhaja iz različnih učinkovin, ki jih vsebuje, vključno s kislino, polisaharidi, flavonoidi itd. Te sestavine lahko spodbujajo zdravje možganov na različne načine.

Kliknite Spoznajte načine za izboljšanje delovanja možganov

V primeru statističnih razlik med temi skupinami smo na koncu izvedli dodatne kontrolne skupine z injiciranjem fiziološke raztopine. Podoben pristop je bil uporabljen pri optogenetskih poskusih, kjer je bila kontrolna skupina AAV izvedena šele po odkritju statističnih razlik med naivnimi in predhodno treniranimi podganami. Ti razporedi poskusov so nam omogočili, da smo se izognili nepotrebnim kontrolnim skupinam in uporabi nepotrebnih živali, kar je ključno vprašanje v evropski in italijanski zakonodaji o poskusih na živalih (načelo 3 Rs).

Vedenjski postopki

Vsi poskusi so bili izvedeni v svetli fazi dneva (od 8. do 16. ure). Živali so bile posamično prepeljane iz objekta v poskusne prostore v različnih majhnih prozornih vedrih, odvisno od poskusnih potreb.

Slušni trening: Prva vedenjska seja. Živali, pogojene s slušnim strahom (CS1-CS2). V tej skupini so podgane nežno vzeli iz njihove domače kletke in jih odnesli iz bivališča v zvočno izolirano sobo. Ko so bile tam, so bile živali postavljene v napravo za kondicioniranje, ki je bila sestavljena iz pravokotne črne kletke (35 × 40 cm), opremljene z mrežo palic iz nerjavečega jekla (premera 1 cm, na razdalji 1,5 cm), ki je bila povezana z napravo za dovajanje šoka.

Podgane so pustili nemotene 1 minuto. Po tem času je bilo danih 7 pogojnih dražljajev (CS), sestavljenih iz čistega tona frekvence 15 kHz (vsak traja 15 s, 8 0 dB, 36 s poskusni interval). Zadnja 1 s vsakega tona je bila povezana z bolečim ultrazvokom (0,5 mA, 1 s). Na koncu kondicioniranja so podgane vrnili v domačo kletko.

Živali samo v šoku (šok-CS2). V tej skupini so bile podgane podobno nameščene v isti napravi za kondicioniranje. Takoj zatem je bila vsaka podgana ena za drugo izpostavljena 7-šokom z nogami (1 s, 0,5 mA). Po koncu stimulacije so živali vrnili v domačo kletko. Časovna obstojnost v kondicijski kletki je bila manj kot 9 sekund. Prejšnje študije so pokazale, da ta postopek omogoča izogibanje asociativnim procesom med bolečimi dražljaji in senzoričnimi dražljaji [29,30].

Živali, pogojene s strahom po vonju (vonj-CS2). V tej skupini so podgane postavili v isto pravokotno črno kletko, ki je bila uporabljena v zgornjih poskusnih skupinah, in jih povezali z nastavitvijo za dovajanje šoka. Podgane so pustili nemotene 2 minuti. Po tem času je bilo danih 7 CS, sestavljenih iz vonjev vanilije (vsak je trajal 10 s, poskusni interval 24 s). Zadnja 1 s vsakega vonja je bila povezana z bolečim ultrazvokom (0,5 mA, 1 s). Modul za kondicioniranje je bil nameščen blizu vira prezračevanja, da bi se izognili obstojnosti dostavljenih dražljajev po njihovem odmiku. Kletka je bila zavarovana z zgornjo rešetko. Vonjave so bile predstavljene z uporabo olfaktometra za redčenje toka. Čist zrak (1,5 L/min) je bil usmerjen v elektromagnetni ventil, ki je ob delovanju prevedel zrak v 15 ml steklenico, ki je vsebovala 10 ml vonja vanilije.

Živali samo z zvokom (Tone-CS2). Podgane v tej skupini so postavili v isto črno kletko in jim predstavili ton 15-kHz (7 dražljajev, trajanje 15 s, 36 s ITI), dostavljen v odsotnosti ZDA.

