Kvantitativna ocena vnetnih infiltratov v biopsijah ledvičnih presadkov z uporabo multipleksnega ojačanja tiramidnega signala in poglobljenega učenja

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valerij Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Povzetek

Zakasnjena funkcija presadka (DGF) je močan dejavnik tveganja za razvoj intersticijske fibroze in tubularne atrofije (IFTA) pri presaditvi ledvic. Kvantitativna ocena vnetnih inflatov v biopsijah ledvic bolnikov z DGF lahko razkrije napovedne označevalce za razvoj IFTA. V tej študiji smo združili multipleksno ojačanje tiramidnega signala (mTSA) in konvolucijske nevronske mreže (CNN), da bi ocenili vnetno mikrookolje v biopsijah ledvic bolnikov z DGF (n=22), odvzetih 6 tednov po presaditvi. Bolniki so bili stratificirani glede na razvoj IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec

Uvod

Zakasnjena funkcija presadka (DGF) po presaditvi ledvice je večfaktorska in povezana predvsem z značilnostmi darovalca in časom ishemije. DGF je na splošno opisan kot potreba po dializi v 7 dneh po presaditvi in ​​je močan dejavnik tveganja za kronično poškodbo ledvičnega presadka [1–3]. Klasična komponenta kronične ledvične okvare je prisotnost intersticijske fibroze in tubularne atrofije (IFTA). Vendar pa vsi bolniki z DGF ne napredujejo do razvoja IFTA in kompleksno razmerje med DGF in IFTA je še vedno slabo razumljeno. Prvič, to je posledica časovnega zamika med potencialno vzročnimi dogodki in funkcionalnim upadom, drugič pa zaradi spremenljivih in kompleksnih učinkov potencialnih induktorjev, kot so zavrnitev in stranski učinki zdravil [1, 4]. Splošna prisotnost vnetja in specifičnih makrofagov je bila opisana v številnih študijah kot napovedovalec izgube presadka [5–8]. Vendar osnovni patološki procesi niso popolnoma razumljeni in visoke stopnje vnetja ne vodijo vedno v dolgotrajno izgubo presadka. Zaradi okoljskih dražljajev makrofagi pridobijo specializirane funkcije in se polarizirajo v različne fenotipe. Številne študije kažejo, da so specifični podtipi makrofagov (alternativno aktivirani makrofagi) vključeni v preoblikovanje tkiva z induciranjem obnove ali fibroze tkiva. Znano je, da je polarizacija v smeri fenotipa za preoblikovanje tkiva (včasih profibrotičnega) odvisna od širokega nabora okoljskih dražljajev, med drugim, ki jih zagotavljajo podtipi T-helper limfocitov [9–11]. Ocena populacij T-helper celic v presadku v času DGF je pokazala prevladujoč podtip T-helperja 1, vendar korelacije z izidom presadka ali napredovanjem do IFTA še niso bile raziskane [12]. Celovita ocena vnetnega mikrookolja, posebej osredotočena na makrofage in podskupine celic T-pomagalk v skrbno izbranih kohortah bolnikov, bi lahko zagotovila vpogled v to, zakaj nekateri, ne pa vsi bolniki z DGF, napredujejo do razvoja IFTA.

Vendar pa celovito preiskavo vnetnih infiltratov ovira več (tehničnih) omejitev. Tradicionalne imunohistokemijske (IHC) in imunofluorescenčne tehnike podpirajo vizualizacijo le omejenega števila celičnih markerjev v enem odseku tkiva. Serijsko rezanje majhnih, dragocenih fragmentov tkiva, kot so biopsije ledvic, ni zaželeno in razlaga odnosov med celicami v različnih delih je težavna. Poleg tega je kvantitativna ocena vnetnih infiltratov z vizualno oceno povezana s precejšnjo stopnjo variabilnosti med opazovalci [13]. Tradicionalne tehnike obdelave slik, kot so določanje praga slikovnih pik, razvodnica in segmentacija na podlagi morfologije, temeljijo na predhodnem poznavanju vseh morfoloških predstavitev celic in intenzivnosti madežev tkiva v celotnem nizu podatkov [14–16]. Zato te metode pogosto nimajo robustnosti za biološke in tehnične variacije slik in se slabo prenašajo na nove ali zunanje nize podatkov. Vzpon digitalne patologije je pospešil razvoj alternativnih metod za ocenjevanje slik celotnega diapozitiva (WSI) [17, 18]. Izkazalo se je, da so modeli globokega učenja, natančneje konvolucijske nevronske mreže (CNN), sposobni segmentirati in zaznati pomembne biološke strukture v histopatoloških preparatih [19–23]. Te tehnike imajo potencial za prehod od subjektivne vizualne ocene in tradicionalne obdelave slik do natančnega, objektivnega in ponovljivega odkrivanja celic.

Namen te študije je razviti metodo za objektivno, kvantitativno oceno več markerjev vnetnih celic, s čimer se izognemo potrebi po obsežnem serijskem rezanju stekelcev. Da bi to naredili, združujemo multipleks IHC, večspektralno slikanje in modele globokega učenja. Da bi prikazali uporabnost teh tehnik, preučujemo korelacije vnetnega mikrookolja, kvantificiranega z modeli globokega učenja, z razvojem IFTA v nadzornih biopsijah presadka bolnikov z DGF.

ekstrakt cistanche za zdravljenje bolezni ledvic

Materiali in metode

Za oceno vnetnega mikrookolja v ledvičnih biopsijah bolnikov z DGF smo izvedli multipleksno IHC na nadzornih biopsijah, odvzetih 6 tednov po presaditvi. Bolniki so bili stratificirani glede na razvoj IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Vzorci tkiv

