Označevalci kakovosti Cistanches Herba na podlagi razmerja med spektrom antioksidantov in učinkom

Povzetek

Cilj: Vzpostaviti raziskovalno metodo za označevalce kakovosti (Q-markerje).Cistanches Herba(CH) na podlagirazmerje med spektrom in učinkom antioksidantov, ki zagotavlja podlago za preučevanje njegovih farmakoloških snovi in ​​nadzor kakovosti. Metode: Tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti (UPLC) je bila uporabljena za vzpostavitev profilov prstnih odtisov za 10 serij CH. Model celične oksidativne poškodbe je bil vzpostavljen z uporabo H2O2, antioksidativna kapaciteta CH je bila določena na podlagi polovične maksimalne inhibitorne koncentracije reaktivnih kisikovih spojin ter ravni superoksidedizmutaze in katalaze kot farmakoloških indikatorjev. Razmerje spekter-učinek je bilo konstruirano z analizo glavnih komponent, Pearsonovo korelacijsko analizo in delno regresijsko analizo najmanjših kvadratov. Aktivne komponente so bile podvržene farmakološki validaciji. Rezultati: Profili prstnih odtisov za CH so bili vzpostavljeni z uporabo UPLC, pri čemer je bilo identificiranih 17 pogostih vrhov. Na podlagi korelacijske analize spektra in učinka je bilo izbranih devet komponent. Rezultati farmakološke validacije so pokazali, da genipozidna kislina, 8-epiloganska kislina,ehinakozid, akteozid,izoakteozid, intubulozid Apokazala antioksidativno aktivnost na način, ki je odvisen od koncentracije. Zaključek: Ta študija je raziskala označevalce Q za CH na podlagi razmerja spekter-učinek, pri čemer je zagotovila referenčne informacije za osnovo farmakološke snovi in ​​izboljšanje standarda kakovosti.

Ključne besede:Cistanči Herba; Q-marker;razmerje spekter-učinek; antioksidant

ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 30 % EHINAKOZIDA IN 12 % AKTEOZIDA ZA DELOVANJE LEDVIC

Cistancheje posušeno mesnato steblo z luskastimi listi Cistanche deserticola YCMa ali Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, rastline iz rodu Cistanche iz družine Orobanchiaceae. Prvič je bil zabeležen v "Shen Nong's Materia Medica" in je naveden kot najvišja ocena [1]. Po naravi je topel, po okusu sladek in slan; vrne se v meridiane ledvic in debelega črevesa; ima učinke hranjenja ledvičnega janga, obnavljanje esence in krvi, vlaženje črevesja in odvajalo ter je pomembno zdravilo za tonificiranje ledvic in obnavljanje esence [2-3]. Ledvice shranjujejo esenco, esenca in kri pa prihajata iz istega vira. Če pride do pomanjkanja esence in krvi, bo to vplivalo na splošne življenjske aktivnosti človeškega telesa; kostni mozeg, ki proizvaja esenco, je shranjen v kosteh, možgani pa so morje kostnega mozga. Če je ledvična esenca nezadostna, bodo kosti izgubile hrano in možgani bodo primanjkovali, kar bo povzročilo degenerativne spremembe kosti, kot so ohlapna struktura, izguba zob, izguba spomina, demenca in zmanjšana imunska funkcija [4-6]. Cistanche deserticola vsebuje feniletanolne glikozide, iridoide, lignane in druge strukturne sestavine, vključno z ehinaceazidom, verbaskozidom, izorbaskozidom, genipinsko kislino in 8-epistrijansko kislino. , tubulin A itd. [7]. Trenutni nadzor kakovosti Cistanche deserticola v izdaji "Farmakopeje Ljudske republike Kitajske" iz leta 2020 določa le vsebnost ehinaceazida in verbaskozida, ki ne more v celoti odražati značilnosti večkomponentnega in večtarčnega delovanja tradicionalne kitajske medicine. , kar ne prispeva k nadzoru in vrednotenju kakovosti.

Da bi izboljšal raven nadzora kakovosti tradicionalne kitajske medicine in optimiziral oceno kakovosti tradicionalne kitajske medicine, je akademik Liu Changxiao predlagal nov koncept označevalca kakovosti (Q-marker) tradicionalne kitajske medicine [8]. Med njimi je "učinkovitost" osrednji element v "petih načelih" Q-markerja [9] in je tudi jedro ocene kakovosti tradicionalnih kitajskih zdravil.