Predizpostavljene živali (Tone-CS1-CS2). Podgane so postavili v kletko za kondicioniranje in 1 minuto kasneje so jim 20-krat predstavili samo ton 15-kHz, 24 ur kasneje pa je bil isti ton združen z US, ki je postal CS1.

Živali s strahom pogojene z belim šumom (WN-CS2). V tej skupini so podgane postavili v pravokotno črno kletko in jih pustili nemotene 1 minuto. Po tem času je bilo danih 7 CS, sestavljenih iz WN (15 s trajanja vsak, 75 dB, 36 s interval med poskusi). Zadnja 1 s vsakega tona je bila povezana z bolečim UZ (0,5 mA, 1 s). Na koncu kondicioniranja so podgane vrnili v domačo kletko.

Slušno učenje strahu: Drugi vedenjski trening. Dva tedna po postopkih, opisanih v zgornjem odstavku, so bile živali usposobljene za drugo drugačno nalogo kondicioniranja slušnega strahu. Podgane smo dali v standardno škatlo za odiranje, kot v našem prejšnjem delu [10], in jih pustili nemotene 2 minuti. Po tem času je bilo dostavljenih 7 CS, sestavljenih iz čistih tonov s frekvenco 3 kHz (vsak traja 8 s, 80 dB, 22 s interval med poskusi). Zadnja 1 s vsakega tona je bila povezana z bolečim ultrazvokom (0,5 mA, 1 s). Na koncu kondicioniranja so podgane vrnili v domačo kletko.

Strah zaradi ohranjanja spomina. Zadrževanje slušnega spomina na strah, ki je bil nedavno pridobljen na CS2 (3 kHz), je bilo testirano 4 dni kasneje. Za eksperimente optogenetike je bil test nedavnega spomina izveden z lasersko dostavo 24 ur po učenju CS2-US po analogiji s časovnim intervalom, v katerem smo izvedli kortikalno inaktivacijo z dajanjem CNQX (tj. 24 ur po usposabljanje). Podgane so navadili na aparat, ki se razlikuje od tistega, ki se uporablja za kondicioniranje, in jih postavili v drugo sobo, da bi se izognili pogojenemu vedenju strahu zaradi kontekstualnih znakov [10,62].

Nova naprava je bila sestavljena iz prozorne plastične kletke s črno pobarvano stranjo, zaprte v škatli za dušenje zvoka, opremljeni z izpušnim ventilatorjem, ki je iz ohišja odstranil vonjav zrak in ustvaril hrup v ozadju 60 dB. Živalim je bilo dovoljeno raziskovati kletko 5 minut na dan med sejo navajanja. Na dan preizkusa ohranjanja spomina na strah smo po 2 minutah prostega raziskovanja oddali 4 CS2 s frekvenco 3 kHz (8 s—22 ITI), ki jim ni sledil noben US.

Če je zahtevalo eksperimentalno povpraševanje, so podgane nato testirali na ohranjanje spomina na strah na daljavo, pridobljenega 2 tedna pred drugim poskusom kondicioniranja slušnega strahu. V ta namen so 7 dni po preskusu ohranjanja spomina strahu na ton 3-kHz živali postavili v novo okolje (črno-belo črtasto kletko) in jim nato predstavili ton 15-kHz. Predstavljeni so bili štirje toni v intervalih 36 s.

Kontekstualno usposabljanje: Prva vedenjska seja. Kontekstualna skupina za pogojevanje strahu (CtxA-CtxB). V tej skupini so podgane nežno vzeli iz njihove domače kletke, jih dali v vedro in odnesli iz bivališča v zvočno izolirano sobo. Ko so bile tam, so bile živali postavljene v napravo za kondicioniranje, sestavljeno iz zgoraj omenjene pravokotne črne kletke, opremljene z mrežo palic iz nerjavečega jekla, ki je bila povezana z napravo za dovajanje šoka. Podgane so pustili nemotene 1 minuto. Po tem času je bilo apliciranih 5 US (0,5 mA, 1 s) s časovnimi intervali 51 s. Ob koncu seje so živali pripeljali nazaj v domačo kletko.