Uporabili smo nadzorne biopsije prejemnikov presajenih ledvic na medicinski šoli Hannover (Hannover, Nemčija), pridobljene v okviru prospektivnega programa nadzorne biopsije. Merila za vključitev so bila: pojav DGF (opredeljen kot<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

ocena IFTA

Obseg intersticijske fibroze (ci) in tubularne atrofije (ct) (IFTA) po 6 tednih in 6 mesecih, izražen z uporabo Banffovega sistema ocenjevanja lezij [24], je bil pridobljen iz patološkega poročila. Da bi podrobneje ocenili razmerje med zgodnjimi vnetnimi inflarti in razvojem IFTA, so bili vsi preparati, obarvani s PAS, digitalizirani za ponovni pregled z uporabo digitalnega skenerja diapozitivov Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, Madžarska) z 20 × objektiv pri ločljivosti 0,24 μm/piksel. PAS WSI obeh časovnih točk (6 tednov in 6 mesecev) so ocenili za obseg IFTA (odstotek površine, z 10-odstotnimi intervali) trije ledvični patologi. Povprečni rezultati IFTA patologov so bili uporabljeni kot končni rezultat za izračun spremembe v IFTA med 6 tedni in 6 meseci po presaditvi. Bolniki so bili stratificirani glede na absolutno povečanje ocene IFTA za 10 odstotkov ali več (n=13) in brez oz.<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Poleg tega so bili rezultati Banffovih lezij primerjani med časovnimi točkami z uporabo Wilcoxonovega predznačenega ranking testa. To je razkrilo pomembne razlike med 6-tedenskimi in 6-mesečnimi biopsijami za Banffove kategorije ti (p=0.017), ci (p=0.004) in ct (p=0.011) .

Multiplex TSA barvanje

Izvedli smo multipleksno IHC z uporabo mTSA za vizualizacijo več celičnih markerjev v 6-tedenskih biopsijah. Po inkubaciji s primarnim in sekundarnim protitelesom smo tkivo obdelali s fluorescentno označenim tiramidom. Hrenova peroksidaza iz sekundarnega protitelesa katalizira tvorbo aktivnih tiramidnih radikalov. Tiramidni radikali se kovalentno vežejo na tirozinske ostanke na antigenu. Ta trajna vezava je omogočila toplotno povzročeno odstranitev primarno-sekundarnega protitelesnega kompleksa, medtem ko je ohranila fluorescenčno usedlino tiramida [25]. To je omogočilo poznejšo zaporedno inkubacijo z nadaljnjimi protitelesi iste vrste proti ciljnim antigenom.

mTSA je bil izveden na dveh zaporednih diapozitivih iz 6-tedenskih nadzornih biopsij. Razvili smo dve plošči mTSA za oceno obsega vnetnega infiltrata in peritubularnih kapilar v naših skupinah bolnikov. Panel I je vseboval protitelesa proti CD3, CD4, CD8, CD2 0, CD68 in CD34. Panel II je bil uporabljen za raziskovanje polarizacije celic T-pomočnic in makrofagov z uporabo protiteles proti CD4, Tbet, GATA3, CD68 in CD163. Specifikacije protiteles, razredčitve in vrstni red obarvanja so navedeni v dodatni tabeli 1. Vsa stekelca so bila deparafinizirana v ksilenu, dehidrirana v 95-odstotnem etanolu, sprana v vodi iz pipe in kuhana za pridobitev epitopa v 10-krat razredčenem trisboratu-EDTA (TBE 10-krat). , 0658, VWR Life Sciences, ZDA). Po ohlajanju smo stekelca sprali v 3-odstotni raztopini vodikove peroksidaze za blokiranje endogene peroksidaze in sprali s tris-pufriranim slanim pufrom z 0,05-odstotnim Tween 20 (822184, Merck KGaA, Nemčija) (TBS-T). Blokiranje beljakovin je bilo izvedeno z uporabo TBS-T z 1 odstotkom govejega serumskega albumina (BSA) (mTSA korak 1). Primarna protitelesa smo inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi ali čez noč pri štirih stopinjah Celzija (2. korak mTSA). Po pranju v TBS-T smo stekelca inkubirali s HRP-konjugiranim sekundarnim protitelesom (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Nizozemska) 30 minut pri sobni temperaturi (3. korak mTSA). Nato je bila izvedena TSA z uporabo fluoroforjev Opal TSA iz kompleta Opal 7-color Manual IHC (NEL811001KT, Akoya Biosciences, ZDA) (4. korak mTSA) (fluoroforji in njihova ustrezna protitelesa so navedena v dodatni tabeli 1). Kompleks protitelo-TSA smo odstranili s ciklom vrenja v pufru TBE (korak 5 mTSA). Korake 1–5 mTSA so ponavljali, dokler stekelca niso bila obarvana z vsemi protitelesi iz zadevne plošče. Predmetna stekelca so prekrili s fluoromount-G z DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, ZDA).

herba cistanche

Validacija Multiplex TSA

Ponavljajoči se cikli vrenja lahko vplivajo na afiniteto ciljnega epitopa. Nekatera protitelesa kažejo šibkejši vzorec obarvanja po večkratnem prekuhavanju tkiva, druga protitelesa potrebujejo več ciklov vrenja, da dosežejo optimalno intenzivnost obarvanja, na druga pa to sploh ne vpliva. Ta učinek smo ocenili za vsa protitelesa z uporabo kromogenega IHC na kontrolnem tkivu tonzil FFPE. Za vsako testirano protitelo (n=9) smo izrezali šest delov (debeline 4 μm). Vsa stekelca smo deparafinizirali v ksilenu, dehidrirali v 95-odstotnem etanolu, sprali v vodi iz pipe in kuhali za pridobitev epitopa v 10-krat razredčenem TBE (prvi cikel vrenja). Po ohlajanju smo eno stekelce na testirano protitelo shranili v fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS). Preostale diapozitive smo ponovno zavreli. Ta cikel se je ponovil petkrat. Vsa stekelca smo nato sprali v 3-odstotni raztopini vodikove peroksidaze in nato sprali v PBS. Primarna protitelesa (dodatna tabela 1) so bila inkubirana 1 uro pri sobni temperaturi. Po inkubaciji smo stekelca sprali v PBS. Za diapozitive, obarvane s protitelesi proti CD68, Tibet in GATA3, je bila potrebna dodatna inkubacija z blokiranjem po protitelesih (PAB) 15 minut (blokiranje VWRKDPVB, Immunologic, Nizozemska). Po inkubaciji smo stekelca sprali v PBS in inkubirali s sekundarnim protitelesom, konjugiranim s HRP (po PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nizozemska, za druge glejte dodatno tabelo 1 za sekundarna protitelesa). Vizualizacija je bila izvedena z uporabo 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Nizozemska). Rezultati so prikazani na dodatni sliki 1. Na podlagi teh rezultatov smo določili optimalni vrstni red protiteles za poskuse mTSA, kot je navedeno v dodatni tabeli 1.