Glede na trenutni status raziskav o slabi korelaciji med standardi kakovosti in učinkovitostjo zdravil je raziskovanje označevalcev Q tradicionalnih kitajskih zdravil ter vzpostavitev bolj znanstvenih in razumnih standardov kakovosti zelo pomembna za izboljšanje kakovosti tradicionalnih kitajskih zdravil. Razmerje med spektrom in učinkom je povezava kromatografskih vrhov prstnih odtisov tradicionalne kitajske medicine s posebnimi farmakodinamičnimi podatki za iskanje učinkovitih substanc tradicionalne kitajske medicine, s čimer se odraža inherentna kakovost tradicionalne kitajske medicine [10]. Vzpostavitev matematičnega modela spektralne učinkovitosti lahko razjasni QMarker tradicionalne kitajske medicine z vidika "holističnega pogleda", kar zagotavlja več referenc za poznejši nadzor kakovosti tradicionalne kitajske medicine, oblikovanje standardov kakovosti in pregledovanje učinkovin. Ta študija uporablja prstne odtise v kombinaciji s stopnjo polovične inhibicije reaktivnih kisikovih vrst (ROS IC50), vsebnostjo superoksid dismutaze (SOD) in katalaze (CAT) za preučevanje razmerja spekter-učinek tradicionalne kitajske medicine ter uporablja analizo glavnih komponent (PCA) ), Pearsonova korelacijska analiza (PCC) in delna regresijska analiza najmanjših kvadratov (PLS) za celovito analizo Q-markerja Cistanche deserticola in zagotavljanje osnove za nadzor kakovosti.

1 material

1.1 Vzorec

Cistanche deserticolaje bila pridelana iz okrožja Yutian v Xinjiangu in baze dobre kmetijske prakse (GAP) Cistanche deserticola v Notranji Mongoliji. Raziskovalec Zhang Tiejun iz Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. ga je identificiral kot Cistanche tubulosa (Schenk) Wight in Cistanche deserticola.

YC Ma, podrobne informacije so prikazane v tabeli 1.

1.2 Testno zdravilo

Ehinaceazid (številka serije: 111670-201907, čistost: 91,8 %) in verbaskozid (številka serije: 111530-201914, čistost: 95,2 %) sta bila oba kupljena pri Kitajskem inštitutu za nadzor hrane in zdravil; izoreskozid (številka serije: 61303-13 -7), salidrozid (številka serije: 10338-51-9), 8-epistrihnojska kislina (številka serije: 82509-41-9), genipinska kislina (številka serije: Z24A10X95926) , tuberozin B (številka serije: 112516-04-08), 2-acetil evgenol glikozid (številka serije: 94492-24-7) so bili kupljeni pri Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., čistost večja ali enaka 98 %; Cistanche glikozid A (številka serije: MUST -20062806, čistost: 98,51 %) in vaskulin A (številka serije: MUST19110102, čistost: 98,57 %) sta bila kupljena pri Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; kromatografsko čisti acetonitril in mravljinčno kislino sta bila kupljena pri podjetju Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Prečiščena voda (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

Dimetil sulfoksid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, ZDA); CellTiter 96® AQueous komplet za odkrivanje proliferacije celic v eni raztopini (G3580, Promega Company, ZDA); Komplet za zaznavanje CAT (S0051), komplet za zaznavanje aktivnosti SOD S0101M) in komplet za zaznavanje ROS (S0033S) so bili kupljeni pri Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumenti

Waters H-class-PDA tekočinski kromatograf ultra visoke ločljivosti (Waters Company, ZDA); elektronska tehtnica Sartorius BT25S (podjetje Sartorius, Nemčija); H1650 hitra namizna centrifuga (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Čitalnik mikroplošč (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Biološki mikroskop WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 celice

Ledvične celice človeškega zarodka V tem poskusu so bile uporabljene celice HEK 293, ki so bile kupljene iz celične banke Kitajske akademije znanosti.

2 metoda

2.1 Vzpostavitev zemljevida prstnih odtisov

2.1.1 Priprava preskusne raztopine: odtehtajte 2 g medicinskega materiala Cistanche deserticola, dodajte 10-kratno količino vode, segrejte in refluktirajte 3-krat, vsakokrat 1 uro, centrifugirajte pri 1.0 ×105r·min-1 za 15 minut (centrifugalni polmer je 300 mm), Združite supernatante in koncentrirajte, da dobite osnovno raztopino z masno koncentracijo 100 mg·mL-1, jo razredčite 10-krat, in ga filtrirajte skozi 0,22 µm mikroporozno filtrirno membrano, da ga dobite.