Skupina samo za šok (shock-CtxB). Podgane, ki so bile postavljene v napravo za kondicioniranje, so takoj enega za drugim prejele 5-sunke z nogami (1 s, 0,5 mA). Časovna obstojnost v kondicijski kletki je bila manj kot 7 sekund. Prejšnje študije so pokazale, da ta postopek omogoča izogibanje asociativnim procesom med bolečimi dražljaji in senzoričnimi dražljaji [29,30].

Skupina samo za šok (shock-CtxB). Podgane, ki so bile postavljene v napravo za kondicioniranje, so takoj enega za drugim prejele 5-sunke z nogami (1 s, 0,5 mA). Časovna obstojnost v kondicijski kletki je bila manj kot 7 sekund. Prejšnje študije so pokazale, da ta postopek omogoča izogibanje asociativnim procesom med bolečimi dražljaji in senzoričnimi dražljaji [29,30].

Novo kontekstualno pogojevanje strahu in zadrževanje spomina na nedavni strah. Dva tedna po postopkih, opisanih v zgornjem odstavku, so bile vse skupine usposobljene za povezovanje novega kontekstualnega okolja (modul skinner box, nameščen v drugi sobi) z bolečim ultrazvokom (0,5 mA, 1 s) . Vsako žival so dali v novo komoro in pustili nemoteno 2 minuti. Nato je bil izpostavljen 5 US, ločenim z intervali 30 s.

Zadrževanje kontekstualnega spomina na strah je bilo preizkušeno 4 dni po postopku kondicioniranja strahu, tako da so podgane za 3 minute ponovno postavili v komoro Skinner box. Za optogenetske poskuse je bil test nedavnega spomina izveden z lasersko dostavo 24 ur po učenju CtxB-US po analogiji s časovnim intervalom, v katerem smo izvedli kortikalno inaktivacijo z dajanjem CNQX (tj. 24 ur po treningu). Če je to zahtevalo eksperimentalno povpraševanje, so bile podgane nato testirane glede ohranitve oddaljenega spomina na strah, tako da so živali postavili v kontekst, povezan z ZDA, 2 tedna pred novo povezavo.

Živali so prenašali v 2 različnih vedrih v kondicionirne komore v skladu z različnimi kontekstualnimi postopki.

Ukrep zamrzovanja. V vseh eksperimentalnih postopkih je bila ocena zadrževanja spomina na strah določena kot odziv zmrzovanja [10], analiziran kot popolna odsotnost somatske mobilnosti, razen dihalnih gibov. Za vsako žival sta 2 neodvisna opazovalca, ki sta bila slepa za skupine živali, izmerila čas (v sekundah), preživet v zamrzovanju, brez povezave.

Kirurški posegi

Za dajanje izbranih snovi na ciljna mesta so bile podgane anestezirane z izofluranom: indukcija je bila izvedena pri 4 % [vol/vol] v 2 L/min medicinskega zraka in podaljšana do neprekinjene izpostavljenosti pri 2 % [vol/vol]) ko so bile podgane nameščene v stereotaksični aparat.

Opravljen je bil rez na lobanji in izvrtane majhne luknjice, ki so omogočile penetracijo 28-infuzijske igle. Za dovajanje snovi je bila uporabljena 10-ul Hamiltonova brizga, nameščena na infuzijsko črpalko. Po infuzijah smo iglo pustili na mestu dodatne 3 minute. Zarezo so nato zaprli s sponkami za rane iz nerjavečega jekla in žival je dobila subkutano injekcijo analgetika/protivnetnega ketoprofena (2 mg/kg telesne teže), žival pa je bila na toplem in pod opazovanjem do okrevanja po anesteziji.

Tako kot v prejšnjih študijah [10, 32–34] je bila kanilacija živalim nepotrebna, saj so bile aktivne spojine aplicirane neposredno stereotaksično. Ta postopek ima prednost, ker se izogne ​​kirurški travmi, ki je značilna za postopek trajne kanile, s čimer se travma omeji na penetracijo z eno samo iglo [10,32–34]. Dejansko splošna anestezija ne vpliva bistveno na konsolidacijo spomina [10,32–34]. Da bi zagotovili, da je bil čas dajanja spojin v zvezi s preskušanjem učenja točen, tako da so podgane prejele izbrane spojine okoli 1 ure in približno 1 dan po treningu, je bila anestezija z izofluranom inducirana 5 minut pred časom načrtovane injekcije, npr. pri 55 min pri podganah, zdravljenih 60 minut po treningu, in 23 ur in 55 minut pri živalih, ki so bile injicirane 24 ur po treningu. Vsako podgano smo kondicionirali in nato upravljali ločeno. Živali, ki pripadajo različnim vedenjskim skupinam, so bile manipulirane na prepleten način.

Selektivni zaviralec AMPA/kainatnih glutamatnih receptorjev CNQX ({{0}}ciano-7-nitrokinoksalin-2,3-dion) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] smo raztopili v sterilni fiziološki raztopini (NaCl, 0.9%) in naravnali pH na 7,4 s HCl. Zaviralec sinteze beljakovin anizomicin (Merck, 125 ug/ul) smo raztopili v ekvimolarni HCl, razredčili s sterilno fiziološko raztopino in naravnali pH na 7,4 z NaOH. Kot kontrolo nosilca smo uporabili sterilno fiziološko raztopino (0,9 % NaCl). Te snovi so bile obojestransko injicirane s hitrostjo 0,1 ul/min in prostornino 0,5 ul na mesto na naslednjih stereotaksičnih koordinatah, vzetih iz atlasa Paxinos in Watson [26], pri čemer se kortikalno polje Te2 nanaša na atlas Zilles [25]:

Sekundarni slušni korteks (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Sprednji cingularni korteks (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Volumen injiciranja (0,5 ul na mesto) je bil izbran na podlagi prejšnjih študij, kjer so bile aktivne spojine injicirane v Te2 [10,34] in ACC [55,63] pri odraslih podganah.

Za inaktivacijo dorzalnega hipokampusa so bile aktivne spojine injicirane v volumnu 0,6 ul na mesto pri naslednjih stereotaksičnih koordinatah:

Dorzalni hipokampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Ireverzibilne lezije dorzalnega hipokampusa so bile inducirane z dajanjem NMDA (Tocris, 18 ug/ul, raztopljen v sterilni fiziološki raztopini, 0, 4 ul na mesto) s hitrostjo 0,1 ul/ min na točkah na zgoraj navedenih koordinatah. Iste koordinate so bile uporabljene za kontrole s fiziološko raztopino in lažno operirane živali.

Red Retrobeads (Lumafluor, razredčitev 1:2 v fiziološki raztopini, 0,6 ul) smo vbrizgali v BLA v skladu z naslednjimi koordinatami: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

Na koncu poskusov so bile histološko potrjene sledi igel v primeru injekcij CNQX, anizomicina ali fiziološke raztopine ali razširitev lezij v primeru injekcij NMDA. Podgane so bile globoko anestezirane in intrakardialno perfundirane s 4% formaldehidom. Njihovi možgani so bili razrezani na 30 μm na kriostatu. Serijske reze, obarvane z Nisslom, smo pripravili z uporabo običajnega postopka in reze histološko preverili pod mikroskopom, povečanim pri 2, 5 ×.

Optogenetski poskusi

Injekcija virusa. Adeno-povezan virus AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-češnja in kontrolni vektor AAV5:CaMKII -češnja sta bila pridobljena z University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, Severna Karolina, Združene države Amerike). Ta stavek Virusni titer je bil 5:8 Virusni titer je bil 5,8 × 10^12 vg/ml za oba virusa. Uporaba promotorja CaMKII omogoča ekspresijo transgena, ki daje prednost piramidnim nevronom. Virusi so bili nameščeni v zamrzovalniku -80˚C. Virusne infuzije, ki ciljajo na Te2 ali ACC, so bile izvedene na zgornjih stereotaksičnih koordinatah pri volumnu 0,5 ul za vsako luknjo. Virus smo injicirali s hitrostjo 0,1 ul/min in iglo pustili na mestu dodatnih 5 minut. Virusne injekcije so bile izvedene 4 tedne pred optogenetskimi poskusi.

Osvetlitev.

Optična vlakna (Plexon, jedro 200/230 μm; dolžina 10 mm) so bila obojestransko implantirana v BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm iz bregme). Optogenetska inhibicija projekcij Te2 na BLA ali projekcij ACC na BLA je bila dosežena z uporabo PlexBright optogenetskega stimulacijskega sistema, povezanega z lasersko diodo (Laserglow Technologies). Rumena svetloba (589 nm) se ustvari in preide skozi optično vlakno. Ocenjena gostota moči na konici optičnega vlakna je bila 10 do 15 mW za osvetlitev projekcijskih mest. Med zadrževanjem spomina na strah se je oddajanje svetlobe začelo 4 s pred začetkom tona, vztrajalo skozi ton in se ustavilo 4 s po odmiku tona. Živali, ki pripadajo skupinam kontekstualnega pogojevanja strahu, so bile deležne svetlobne stimulacije med celotnim raziskovanjem konteksta (3 min). Podgane so bile seznanjene s povezovalnim kablom 2 dni pred poskusom ohranjanja spomina.

Imunohistokemija. Po zaključku optogenetskih poskusov so bile podgane globoko anestezirane in intrakardialno perfundirane s 4 % PAF, da bi preverili širjenje virusa. Možgani so bili razrezani, shranjeni čez noč pri 4 °C in končno preneseni v 30 % saharozo. Koronalne odseke (30 μm) smo izrezali na kriostatu in zbrali v PBS. Prosto lebdeče odseke smo inkubirali v raztopini za blokiranje 1 uro pri sobni temperaturi. Nato so jih inkubirali v primarnih monoklonskih mišjih protitelesih proti mCherry (razredčitev 1:500, Abcam) v raztopini za blokiranje čez noč pri sobni temperaturi. Nato smo sekcije sprali s PBS in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi s sekundarnim fluorescenčnim AlexaFluor-568 protitelesom proti miši (1:600, Invitrogen), razredčenim v PBS. Sekcije so bile oprane v PBS, nameščene z montažnim medijem, ki je vseboval DAPI (vektor), in pokrovno stekelce.

Podobno so bili zbrani možgani podgan, ki so bile podvržene injekcijam NMDA. Prosto lebdeče odseke smo po več izpiranjih inkubirali s primarnim monoklonskim mišjim protitelesom proti Neunu (1:1, 000 razredčitev, Merck) v raztopini za blokiranje čez noč pri sobni temperaturi. Nato smo sekcije sprali s PBS in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi z biotiniliranim konjskim protimišjim protitelesom (1:200 razredčitev, Vector). Kompleks avidin-biotin (ABC kompleks 1:100, Vector, 2 uri in polovica inkubacije) smo povezali z diaminobenzidinom (0,03%, Merck), da smo obarvali Neun. Odseke smo nato splaknili v PBS in prenesli na stekelca, prevlečena z želatino, dehidrirali in prekrili s pokrovnim stekelcem.

Odseki Te2 podgan, ki so jim vbrizgali retro kroglice, so bili inkubirani s primarnim poliklonskim zajčjim protitelesom proti Fos (1:2, 000, celično signaliziranje) v raztopini za blokiranje čez noč pri RT. Nato smo rezine sprali s PBS in inkubirali 1 uro pri RT z anti-kunčjim Alexa 488 (1:1, 000, Invitrogen, v PBS). Nazadnje smo imunsko označene odseke sprali v PBS, namestili na stekelca, prevlečena z želatino, in prekrili z montažnim medijem, dopolnjenim z DAPI.

mikroskopija

Označevanje mCherry je bilo preučeno s konfokalnim mikroskopom Zeiss Airyscan: uporabljena sta bila dva laserja (405 in 561 nm), od katerih je vsak ustrezal najvišjemu emisijskemu spektru za DAPI (obarvanje Nissl za celična jedra) in Alexa 568 (mCherry ), oz. Za analizo difuzije virusa na mestih injiciranja so bile mikrofotografije Te2 in ACC pridobljene kot mozaične slike (vsaka posamezna je bila pridobljena z uporabo objektiva 10 ×). Aksonske terminale v BLA smo analizirali z uporabo 40 × objektiva kot z-sklada 10 odsekov, razmaknjenih 1 μm narazen (159 μm kvadrat; delež povečave, 1,0).

Za živali, ki so jim vbrizgali retrobeads in so bile podvržene imunskemu označevanju s cFos, so bile slike pridobljene pri 40× povečavi (159 μm kvadrat; delež povečave, 1.0) s 3 različnimi laserji, ki ustrezajo najvišjemu emisijskemu spektru za DAPI (barvanje Nissl za celična jedra), AlexaFluor 488 (cFos) oziroma Texas Red (Retrobeads). Odseki 0,7 μm so bili pridobljeni vzdolž 10- μm z-sklada. Število jeder, ki izražajo cFos, označenih s kroglicami in dvojno pozitivnih (označenih s kroglicami cFos+), je bilo kvantificirano za vsako žival v regiji Te2 na anteroposteriornih koordinatah od 6,7 do 7,3 mm od bregme [10]. Podatke smo nato povprečili, da smo dobili povprečje vsake živali, rezultate pa smo statistično primerjali. Slike odsekov z DAB obarvanjem Neuna so bile analizirane s programsko opremo Neurolucida, povezano z mikroskopom prek barvne CCD kamere [10].

Analiza podatkov in merila za izključitev

N za vsako skupino je bil vnaprej določen v skladu z našimi prejšnjimi študijami [10,16,17], predhodno objavljenimi deli na tem področju (glej kot reference za ACC [6,22,55] in Te2 [10,59]), in z ocenami moči G v skladu z naslednjo tabelo (tabela 1):

Za vsako analizo smo ocenili končno povprečno število 8 do 10 živali za vsako skupino. Skupine so bile vodene z notranjimi kontrolami v isti poskusni seji (tabela S1). Glede na variabilnost kirurških in vedenjskih posegov smo a priori vključili večje število eksperimentalnih subjektov (do 15 % več), ki so v nekaterih primerih ustrezali eksperimentalnim kriterijem in bili vključeni, s čimer smo se izognili samovoljni izključitvi. V primeru študij hipokampusa, da bi ocenili učinke injekcij NMDA in CNQX v različnih časovnih intervalih, smo uravnotežili skupno število kontrolnih živali med nosilci in lažno operiranimi podganami med različnimi skupinami.

Analiza vedenja, histološki pregledi in štetje celic so bili izvedeni na slepo. Živali z neustrezno lokalizacijo sledi igle ali lezije v primeru ireverzibilnih lezij NMDA so bile izključene iz analize podatkov (tabela S1). V farmakoloških študijah smo izključili 57 živali od skupno 465 živali zaradi nepravilne namestitve igle (22/255 za Te2, 31/179 za ACC in 4/31 za hipokampus). V študijah sledenja smo na 21 živalih izločili 3 subjekte, pri katerih je injekcija retrobeads zgrešila BLA. V študijah optogenetike Te2 smo pri skupno 30 živalih izključili 1 podgano, ker postavitev optičnih vlaken ni bila nad ciljno regijo, 1 podgana. Navsezadnje virusa ni bilo v Te2 in 2 podganah, ker je bila difuzija virusa manjša od 4,7 % oziroma 5,3 % površine Te2 na mestih injiciranja. Pri podganah, vključenih v statistično analizo, je bila minimalna difuzija virusa 39,6 % pri bolj sprednji stereotaksični koordinati in 50,2 % pri bolj posteriorni stereotaksični koordinati.

Podobno sta bili v poskusih optogenetike ACC pri skupno 32 živalih izločeni 2 podgani, ker postavitev optičnih vlaken ni bila nad ciljno regijo. Dve podgani sta bili izključeni, ker virusa v ACC ni bilo, 1 žival, ker je bil virus v sosednjem sekundarnem motoričnem korteksu, in 1 podgana, ker je bila difuzija virusa manjša od 2,3 % površine ACC na mestih injiciranja. Pri preostalih podganah je bila minimalna difuzija virusa 33,3 % na bolj sprednji stereotaksični koordinati in 42,2 % na bolj posteriorni koordinati.

V študijah lezij NMDA so lezije večinoma ciljale na regijo CA1 dorzalnega hipokampusa. Najmanjša (rdeča) in največja razširjenost (roza) lezij hipokampusa po celotnem območju dorzalnega hipokampusa je bila 23,2 % oziroma 53,5 % na bolj sprednji stereotaksični koordinati ter 28,3 % in 62,3 % na bolj posteriorni koordinati. Od skupno 73 živali so bile 4 podgane izločene, ker lezije ni bilo, medtem ko so bile dodatne 3 živali zavržene, ker je bila razširjenost lezij manjša od 5.0% (in sicer 4,8%, 4,3%, 3,1 %) v zvezi s področjem hipokampusa na 2 koordinatah.

Analiza območij je bila izvedena z vizualnim pregledom in ročno kvantifikacijo z uporabo orodja za obrise regije programske opreme ZEN 3.0. Površinske vrednosti so bile nato normalizirane na celotno površino regije. Stereotaksične koordinate Te2, ACC in hipokampusa so temeljile na atlasu Paxinos [26] in v primeru Te2 s kortikalnim poljem, ki se nanaša na atlas Zilles [25].

Statistična analiza

Vsi podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Vsi podatki so prestali Levenov test za enakost varianc. Tako je bila v vseh poskusih uporabljena parametrična statistika. Podatki iz dveh skupin so bili primerjani z uporabo 2-repnih neparnih Studentovih t-testov. Primerjave več skupin so bile ocenjene s 1-načinnim testom ANOVA s Tukeyjevim post hoc testom. Za obravnavo razlik med skupinami in znotraj skupin smo izračunali model 3 × 2 mešane zasnove ANOVA s skupino (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) kot med- spremenljivka subjektov in stanje (pred in po nedavnem kondicioniranju + injekcija) kot spremenljivka znotraj subjekta. Kjer je bila interakcija skupina × stanje pomembna, smo izvedli preprosto analizo glavnih učinkov in prilagodili vsako p-vrednost z Bonferronijevim popravkom. Za vsak mešani model ANOVA smo ocenili predpostavko o sferičnosti z Mauchlyjevim testom sferičnosti.

Statistični parametri (tj. natančna vrednost n za vsako skupino, SEM, statistični test, velikost učinka in natančna p-vrednost) so navedeni v legendah. Za enake velikosti vzorcev so bile velikosti učinka za neparne t-teste določene z izračunom Cohenovega d ali Glassovega d glede na podobnost SD, medtem ko je za različne velikosti vzorcev Hedgesov g. Korelacije med številom celic in zamrzovanjem so bile izračunane z uporabo Pearsonovega koeficienta. Da bi ugotovili, ali podatki ustrezajo predpostavkam statističnega pristopa, smo zavrnili ničelno hipotezo na ravni P < 0.05. Vse statistične analize so bile izvedene s programom SPSS Statistics 22 (IBM).

Podporne informacije

S1 Slika Povečava igelnih sledi Te2 (A) in ACC korteksa (B), vbrizganih s CNQX, izbranih kot primerov. (C) Ko so bile predstavljene z enakim kontekstom 2 tedna po posegu, so živali samo s šokom pokazale nizek odziv na strah, kar dokazuje, da postopek ni izzval pogojene zamrznitve v kontekstu, kjer je bil šok izveden. (D) Podobni rezultati kot na sliki 1 so bili pridobljeni s protiutežjo dveh tonov, uporabljenih kot CS (CS1, 3 kHz in CS2, 15 kHz) (Studentov t test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glassov d=4.14). (E) Pri podganah, kondicioniranih z vonjem-CS, je bila zamrznitev do vonja 2 tedna po kondicioniranju visoka, tudi če so bili testirani v drugačnem okolju v zvezi s kontekstom kondicioniranja, kar kaže, da je bil strah posebej povezan s tem podajanjem iztočnice. Lestvice, 300 μm. ��P < 0,01. Vsi podatki so srednji in SEM. Povzetek podatkov za S1 Fig lahko najdete v podpornih informacijah v datoteki z imenom S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Slika. Injekcija CNQX je oslabila ohranjanje nedavnih slušnih spominov na strah pri podganah, kjer je bila generalizacija strahu znižana s samim tonom pred izpostavljenostjo ali z uporabo tona belega šuma kot CS1. 3 × 2 mešana zasnova ANOVA (glavni učinek skupine: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, glavni učinek pogoja: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, skupina × pogojna interakcija F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) je pokazala, da je bila zamrznitev na ton 3 kHz pred povezavo z ZDA nižja pri živalih, ki so bile predhodno izpostavljene tonu 15 kHz pred združevanjem 15 kHz-US (n=10, p=0.001), ali pri podganah, kondicioniranih na beli šum (n=13 , p=0.008) v primerjavi z živalmi CS1-CS2 (n=22), ki so pokazale spremenljiv odziv na generalizacijo strahu. Vendar pa je bil po učenju CS-US in injekcijah cnqx v korteks Te2 nedavni spomin na strah oslabljen v vseh skupinah (p > 0,05). Preprost glavni učinek znotraj skupin (pred in po učenju CS-US, ki mu sledi vbrizgavanje cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Ton-CS1-CS2, str=0.189; WN-CS2, p=0.347) ��P < 0,05, ��P < 0,01. Vsi podatki so srednji in SEM. Povzetek podatkov za S2 Fig lahko najdete v podpornih informacijah v datoteki z imenom S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Slika (A) Naključni primer vbrizgavanja retrobeads, ki cilja na BLA. (B in C) Primeri postavitev optičnih vlaken nad BLA živali, ki so jim vbrizgali vektorje AAV v Te2 (B) in korteks ACC (C). Lestvice, 500 μm.

Zahvala

Zahvaljujemo se dr. E. Manasseru za njihovo stalno podporo in nasvete.

Avtorski prispevki

Konceptualizacija: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Skrbništvo podatkov: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formalna analiza: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Pridobitev sredstev: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Preiskava: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologija: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Nadzor: Benedetto Sacchetti.

Potrditev: Benedetto Sacchetti.

Pisanje – izvirni osnutek: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Pisanje – pregled in urejanje: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Reference
1. Frankland PW, Bontempi B. Organizacija nedavnih in oddaljenih spominov. Nat Rev Neurosci. 2005; 6: 119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Nevrobiologija konsolidacij ali kako stabilen je engram? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Utrjevanje spomina. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Konsolidacija spomina in medialni temporalni reženj: preprost mrežni model. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91: 7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Zakaj obstajajo komplementarni učni sistemi v hipokampusu in neokorteksu: vpogled v uspehe in neuspehe konekcionističnih modelov učenja in spomina. Psychol Rev. 1995; 102: 419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com