Če so zanimivi epitopi so-lokalizirani, lahko usedline tiramida med seboj motijo. Za testiranje te sterične inhibicije smo uporabili preparate s kontrolnim tkivom tonzil in jih obarvali z našimi ploščami mTSA. Ekspresijo protiteles v mTSA so primerjali z ekspresijo v enkratno obarvanih preparatih, ki so šli skozi enako število ciklov vrenja. Nismo opazili razlik v vzorcih obarvanja med enkratno in večkratno obarvanimi preparati (primeri vključeni iz plošče I, dopolnilni sliki 2 in 3). Vsa primarna protitelesa v mTSA so bila uporabljena v enaki razredčitvi, kot so bila uporabljena za kromogeni IHC. Intenzivnost fluorescenčnega signala je bila optimizirana s prilagajanjem razredčin raztopine TSA.

Multipleksno slikanje TSA

Multispektralno slikanje je bilo izvedeno z uporabo Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, ZDA) z 20x objektivom, pri ločljivosti 0,49 μm na piksel in z uporabo DAPI, FITC, CY3, Texas Red in Cy5 spektralne kocke. Sistem Vectra omogoča ročno izbiro regij za večspektralno zajemanje, ki jih sistem nato razdeli na ploščice (slika 1.1). Spektri avtofluorescence in vsi fluoroforji Opal TSA so bili predhodno posneti v spektralni "knjižnici" z uporabo programske opreme Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, ZDA). Spektralna knjižnica je omogočila razgradnjo multipleksne ploščice na več posameznih ploščic, ki predstavljajo prispevek vsakega fluoroforja ("nemešanje"). To je povzročilo enobarvne, večkanalne ploščice, pri čemer je vsak kanal ustrezal enemu fluoroforju in s tem protitelesu (slika 1.2).

Pretvorba v IHC z umetnim svetlim poljem

Na podlagi shranjenih koordinat so bile ploščice sešite, da so ustvarili večkanalni WSI z uporabo skripta python po meri (slika 1.3). Kanali, ki predstavljajo signal DAPI (IDAPI), in kanali, ki predstavljajo eno od protiteles (IIHC), so bili pretvorjeni v umetno barvanje s hematoksilinom oziroma DAB (sliki 1.4 in 1.5). Na podlagi znanega kromatskega hematoksilina in koordinat DAB Cx, Cy po transformaciji gostote odtenka-nasičenosti (HSD) so bili v prejšnjih študijah pridobljeni vektorji madežev [26, 27]. Ti vektorji madežev so bili uporabljeni za izračun rdeče-zeleno-modre vrednosti za IHC umetnega svetlega polja (slika 1.5), kot:

s CR, st absorpcijo svetlobe barvila st v rdečem delu spektra. Vrednosti za B in G so bile izračunane na podoben način.

Analiza slike

Interesne regije (ROI)

Interesne regije (ROI) so bile označene za vsak primer v kohorti z uporabo programske opreme platforme za samodejno analizo diapozitivov (ASAP; različica 1.9, na voljo kot odprtokodna programska oprema na GitHubu). Te ROI so sestavljale kortikalni tubulointersticij, s čimer so bili izključeni kapsula, glomeruli in arterije. Ker se vnetje v ledvičnih subkapsularnih regijah šteje za nespecifično pri patologiji presadka, so bile biopsije v tej študiji primarno analizirane brez subkapsularne regije (opredeljene kot 400 µm pod kapsulo). Sekundarno smo ponovili analize, vključno s subkapsularno regijo. Vizualni primeri ROI so vključeni v dodatno sliko 4.

Odkrivanje limfocitov CNN I

Slike IHC z umetnim svetlim poljem, ki predstavljajo obarvanje CD3, CD4, CD8 in CD20, so bile analizirane z uporabo obstoječega CNN z arhitekturo U-Net [22, 28]. To omrežje je bilo posebej zasnovano za odkrivanje citoplazemskih limfocitnih markerjev pri IHC. Delovanje CNN je mogoče izraziti z natančnostjo, priklicem in oceno F1-, kjer:

CNN je na testnem nizu dosegel natančnost {{0}}.76, priklic 0.79 in F1-rezultat 0.78 ki je bil uporabljen v izvirnem dokumentu, sestavljenem iz tradicionalnega IHC WSI. Zaznavanje posameznih pozitivnih celic zahteva določanje praga izhoda CNN, čemur sledi naknadna obdelava. Ker je bilo obarvanje CD3 na plošči mTSA močnejše v primerjavi s CD4, CD8 in CD20, je bil za slednje tri uporabljen nižji prag zaznavanja predmeta (0,4) in prvotni prag zaznavanja predmeta za CD3 (0,7). Za oceno delovanja CNN na IHC WSI z umetnim svetlim poljem v tej študiji so bili kot testni niz v tej študiji uporabljeni štirje IHC WSI z umetnim svetlim poljem (CD8 in CD20 pri dveh bolnikih). Pikčaste opombe (n=1115) so bile ustvarjene s programsko opremo ASAP. Po uporabi mreže so bili izračunani natančnost, priklic in rezultat F1- za oceno uspešnosti CNN. Detekcije so veljale za resnično pozitivne, če so bile najdene znotraj 4 µm (povprečni premer limfocita) od zemeljske oznake resnice. Ko sta bili najdeni dve zaznavi znotraj območja 4 µm, se je samo zaznava, ki je bila najbližje opombi, štela za resnično pozitivno. Kasneje je bil CNN I za odkrivanje limfocitov uporabljen za analizo vseh IHC WSI umetnega svetlega polja, ki predstavljajo markerje citoplazemskih limfocitov (CD3, CD4, CD8 in CD20).

Odkrivanje limfocitov CNN II

Analiza IHC WSI umetnega svetlega polja z vzorci jedrskega obarvanja (kot sta jih predstavila T-bet in GATA3), kanali, ki predstavljajo DAPI in CD4, so bili izbrani za kombinacijo v enem WSI (4). Vektorji madežev, pridobljeni v prejšnjih študijah, so bili uporabljeni za umetno obarvanje signala DAPI modro (hematoksilin) ​​in signala CD4 rjavo (DAB), kar je povzročilo umetno svetlo polje IHC WSI (5).

potrebno usposabljanje, validacija in testiranje novega CNN. V ta namen smo iz kontrolnega tkiva FFPE ledvic, tonzil in slepiča izrezali devet preparatov. Ti preparati so bili IHC-obarvani z anti-Tibetom (klon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, ZDA) in anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Nizozemska) protitelesa. Diapozitivi so bili digitalizirani z digitalnim skenerjem diapozitivov Pannoramic 250 Flash II pri ločljivosti 0,12 μm/piksel. Dva opazovalca sta z uporabo programske opreme ASAP ustvarila opombe s 5726 pikami v različnih regijah. Opombe s petih diapozitivov so bile uporabljene za usposabljanje arhitekture U-Net CNN z uporabo obližev 256 × 256 slikovnih pik z velikostjo slikovnih pik 0,49 μm/piksel. Dva WSI sta bila uporabljena za validacijo CNN in za določitev praga zaznavanja objekta (0,4). Učinkovitost CNN na tradicionalnem IHC WSI je bila ocenjena na nizu zadržanih testov dveh IHC WSI. Učinkovitost CNN na IHC WSI z umetnim svetlim poljem je bila ocenjena na sekundarnem testnem nizu, ki je sestavljen iz štirih IHC WSI z umetnim svetlim poljem (Tibet in GATA3 od dveh bolnikov) z opombami 1082 pik. Natančnost, odpoklic in F1-ocena so bili izračunani za oceno uspešnosti na obeh nizih testov. Zaznave so veljale za resnično pozitivne, če so bile najdene znotraj 4 µm od zemeljske oznake resnice. Ko sta bili najdeni dve zaznavi znotraj območja 4 µm, se je samo zaznava, ki je bila najbližje opombi, štela za resnično pozitivno. Kasneje je bil CNN II za odkrivanje limfocitov uporabljen za analizo vseh IHC WSI z umetnim svetlim poljem, ki predstavljajo jedrske (limfocitne) markerje (Tibet in GATA3).

Odkrivanje makrofagov CNN

V nasprotju z detekcijo limfocitov identifikacija posameznih makrofagov ni nedvoumna. Zlasti v gručastih prizorih je mogoče pričakovati precejšnjo stopnjo variabilnosti opazovalca. Zato je bilo veliko večje število primerov in človeških opomb uporabljenih za usposabljanje namenskega, tretjega CNN za odkrivanje makrofagov CD68 plus in CD163 plus. Zbrani so bili preparati, obarvani z IHC (n=111) iz naravnega in presajenega ledvičnega tkiva. IHC barvanje je bilo izvedeno z uporabo anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danska ali klon KP1, M0876, Dako, Danska) ali anti-CD163 (klon MRQ -26 ali 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) protitelo. Diapozitivi IHC so bili digitalizirani s panoramskim 250 digitalnim skenerjem diapozitivov Flash II ali Aperio AT2 Slide Scannerjem (Leica Biosystems, Wetzlar, Nemčija) pri ločljivosti 0.24 ali 0 .25 μm/piksel. Štirje opazovalci so ustvarili 37.709 pikčastih opomb v več ROI v WSI z uporabo protokola za makrofagne opombe, o katerem so se dogovorili po začetnih pilotnih poskusih. Opombe iz 101 diapozitiva so bile uporabljene za usposabljanje arhitekture YoloV2 CNN [29]. Yolo je še posebej primeren za naloge, namenjene odkrivanju. Omrežje, sestavljeno iz sedmih konvolucijskih plasti, je bilo usposobljeno na zaplatah 256 × 256 slikovnih pik, ekstrahiranih pri ločljivosti 0, 98 μm / slikovno piko z omejevalnimi okvirji 21 μm (na podlagi povprečne velikosti makrofagov). Deset WSI je bilo uporabljenih za validacijo CNN in za določitev praga zaznavanja objekta (0,45) in ne-maksimalnih parametrov zatiranja (0,05). Delovanje CNN na tradicionalnem IHC WSI je bilo ocenjeno na nizu zadržanih testov desetih IHC WSI. Učinkovitost CNN na IHC WSI z umetnim svetlim poljem je bila ocenjena na sekundarnem testnem nizu, ki je sestavljen iz štirih IHC WSI z umetnim svetlim poljem (CD68 in CD163 od dveh bolnikov) z opombami 1033 pik. Ocene natančnosti, odpoklica in F1 so bile izračunane za oceno uspešnosti na obeh nizih testov. Detekcije so veljale za resnično pozitivne, če so bile najdene znotraj 21 µm (povprečni premer makrofaga) od zemeljske oznake resnice. Ko je bilo najdenih več zaznav znotraj območja 21 µm, se je samo zaznava, ki je bila najbližje opombi, štela za resnično pozitivno. Kasneje je bila CNN za zaznavanje makrofagov uporabljena za analizo vseh IHC WSI umetnega svetlega polja, ki predstavljajo makrofagne markerje (CD68 in CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dvojna pozitivnost

Pozitivnost celic za dva markerja (dvojna pozitivnost) je bila ocenjena z določanjem števila slikovnih pik med zaznavanji celic v različnih kanalih. Če je bila razdalja med dvema detekcijama limfocitov<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Število celic je bilo izračunano znotraj ROI, gostota celic pa je temeljila na številu celic in površini označene ROI.

Prostorski odnosi

Avtomatizirano zaznavanje celic v WSI omogoča raziskovanje prostorskih razmerij med celicami. Povprečna najkrajša razdalja je bila določena (v regijah brez subkapsularne regije) za celice CD68 plus in celice CD3 plus, CD3 plus CD8 plus in CD20 plus v WSI panela I za obe skupini bolnikov ter med celicami CD163 plus in CD4 plus , CD4 plus Tbet plus in CD4 plus GATA3 plus v WSI za obe skupini bolnikov.

Obseg peritubularnih kapilar

Da bi ocenili obseg peritubularnih kapilar, so bili na Fidžiju analizirani nepomešani WSI, ki predstavljajo kanal CD34 (ImageJ različica 2.0.0, ZDA, makri in vtičniki: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI Reader") [30]. Pozitivne slikovne pike so bile določene s samodejnim določanjem praga in nato izražene kot odstotek skupnega števila slikovnih pik znotraj ROI.

Statistična analiza

V 6-tedenskih biopsijah so bile izračunane gostote naslednjih celičnih populacij: T-limfocitov (CD3 plus), citotoksičnih T-limfocitov (CD3 plus CD8 plus), B-limfocitov (CD20 plus), makrofagov (CD68 plus, plošče I in II), polarizirani makrofagi (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), limfociti T-pomočniki 1 (CD4 plus Tbet plus) in limfociti T-pomočniki 2 (CD4 plus GATA3 plus). Spearmanovi korelacijski koeficienti so bili izračunani za oceno, ali je prisotna korelacija med gostoto limfocitov T-pomočnika 1 in T-pomočnika 2 (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) in gostoto polariziranih makrofagov (bodisi CD68 plus CD163 plus bodisi CD163 plus). Opazili smo signal CD68 (fluorofor 540 nm) v umetnih CD4 (fluorofor 520 nm) IHC plošče I. Zato dodatno poročamo o gostoti celic za celice CD3 in CD8−. Za oceno razlik med skupinami bolnikov z različnimi rezultati IFTA poročamo o mediani, najmanjši in največji vrednosti gostote celic na skupino. Pomembne razlike v gostoti celic in obsegu peritubularnih kapilar (definiran kot odstotek CD34-pozitivnih slikovnih pik) med skupinami so bile ocenjene z uporabo Mann-Whitneyjevega U testa za neodvisne vzorce. S t-testom za neodvisne vzorce so ocenili, ali bolniki z različnimi rezultati IFTA kažejo bistveno drugačna razmerja med celicami CD3 in CD8-/CD3 in CD8 plus. Razlike med skupinami bolnikov v prostorskih odnosih celic CD68 plus in CD163 plus z drugimi imunskimi celicami so bile ocenjene glede pomembnosti z uporabo Mann–Whitneyjevega U testa za neodvisne vzorce.

Rezultati

Odkrivanje IHC pozitivnih celic na osnovi CNN

Da bi uporabili obstoječe CNN, ki so bili prvotno razviti za mikroskopijo s svetlim poljem, so bile fluorescenčne slike mTSA spremenjene v slike umetnega svetlega polja. Primeri regij, obarvanih z mTSA, z njihovimi ustreznimi slikami IHC v umetnem svetlem polju so vključeni na sliki 2. Primer IHC WSI v umetnem svetlem polju je prikazan na dodatni sliki 4. WSI z več ločljivostmi je mogoče odpreti in si ogledati v digitalnem ogledu diapozitivov. programska oprema, kot sta ASAP in Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Kot je prikazano na sliki 2, je bil IHC WSI z umetnim svetlim poljem primeren za avtomatizirano analizo CNN-jev, ki so bili prvotno razviti za tradicionalni IHC WSI.

Za kvantitativno oceno vnetnih celic v 6-tedenskih biopsijah presadkov, obarvanih z mTSA, so bili uporabljeni trije CNN: za odkrivanje limfocitov s citoplazmatskim (CNN I) in jedrnim (CNN II) barvanjem IHC in za odkrivanje makrofagov. Tabela 2 prikazuje zmogljivost CNN (rezultati natančnosti, priklica in F1-) za nize zadrževanja IHC WSI, obarvanih z DAB, in IHC WSI z umetnim svetlim poljem. Učinkovitost CNN je bila običajno tako dobra ali boljša od osnovne CNN, opisane prej (z oceno F1- 0,78), za katero se je pokazalo, da ima zmogljivost, primerljivo z izkušenimi ročnimi opazovalci [22]. . Medtem ko je zaznavanje limfocitov CNN II pokazalo nekoliko zmanjšano učinkovitost na navideznih slikah svetlega polja v primerjavi z resničnimi slikami DAB (na katerih se je uril CNN), je bilo pri CNN opaženo nasprotno za zaznavanje makrofagov.

Primer uspešne samodejne dvojne ocene pozitivnosti je vključen na sliki 3.

Korelacija različnih vrst celic

Najmočnejšo korelacijo so opazili med CD4 plus GATA3 plus celično gostoto in CD163 plus celično gostoto (Spearmanov koeficient 0.75, p < 0.001)="" v="" 6-tedenska="" biopsija="" (dodatna="" slika="" 5a).="" ta="" korelacija="" je="" bila="" šibkejša="" med="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" celično="" gostoto="" in="" cd163="" plus="" celično="" gostoto="" (spearmanov="" koeficient="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (dopolnilna="" slika="" 5b)="" .="" pri="" omejitvi="" celične="" populacije="" na="" dvojno="" pozitivne="" makrofage="" (cd68="" plus="" cd163="" plus)="" je="" bil="" spearmanov="" korelacijski="" koeficient="" 0.65="" (p="">< 0,01)="" s="" celicami="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" in="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" s="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" celice="" (dodatna="" slika="" 5c,="" d).="" vključitev="" subkapsularne="" regije="" v="" analize="" ni="" spremenila="">

Primerjava vnetnih infiltratov medbolnikov, pri katerih napreduje IFTA, v primerjavi z bolniki, ki ne prejemajo IFTA

Bolniki, pri katerih je po 6 mesecih napredovala IFTA, so v biopsijah, vzetih 6 tednov po presaditvi, pokazali znatno večjo gostoto celic CD163 plus (mediana 505 celic/mm2) v primerjavi z bolniki, ki niso napredovali do IFTA (mediana 370 celic/mm2; p=0 .043) (tabela 3). Vključitev subkapsularne regije je povzročila rahlo zmanjšanje tega učinka (p=0.051). V obeh ploščah sta bila uporabljena CD68 in CD4. Predmetna stekelca, obarvana z mTSA ploščo I, so pokazala večjo pozitivnost na CD68 kot preparati, obarvana z mTSA ploščo II. Gostota celic CD4 je večja pri plošči mTSA II v primerjavi s ploščo mTSA I (tabela 3).

Obseg peritubularnih kapilar je bil podoben v 6-tedenskih biopsijah bolnikov z DGF z različnimi izidi IFTA (tabela 3), tako pri izključitvi (p=0.74) kot pri vključitvi (p=0.90) subkapsularne regije iz/v analizi.

Ocena razmerja celic CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus celic je pokazala znatno višje razmerje pri bolnikih z<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Povprečna najkrajša razdalja od celic CD68 plus do celic CD3 plus, CD3 plus CD8 plus in CD20 plus (panel I) ter od celic CD163 plus do celic CD4 plus, CD4 plus Tbet plus in CD4 plus GATA3 plus (panel II) se med skupinami bolnikov ne razlikujejo bistveno. Rezultati so prikazani na sliki 4.

izvleček cistanke: izboljša delovanje ledvic in telesno moč

Diskusija

V tej študiji smo razvili metodo za natančno in objektivno kvantifikacijo vnetnih celičnih filtratov v biopsijah presadka bolnikov s presajeno ledvico in DGF, ki se izogne ​​obsežnemu serijskemu rezanju biopsijskega materiala ledvic. V ta namen smo združili multipleksno IHC, ojačanje signala s tiramidom, multispektralno slikanje in kvantifikacijo s CNN. Bili smo prvi, ki smo multispektralne podatke z ploščicami pretvorili v eno samo umetno kromogeno sliko na marker celice, kar je olajšalo analizo WSI in uporabo CNN, zasnovanih za IHC s svetlim poljem. Zasnovali smo dva nova CNN-ja za odkrivanje z jedrom obarvanih limfocitov in makrofagov ter pokazali posplošljivost CNN-jev, razvitih na tradicionalnem IHC WSI, na IHC WSI z umetnim svetlim poljem. Uporabnost naše metode je bila dokazana z uporabo kvantitativnih rezultatov, ki so jih pridobili CNN za preučevanje korelacije vnetnega mikrookolja v 6-tedenskih biopsijah bolnikov z DGF z razvojem IFTA 6 mesecev po presaditvi.

Uporabili smo komercialno dostopen ročni komplet za barvanje za multipleks IHC za vizualizacijo imunskih celic in peritubularnih kapilar v nadzornih biopsijah, pridobljenih 6 tednov po presaditvi. Postopek večkratnega obarvanja je bil sestavljen iz več korakov pranja, inkubacije in vrenja tkiva ter vključuje več raztopin reagenta. Obsežne validacije metod in kontrole kakovosti so zato velikega pomena, priporočljiva pa je tudi uporaba specifičnih protiteles, ki zagotavljajo dosledno intenzivnost obarvanja. Kljub izvedenim korakom validacije so bili v kanalih CD4 preparatov iz mTSA plošč I in II opaženi vzorci obarvanja, podobni makrofagom. Cikli obarvanja CD4 in CD68 niso bili izvedeni zaporedno, zato tega pojava ni moglo povzročiti nepopolno odstranjevanje protitelesa CD68 (dodatna tabela 1). Čeprav so bili opisani redki pojavi dvojne pozitivnosti makrofagov s CD4 [31], je verjetnejša razlaga v bližini emisijskih spektrov fluoroforjev, ki so bili uporabljeni za vizualizacijo CD4 (520 nm) in CD68 (540 nm), ki sta oba zajeta. s filtrsko kocko FITC fluorescenčnega mikroskopa. To lahko povzroči "krvavitev" močnega signala CD68 v kanal CD4. Velik del tega signala je bil izključen iz analize v panelu I, ker so bile za splošno analizo celic T-pomočnic uporabljene le celice CD4 plus, ki so bile dvojno pozitivne s CD3. Kljub temu smo se odločili posredno oceniti tudi splošne celice T-pomočnice, pri čemer kot zamenjavo uporabimo CD3 in CD8−. V plošči II je bil CD4 uporabljen izključno v kombinaciji s Tibetom in GATA3, kar je omejilo tveganje za uporabo lažno pozitivnih detekcij.

Nižjo pozitivnost na CD68 so opazili na plošči II v primerjavi s ploščo I. Domnevamo, da je to posledica sterične inhibicije z usedlino tiramida, ki pripada CD163 ("umbrella effect") [32]. Opazili smo bistveno več CD163-pozitivnih celic v proučevani kohorti kot v tkivu tonzil, ki smo ga uporabili za preverjanje sterične inhibicije, kar morda pojasnjuje, zakaj ta učinek ni bil odkrit med validacijo.

Multiplex IHC je bil kombiniran z multispektralnim slikanjem za pregled tumorskega mikrookolja v več onkoloških študijah, nedavno pa tudi za analizo zavrnitve ledvičnega alogenskega presadka [33–35]. Da bi izluščili prispevek vseh markerjev v preparatih mTSA, so rezine posnete s sistemom Vectra ali podobnim fluorescenčnim mikroskopom z multispektralno nastavitvijo. Po snemanju pregledne slike z majhno povečavo sistem Vectra razdeli tkivo na ploščice in ploščice samodejno skenira multispektralno. Posledica tega so slikovne ploščice z več prispevajočimi spektri. Ker so spektri posameznih fluoroforjev znani iz vnaprej posnete spektralne "knjižnice", je možno razdeliti multipleksne ploščice na več posameznih ploščic, ki predstavljajo prispevek vsakega fluoroforja ("nemešanje"). V večini študij se nepomešane slike naknadno analizirajo s komercialno programsko opremo. V mnogih primerih ti programi ne podpirajo analize WSI, imajo težave pri analiziranju celic v gručah in pogosto niso odporni na artefakte in variacije obarvanja. Pretvarjanje nepomešanih ploščic v umetne IHC WSI s svetlim poljem nam je omogočilo uporabo obstoječega CNN, posebej zasnovanega za odkrivanje limfocitov v IHC [22] (imenovanega CNN I za odkrivanje limfocitov). Ta mreža lahko zazna posamezne in združene limfocite z visoko natančnostjo, hkrati pa je odporna na obarvanje ozadja (slika 2, CD3). Poleg tega smo usposobili dva nova CNN za detekcijo celic z jedrnimi vzorci obarvanja (Tibet, GATA3) (limfocitna detekcija CNN II) in za detekcijo makrofagov. Znano je, da je makrofage težko odkriti zaradi njihovega razpršenega vzorca obarvanja. CNN za zaznavanje makrofagov je bil zato usposobljen z uporabo opomb štirih različnih strokovnjakov. Pred izdelavo opomb je bilo načrtovanih več sestankov, na katerih so razpravljali in ocenili merila za označevanje makrofagov. Rezultat tega je mreža, ki lahko zazna makrofage na ponovljiv način, medtem ko je robustna za nespecifično obarvanje (tabela 2, slika 2 in dopolnilna slika 6). Kolikor vemo, je to prvi algoritem za odkrivanje makrofagov v skeniranih histopatoloških odsekih. Učinkovitost vseh treh omrežij smo preizkusili na testnem nizu, sestavljenem iz tradicionalnih IHC WSI (podobnih tistim, ki se uporabljajo med usposabljanjem) in na sekundarnem testnem nizu, ki je bil sestavljen iz umetnega svetlega polja IHC WSI, ustvarjenega iz multispektralno posnetih slik. Vsi CNN-ji kažejo zelo dobre rezultate na primarnih testnih nizih in podobne F1-rezultate na sekundarnih testnih nizih. Meritve učinkovitosti zaznavanja limfocitov CNN I so bile izračunane na normalnem tkivu, artefaktih in celičnih skupinah. IHC z umetnim svetlim poljem drugega preskusnega niza ni vseboval tkivnih artefaktov in manj celičnih grozdov. To lahko pojasni splošno boljšo zmogljivost tega omrežja v drugem testnem nizu. CNN za zaznavanje makrofagov je bil usposobljen in preizkušen na opombah štirih različnih anotatorjev. Medtem ko so o merilih za opombe posebej razpravljali, so bile kljub temu opažene razlike v slogu za opombe. Občutljivost CNN je torej verjetno nekje na sredini skrajnosti sloga pripisov. Pripombe za drugi testni niz je ustvaril en pripomoček, ki se je na videz ujemal z občutljivostjo CNN.

Uporaba opisanih CNN-jev nam je omogočila raziskovanje vnetnega infliltrata z izjemno natančnostjo v edinstveni seriji strogo izbranih zgodnjih nadzornih biopsij bolnikov s presaditvijo in DGF.

Na žalost je bilo treba več vzorcev izključiti iz analize, večinoma zaradi nezadostnega preostalega tkiva po diagnostični obdelavi. Tudi z omejeno velikostjo nabora podatkov smo ugotovili znatno višjo gostoto celic CD163 plus v biopsijah bolnikov z DGF, ki so napredovali do razvoja IFTA, kar je v skladu s potencialno profibrotično vlogo teh celic [11]. Čeprav je bil opaženi trend skladen z objavljenimi podatki, nismo mogli potrditi škodljivega učinka zgodnje prisotnosti CD68 in makrofagov, o katerem so prej poročali pri drugih skupinah bolnikov s presajeno ledvico [7, 36, 37]. Ugotovili smo pozitivno korelacijo med gostoto celic CD4 plus GATA3 plus in celic CD163 plus, kar bi lahko potrdilo prispevek limfocitov T-helper 2 k profibrotičnemu mikrookolju. Čeprav v tej študiji niso bili odkriti nobeni novi napovedni biomarkerji za razvoj IFTA pri bolnikih z DGF, smo uspešno razvili metode za natančno, ponovljivo in razširljivo oceno vnetnega infliltrata v redkem tkivu, kot so biopsije presadka. Te metode so dragocene za prihodnje kvantitativne študije vnetja v histopatološkem tkivu.

Za lajšanje nadledvične utrujenosti s cistanche kliknite tukaj za več podrobnosti

Razpoložljivost podatkov

Prošnje za sodelovanje, ki vključujejo uporabo podatkov, predstavljenih v tej študiji, lahko naslovite na ustreznega avtorja (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) ali FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Zahvala

Zahvaljujemo se Marku Gorrisu in Kieku Verrijpu za njune nasvete o barvanju in slikanju z mTSA, Merijn van Erpu za razvoj prilagojene funkcionalnosti ImageJ ter Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg in Martijn Otten za ustvarjanje temeljne resnice za mrežo za zaznavanje makrofagov. Poleg tega se zahvaljujemo Irini Scheffner za njeno pomoč pri zbiranju kliničnih podatkov.

Avtorski prispevkiMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH in JAWML

zasnoval študijo. Materiale bolnikov in klinične podatke so zbrali in zagotovili JS, WG in FF. FF je koordiniral prizadevanja pri MHH. JHB, EJS in JK so ocenili diapozitiv PAS za odstotek IFTA. MH je izvedel barvanje z mTSA, validacije plošč I in II ter slikanje in odstranjevanje mešanja plošče I. VV slikana in nemešana plošča II. DJG je razvil metode za pretvorbo ploščic mTSA v WSI z umetnim svetlim poljem. MH je izvedlo konverzije. ZS-C je razvil CNN za odkrivanje limfocitov in napisal skripte za kvantifikacijo limfocitov. JL je razvil CNN za odkrivanje makrofagov in napisal skripte za kvantifikacijo makrofagov. MH je opravil kvantificiranje celic in kapilar. NSS je izračunal razdalje celic. MH, BS, LBH in JAWML so analizirali podatke. MH je izdelal figure in sestavil papir. Končno različico rokopisa so revidirali in odobrili vsi avtorji.

financiranjeTo delo je podprla pobuda ERACoSysMed (projekt SysMIFTA) kot del okvirnega programa Evropske unije Obzorje 2020, ki ga ponuja ZonMw (št. donacije 9003035004), s sofinanciranjem nemškega Ministrstva za raziskave in izobraževanje (BMBF), donacija št. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) in FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML je prejel honorarje za svetovanje od Philipsa (Nizozemska) in nepovratna sredstva od

ContextVision, Philips (Nizozemska) in Sectra (Švedska), zunaj predloženega dela. JK je prejela finančno podporo Dutch Kidney Foundation (projekt DEEPGRAFT, Grant No. 17OKG23).

Skladnost z etičnimi standardi

Konflikt interesovAvtorji izjavljajo, da ni konkurenčnih interesov.

Etična odobritev in soglasje za sodelovanjeZbiranje in analiza podatkov sta bili izvedeni z informiranim soglasjem pacienta in z odobritvijo etičnega odbora (št. 2765) medicinske fakultete v Hannovru.

Opomba založnikaSpringer Nature ostaja nevtralen glede trditev o pristojnosti v objavljenih zemljevidih ​​in institucionalnih povezavah.

Odprti dostopTa članek je licenciran v skladu z mednarodno licenco Creative Commons Attribution 4.0, ki dovoljuje uporabo, skupno rabo, prilagajanje, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju ali formatu, če navedete ustrezno priznanje izvirnemu(-im) avtorju(-om). ) in vir, navedite povezavo do licence Creative Commons in navedite, ali so bile narejene spremembe. Slike ali drugo gradivo tretjih oseb v tem članku so vključeni v licenco Creative Commons za članek, razen če je v kreditni liniji za gradivo navedeno drugače. Če gradivo ni vključeno v licenco Creative Commons za članek in vaša nameravana uporaba ni dovoljena z zakonskimi predpisi ali presega dovoljeno uporabo, boste morali pridobiti dovoljenje neposredno od imetnika avtorskih pravic.

Reference

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Zakasnjeno delovanje presadka pri presaditvi ledvice. Am J Transplant. 2011; 11: 2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Dejavniki tveganja za dolgotrajno izgubo presadka pri prejemnikih ledvičnega presadka s kronično disfunkcijo alogenskega presadka. Exp Clin Transplant. 2010; 8: 277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Povezava med zapoznelim delovanjem presadka in alogenskim presadkom ter preživetjem bolnikov: sistematični pregled in metaanaliza. Presaditev Nephrol Dial. 2009; 24: 1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Odloženo delovanje ledvičnega presadka: od mehanizma do prevajanja. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Točkovanje celotnega vnetja je boljše od trenutne ocene vnetja po Banffu pri napovedovanju izida in stopnje molekularnih motenj v ledvičnih alogenskih presadkih. Am J Transplant. 2009; 9: 1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Napovedovanje kasnejšega zmanjšanja delovanja ledvičnega alogenskega presadka iz zgodnjih nadzornih biopsij. Am J Transplant. 2005; 5: 2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Vloga makrofagov pri razvoju fibroze človeškega ledvičnega alogenskega presadka v prvem letu po presaditvi. Am J Transplant. 2014; 14: 2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Alternativno aktivirani makrofagi v patogenezi kronične poškodbe ledvičnega alogenskega presadka. Pediater Nephrol. 2015; 30: 1007–17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plastičnost makrofagov in interakcija s podskupinami limfocitov: rak kot paradigma. Nat Immunol. 2010; 11: 889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Ledvična mikrookolja in fenotipi makrofagov določajo napredovanje ali razrešitev ledvičnega vnetja in fibroze. Kidney Int. 2011; 80: 915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Makrofagi pri presaditvi organov. Frontiers Immunol. 2020; 11: 582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. Podskupine celic T helper 1, 2 in 17 pri bolnikih z ledvičnim presadkom z zapoznelim delovanjem presadka. Transpl Int. 2011; 24: 233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Točkovanje limfocitov, ki infiltrirajo tumor: od vizualne ocene do strojnega učenja. Seminar Cancer Biol. 2018; 52: 151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Metoda, ki temelji na analizi slike za kvantificiranje parametrov indeksa kronične poškodbe alografta. AMPS. 2006; 114: 440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Uporaba prelomnih algoritmov za segmentacijo gručastih jeder. Citometrija. 1997; 28: 289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. Učinkovit krožni prag. IEEE Trans Med Imaging. 2014; 23: 992-1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Anketa o poglobljenem učenju pri analizi medicinske slike. Med slika Anal. 2017; 42: 60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Analiza slike in strojno učenje v digitalni patologiji: izzivi in ​​priložnosti. Med slika Anal. 2016; 33: 170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Diagnostična ocena algoritmov globokega učenja za odkrivanje metastaz v bezgavkah pri ženskah z rakom dojke. JAMA. 2017; 318: 2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Histopatološka ocena ledvičnega tkiva na podlagi poglobljenega učenja. J Am Soc Nephrol. 2019; 30: 1968–79.