2.1.2 Priprava mešane referenčne raztopine

Vzemite 8-epistrihnično kislino, salidrozid, ehinaceazid, cistanski glikozid A, genipinsko kislino, verbaskozid, antocianozid A, izorbaskozid in 2'-acetil evgenol. Glikozid in referenčna snov angiozid B sta bili izmerjeni v ustreznih količinah in natančno stehtani. Dodajte 50 % raztopino metanola za raztapljanje in pripravite raztopino mešane referenčne snovi z masno koncentracijo 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kromatografski pogoji

kolona ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobilna faza je acetonitril (A) ~ 0.1 % raztopina mravljinčne kisline (B), gradientni elucijski program (0 ~ 6 min, 5 % ~ 8 % A ; 6 ~ 10 min, 8 % ~ 15 % A 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); valovna dolžina detekcije je 237 nm; hitrost pretoka je 0,4 ml·min –1; temperatura stolpca je 40 stopinj; prostornina injekcije je 3 µL.

2.1.4 Izbira referenčnega vrha

V kromatogramu tekočinske kromatografije ultrazmogljive tekočine (UPLC) Cistanche deserticola je bil kot referenčni vrh spektra prstnih odtisov izbran vrh z največjim razmerjem površine vrhov, zmernim retencijskim časom in dobrim ločevanjem.

2.1.5 Metodološki pregled

Preskus natančnosti: Vzemite vzorec T1 in pripravite preskusno raztopino po metodi pod 2.1.1. Vzorec vbrizgajte 6-krat neprekinjeno in zabeležite prstni odtis. Rezultati kažejo, da je relativna površina vrha RSD vsakega vrha 0.10% ~ 4,61 %, relativni retencijski čas RSD pa 0,08 % ~ 1,32 %, kar kaže, da je instrument dober natančnost.

Preskus ponovljivosti: Vzemite vzorec T1 in vzporedno pripravite 6 vzorcev preskusne raztopine v skladu z metodo iz 2.1.1 in vzorec neprekinjeno vbrizgajte. Rezultati kažejo, da je relativna površina vrha RSD vsakega kromatografskega vrha 1,35 % ~ 4,8 0 %, relativni retencijski čas RSD pa 0,10 % ~ 1,80 %, kar izpolnjuje zahteve prstnega odtisa in kaže, da je ponovljivost instrumenta je dober.

Preskus stabilnosti: Vzemite vzorec T1 in pripravite testno raztopino v skladu z metodo pod 2.1.1, vbrizgajte vzorce za testiranje pri 0, 2, 4, 8 in 12 urah ter zabeležite prstni odtis. Izračunani RSD relativne površine vrha vsakega kromatografskega vrha je 0,53%~4,82%, RSD relativnega retencijskega časa pa je 0,09%~2,17%, kar izpolnjuje zahteve prstnega odtisa in pomeni, da je testni izdelek stabilen v 12 urah.

2.2 Raziskave antioksidativnega učinka Cistanche deserticola

2.2.1 Priprava matične lužnice Cistanche deserticola

Vzamemo matično lužnico pod točko 2.1.1, jo filtriramo in steriliziramo ter pred uporabo razredčimo z gojiščem do zahtevane koncentracije.

2.2.2 Cistanche deserticola in pozitivna kontrola

Učinek VE na sposobnost preživetja celic HEK 293 je bil določen kot normalna skupina (celična suspenzija), skupina za dajanje Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), skupina VE (20, 40, 60 , 80, 100 µmol·L–1), nastavite 6 podvojenih vdolbinic za vsako koncentracijo, gojite 24 ur, v vsako vdolbinico dodajte 20 µL reagenta z enojno raztopino CellTiter 96® AQueous, da zaznate viabilnost celic, nadaljujte s kulturo 2 uri, in uporabite čitalnik mikroplošč za odkrivanje viabilnosti celic pri 490 nm. Vrednost absorbance (OD) vsake vdolbinice smo uporabili za izračun stopnje preživetja celic v skladu s formulo (1). Stopnja preživetja (%)=(poskusna skupina OD/slepa skupina OD) × 100 % (1)

2.2.3 Cistanche deserticola na indukcijo H2O2

Vpliv ROS na celice HEK 293. Celice smo razdelili na normalno skupino (celična suspenzija) in skupino za dajanje Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola in 60 µm·L–1 H2O2) in gojili 24 ur. Sledite korakom kompleta za odkrivanje ROS za nadaljnje operacije, neposredno opazujte obarvanje celic skozi mikroskop in uporabite čitalnik mikroplošč za zaznavanje intenzivnosti fluorescence vsake skupine. Nastavitve parametrov so uporabile valovno dolžino vzbujanja 488 nm in valovno dolžino emisije 525 nm. Poskus smo ponovili trikrat.

2.2.4 Cistanche deserticola par

Vpliv H2O2 na SOD v celicah HEK 293. Celice smo razdelili v normalno skupino (celična suspenzija), modelno skupino (60 µm·L–1 H2O2), skupino VE (60 µm·L–1 VE in 60 µm·L–1 H2O2), skupino za dajanje Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola in 60 µm·L–1 H2O2), zberemo celice po 24 urah gojenja, dodamo raztopino za pripravo vzorcev SOD za lizo celic in centrifugiramo pri 4 stopinjah in 12000 r·min{{22} } min (polmer centrifugiranja je 300 mm), vzemite supernatant kot vzorec za testiranje in sledite korakom kompleta za odkrivanje SOD za nadaljnje postopke. Poskus smo ponovili trikrat.

2.2.5 Cistanche deserticola na indukcijo H2O2

Učinke CAT na celice HEK 293 smo obdelali v skladu z metodo v 2.2.4 in jih združili v skupine. Po obdelavi dodajte raztopino za lizo, centrifugirajte pri 4 stopinjah in 12000 r·min-1 10 minut (centrifugalni polmer je 300 mm), vzemite supernatant in sledite korakom kompleta za odkrivanje CAT za nadaljnje operacije . Poskus smo ponovili trikrat.

2.2.6 Statistična analiza

Za statistično analizo je bila uporabljena programska oprema SPSS 26.0. Vsaka skupina podatkov je bila predstavljena z (±±(). Enosmerna analiza variance je bila izvedena na podatkih, ki so bili v skladu z normalno porazdelitvijo. Če so bile variance enake, je bila uporabljena metoda najmanj pomembne razlike. Če so bile variance neenakomeren, je bila za grafičnost uporabljena Dunnettova metoda T3 in P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analiza korelacije spektra in učinkov antioksidanta Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Območja vrhov skupnih vrhov 10 serij Cistanche deserticola, ki imajo ugotovljene prstne odtise, so bila normalizirana z vrednostjo Z in narejena v podatkovno matriko reda 10×17, ki je bila uvožena v programsko opremo SPSS 26.0 za PCA.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 je bil uporabljen za izvedbo bivariatne analize za preučevanje razmerja spektralne učinkovitosti med prstnimi odtisi Cistanche deserticola in antioksidanti. Testiranje pomembnosti je bilo izvedeno z dvostranskim testom (T), s P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Uvozite eksperimentalne rezultate standardizirane površine vrha in antioksidanta Cistanche deserticola v programsko opremo SIMCA-P 14.1, nastavite območje vrha kot spremenljivko X in nastavite farmakodinamični indeks kot spremenljivko Y za izvedbo PLS.

2.4 Verifikacija antioksidativne aktivnosti Q-markerja Cistanche deserticola

2.4.1 Priprava matične raztopine učinkovin. Natančno stehtajte ustrezne količine genipinske kisline, 8-epistrihnične kisline, ehinaceazida, verbaskozida, izorebaskozida in antocianozida A ter dodajte DMSO, da jih raztopite v 10 mmol·l-1 referenčne raztopine.

2.4.2 Vpliv učinkovin na citotoksičnost HEK 293.

Po 24-urni inkubaciji celic HEK 293 v vsako vdolbino dodajte različne koncentracije raztopin učinkovin pod 2.4.1 (0.781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µL, neprekinjena stimulacija

Ko so bile celice inkubirane 24 ur, je bil dodan reagent CellTiter 96® AQueous z enojno raztopino za odkrivanje viabilnosti celic.

2.4.3 Antioksidativni škodljivi učinek učinkovin na celice HEK 293, ki jih povzroči H2O2-.

Celice so razvrščene na naslednji način: normalna skupina, modelna skupina in skupina VE so razvrščene v skladu z 2.2.4. Eksperimentalna skupina (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 sestava aktivnosti in 60 µm·L–1 H2O2), gojena 24 ur. Določite znotrajcelične ravni ROS, vsebnosti encimov SOD in CAT v skladu z metodami pod 2.2.3, 2.2.4 oziroma 2.2.5.

Podporna služba Wecistanche

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Nakupujte za več podrobnosti o specifikacijah:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop