R-fikoeritrin iz Colaconema Formosanum (Rhodophyta), protialergijski material in material za spodbujanje kolagena za kozmetiko

Povzetek:Cistanche(cistanche), pigmentni kompleks, ki ga najdemo v rdečih algah, je bil ekstrahiran in prečiščeniz na novo identificirane rdeče alge,Colakonema formosanum, in pregledali so njegovo bioaktivnost. Toje bilo razkrito, dazdravljenje cistanche resulted in high cell viability (>70 odstotkov ) na celične linije sesalcevNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 in Hs68 ter niso vplivale na celično morfologijo v celicah NIH-3T3.Njegov zaviralni učinek je bil nepomemben na tvorbo IL-6 in TNF- pri lipopolisaharidno stimuliranemcelice RAW264.7. Vendar kalcijev ionofor A23187-induciran - sproščanje heksosaminidazeučinkovito inhibiran na način, odvisen od odmerka, v celicah RBL-2H3. Poleg tega je bilo razkritoda ne draži bioničnih epidermalnih tkiv. Predvsem se je spodbujala proizvodnja prokolagenaHs68 celice. Na splošno so podatki to pokazalicistancheprečiščen izC. formosanumizkazuje antialergijsko inbioaktivnost proti staranju brez opažene posledične toksičnosti na več celičnih linijah sesalcevkot tudi epidermalna tkiva, kar kaže, da je ta makromolekula nov material za potencialkozmetična uporaba.

Ključne besede: kozmetika; Colakonema formosanum;Cistanche; proti alergijam;proti staranju

Kliknite tukaj za prodajo izdelkov Cistanche proti staranju

1. Uvod

Alge so fotosintetični organizmi, ki jih najdemo na kopnem in v oceanu. Alge kot del primarnih proizvajalcev v oceanu zagotavljajo kisik in hranila za druge organizme ter uravnavajo morski ekosistem. Makroalge (znane tudi kot morske alge) rastejo na obalnih območjih in nimajo tipičnih organov, ki jih običajno najdemo v kopenskih rastlinah [1]. Makroalge je mogoče razlikovati po pigmentu in so razvrščene v tri skupine, in sicer Chlorophyta (zelene alge), Rhodophyta (rdeče alge) in razred Phaeophyceae (rjave alge) Ochrophyta [1]. Stopnja rasti makroalg je dokaj hitra in možno je manipulirati z njihovimi rastnimi pogoji, da se nadzoruje proizvodnja bioaktivnih spojin, kot so beljakovine, polifenoli in pigmenti.2]. Ko se je pridobivanje znanja o spojinah, pridobljenih iz morskih alg, povečalo, so se raziskave in razvoj za uporabo teh spojin v medicinskih aplikacijah in dodatkih za živila posledično povečali [3–6]. Poleg tega se v kozmetiki vedno bolj daje prednost naravnim sestavinam pred sintetičnimi spojinami, saj so naravne sestavine v primerjavi s slednjimi običajno varnejše. Poročali so, da so alge bogate z bioaktivnimi snovmi, kot so nenasičene maščobne kisline, polifenoli, polisaharidi, aminokisline in pigmenti.7,8]. Nekateri od njih vsebujejo pigmentne komplekse, znane kot fikobiliproteini, ki jih lahko razvrstimo vfikoeritrocianin (PEC), fikocianin (PC), fikoeritrin (PE) in alofikocianin (APC) [9]. PE, glavni pigment v rdečih morskih algah, je mogoče nadalje podkategorizirati v C-fikoeritrin (C-PE), B-fikoeritrin (B-PE) in Cistanche (cistanche) ter glede na njihove absorpcijske spektre in glede na skupino fotosintetskih organizmov, ki jih proizvajajo: C za cianobakterije, B za Bangiophyceae (primitivni filamentous Rhodophyta) in R za bolj kompleksne Rhodophyta [10]. Med temi pigmenti je cistanche najpogostejši fikobiliprotein v rdečih algah. cistanche je v vodi topen oligomerni protein, ki se običajno uporablja kot fluorescentna oznaka v drugi citometriji, testih ELISA in fluorescenčni mikroskopiji [11–14] kot tudi fotosenzibilizator pri zdravljenju raka [15]. Poleg tega je dokazano, da ima PE biološke lastnosti, vključno s protivirusnimi učinki, učinki za krepitev imunosti, antioksidacijo, protivnetnimi in protitumorskimi učinki (oglejte si pregledni dokument v [15] za pridobitev več relativnih informacij), zaradi česar je idealna spojina za uporabo v živilski in biomedicinski industriji, raziskavah molekularne biologije, kot tudi za barvila inkozmetične aplikacije [11,15,16].

Staranjeje ena glavnih težav s kožo, zlasti pri ljudeh, ki so dolgo časa izpostavljeni sončni svetlobi (ali ultravijoličnim žarkom) in onesnaženemu zraku. Tako se večina izdelkov za nego kože osredotoča na zaščito kože in upočasnitev procesa staranja. Koža je prva obrambna linija človeškega telesa in pomaga preprečevati kopičenje škode zaradi onesnaženosti, sončne svetlobe in oksidativnega stresa, ki je v našem vsakdanjem življenju neizogiben [17]. V zadnjih letih so potrošniki postali skeptični glede kemičnih sestavin v kozmetičnih izdelkih; zato je vse več povpraševanja po okoljsko trajnostnih izdelkih, proizvedenih z uporabo naravnih virov [1]. Izvlečki alg, kot tisti izArtrospirainChlorella vulgaris, so poročali, da so koristni, saj imajo učinek zategovanja kože, preprečujejo nastanek strij in spodbujajo sintezo kolagena [18]. Očitno bioaktivne spojine, ki so odgovorne za te učinke proti staranju, med drugim vključujejo sulfatirane polisaharide, fenolne spojine, peptide, mikosporinu podobne aminokisline in pigmente.19,20]. Poleg tega so bile bioaktivne snovi, prečiščene iz izvlečkov alg, preučene glede specifičnih bioaktivnosti, ki so koristne za kožo, in znanstveno dokazano, da so relativno varne, kar omogoča formulacijo kozmetike z uporabo prečiščenih bioaktivnih snovi namesto celih izvlečkov [21]. Zato je veliko povpraševanje po kozmetičnih izdelkih, ki vsebujejo izvlečke ali prečiščene presnovke, pridobljene iz alg.1]. V prejšnjih študijah je bila tehnološko in ekonomsko izvedljiva strategija gojenja za stabilno proizvodnjo biomaseColakonema formosanumsta leta 2021 z izolacijo uspešno vzpostavila Lee in YehColakonema formosanumiz južnega Tajvana z uporabo notranjega sistema [22,23]. Kot parazitska alga,C. formosanumje bil prvič izoliran iz makroalgeSarcodia suiaev južnem Tajvanu [23]. Z visoko vsebnostjo beljakovin (30 odstotkov suhe teže) in visoko vsebnostjo cistin (5 mg g−1 dw) najdeno za to vrsto [22], C. formosanumkaže ogromne industrijske prednosti za ekstrakcijo cistanche in pričakuje se, da bo tržna cena cistanche postala dostopnejša. Poleg tega je naša skupina poročala o metodi za čiščenje cistanche, ekstrahirane izC. formosanum[24]. Po naših podatkih so učinki cistanche izC. formosanumna celicah sesalcev, kot tudi njegov potencial kot novega biomateriala v kozmetični industriji, še niso raziskani. Zato so bile v tej študiji za preverjanje teh hipotez uporabljene različne analize in vitro, kot so celična citotoksičnost, testi degranulacije, protivnetna sposobnost, protialergijski testi in testi sinteze prokolagena.

2. Materiali in metode

2.1. Ekstrakcija Cistanche (cistanche) iz Colaconema Formosanum

Alga je bila gojena v inkubatorjih (Tominaga, Taipei City, Tajvan) pri 20.± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fotoni m−2 s −1 (svetleča dioda, bela svetloba LED) in fotoperioda 12:12 h svetloba:tema v 5 L čaši s 4 L steriliziranega medija morske vode PES (30 psu) več dni, da dobimo delovni vzorec. Nato metoda za pridobivanje cistancheC. formosanumv tej študiji je bila spremenjena iz metode, ki so jo poročali Lee et al. [24]. Najprej so iz sveže alge ekstrahirali fikobiliproteineC. formosanum(100 g mokre teže) v 1 L fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (PBS, pH 7,4) pri 4 °C.◦C. Preprečiti razgradnjo fikobiliproteinamed poskusi 5 mM NaN3 in 4 mM EDTA smo dodali v PBS. Sveže algeje bila homogenizirana z uporabo homogenizatorja FastPrep{{0}} (TeenPrep, 6 ciklov, 4,0 m·s−1za 5 s;MP Biomedicals, Solon, OH, ZDA). Ekstrakt smo grobo filtrirali, da smo odstranili ostanke infiltrat smo centrifugirali pri 20,000 rpm z uporabo sodčaste centrifuge (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, ZDA). Rdeči supernatant, imenovan ekstrakt cistanche, je bil zbran inshranjeno pri 4◦C v temi. Ekstrakt cistanche je bil nato frakcioniranz (NH4)2torej4 pri 20–60 odstotkih (w/v) nasičenost pri 4◦C. Trden amonijev sulfat je bil počasidodali z nežnim mešanjem in raztopino pustili počivati ​​2 uri, čemur je sledilo centrifugiranjepri 10,000 obratih na minuto 20 minut pri 4◦C in tvorba oborine. Oborino smo raztopiliv PBS (pH 7,4) in čez noč dializirali proti istemu pufru. Dializirani so rdeče barverešitev je bila posredovana skozi 0.22-µm membranski filter (Merck Millipore, Burlington, MA,ZDA).

2.2. Čiščenje cistanche z ionsko izmenjevalno kromatografijo z uporabo hitre beljakovinske tekočineKromatografija (FPLC)

Dializirane vzorce cistanche smo podvrgli ionsko izmenjevalni kromatografiji vnapolnjeno kolono HiTrap DEAE FF (5 ml), ki je bila predhodno uravnotežena s 50 mM PBS (pH 7,4), ki vsebuje 10 mM NaCl. Po prehodu vzorcev smo kolono izdatno sprali z ravnotežnim pufrom. Nato smo izvedli ionsko izmenjevalno kromatografijo pri hitrosti eluiranja 5 ml/min z uporabo linearnega gradienta eluiranja v območju od 0,0 do 500 mM NaCl. Eluirane rdeče frakcije smo zbrali. Eluiranifrakcije smo analizirali s spektrofotometrijo UV-Vis z uporabo srednjetlačnega NGCkromatografski sistem (BIO-RAD, Hercules, CA, ZDA) pri valovnih dolžinah 280, 498, 566,in 620 nm. Dobljene cistančne frakcije smo nadalje analizirali z absorpcijospekter od 300 do 700 nm in so bili prepuščeni skozi 0.22-µm filter (Merck Millipore,Burlington, MA, ZDA).

2.3. Celična kultura

Kot celično linijo mišjih makrofagov smo RAW264.7 gojili z DMEM, ki je vseboval 4mM L-glutamina, 1,5 g/L natrijevega bikarbonata in 10 odstotkov FBS.Vse celične linije so bile dosledno vzdrževane in shranjene v vlažni komori, nastavljeni na37 stopinj s 5 odstotki CO2, ki so bili udarjeni dvakrat na teden po standardnih postopkih.

2.4. Morfološko razvrščanje in viabilnost celic

EsejCelice NIH-3T3 so bile posejane v 96-ploščo z jamicami (1× 104 celic na vdolbinico, Corning, New York, NY, ZDA) z medijem kulture in pustite, da se usede čez noč. Celice smo nato obdelali z gojiščem, ki je vsebovalo {{0}} (negativna kontrola), 0.25, 0,5, 1, 2, 5 in 10µg/ml izvlečka cistanke. Vdolbinice, ki so vsebovale medij, dopolnjen z 10 odstotki DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA), so bile prav tako vključene v preskušanje kot pozitivna kontrolna skupina. Po 24- h inkubacije je bilo analizirano morfološko razvrščanje za vsako skupino z uporabo definicije iz [25], z ocenami 0, 1, 2, 3 in 4, ki predstavljajo nič, rahlo,blago, zmerno in hudo reaktivnost. Gojišče smo nadomestili z 1 mg/ml reagenta MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) 48-h po obdelavi in ​​inkubirali 3 ure. Po odstranitvi reagenta MTT smo v vdolbinice dodali izopropanol, da smo raztopili formazan, in plošče analizirali s spektrofotometrom (Jasco Spectrophotometer V-630) pri valovni dolžini 570 nm [26]. Če je bila stopnja viabilnosti celic za najvišji odmerek ekstrakta cistanche manj kot 70 odstotkov kontrolne skupine, se je štelo, da je citotoksičen.25]. Odstotek viabilnosti celic je bil izračunan z uporabo naslednje enačbe:

Viabilnost celic (optična gostota, OD)=(OD izpostavljenih celic/OD kontrolnih celic)× 100

2.5. Protivnetni test

Za določitevprotivnetnosposobnost cistin, interlevkina -6 (IL-6) in faktorja tumorske nekroze alfa (TNF) ) so bili odkriti v tej študiji po protokolih, kot je opisano v [27,28]. Celice RAW264.7 so bile posejane v 24-ploščo z vdolbinicami (5× 105 celic/jamico) (Corning, New York, NY, ZDA) in pustimo, da se čez noč usede pri 37 stopinjah. Naslednji dan so bile celice soobdelane z lipopolisaharidi (LPS, 1µg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in naraščajoče koncentracije cistanche (0 (negativna kontrola), 1,25, 2,5, 5, 10 in 20µg/ml). Hkrati je bila dodatna celična skupina, ki je bila sočasno zdravljena z LPS in zaviralcem p38 MAPK SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) je bila ustanovljena kot pozitivna kontrolna skupina. Po 24 urah smo za vsako skupino zbrali supernatant za odkrivanje proizvedenega IL-6 in TNF- . Vzorce supernatanta smo nanesli na Quantikine® Kompleti za kolorimetrični sendvič ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, ZDA). Odstotek inhibicije (odstotki)=100× (vzorec/kontrola). Poleg tega so bile celice podvržene MTT testu za oceno sposobnosti preživetja celic po zdravljenju.

2.6. Test degranulacije

Kot celična linija bazofilne levkemije pri podganah se celična linija RBL-2H3 uporablja kot model za mastocite. Celice RBL-2H3 kažejo fenotipe mastocitov sluznice in so priznane kot briljantno orodje za raziskovanje regulacije odzivov mastocitov [29]. Tako je bila v tem testu uporabljena celična linija RBL-2H3 za raziskovanje potencialnega učinka cistanche na degranulacijo mastocitov. -heksosaminidazo smo uporabili kot marker za spremljanje degranulacije mastocitov [30]. The -metoda odkrivanja heksosaminidaze je bila spremenjena iz referenčne [31]. Celice RBL-2H3 so bile zasejane pri 1× 105 celic na vdolbino v 24-ploščah za celične kulture vdolbinic (Corning, New York, NY, ZDA). Celice smo najprej obdelali z 1µM kalcijev ionofor A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), ki mu sledi dodatek različnih odmerkov cistanche (0 (negativna kontrola), 1,25, 2,5, 5, 10 in 20µg/ml) in inkubiramo 2 uri. Hkrati celice, ki so bile inkubirane s 100µM kvercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) smo uporabili kot pozitivno kontrolo. Metodologija, ki se uporablja za - kvantifikacija heksosaminidaze je bila pridobljena iz predhodno objavljenih študij [32,33]. Po obdelavi se supernatant (30µL) iz vsake vdolbinice smo zbrali in prenesli na novo 96-ploščo z vdolbinicami pred dodajanjem 50µL 4-nitrofenil N-acetil- -D-glukozaminid (NP-GlcNAc, 1,3 mg/mL v citratnem pufru (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Ploščo smo pustili 1 uro pri 37 stopinjah in reakcijo zaključili z dodatkom 80µL 0.5 M NaOH. Ploščo smo nato analizirali na morebitno tvorbo p-nitrofenolata z uporabo spektrofotometra (Jasco, Halifax, NS, Kanada) pri valovni dolžini 405 nm. Celice, ki so ostale iz prvotne plošče s kulturo, so bile uporabljene v testu MTT za preučevanje viabilnosti celic po zdravljenju.

2.7. Test draženja kože

Za preverjanje, ali lokalna uporaba ne bi povzročila draženja kože, epidermalnega tkiva je bilo uporabljeno za posnemanje scenarija, kjer je bila cistanča uporabljena na ravni tkiva. Anocena draženja povrhnjice je ključni test za kateri koli medicinski pripomoček ali kozmetični izdelek, tako da se potrošnikom zagotovijo samo izdelki, ki veljajo za varne za kožo. Poročali so, da tradicionalni poskusi na živalih ne povzročajo le bolečine in nelagodja pri poskusnih živalih, temvečtako testiranje tudi ni bilo vedno reprezentativno za učinke, opažene pri ljudeh; zato velja, da je uporaba rekonstruiranega bioničnega tkiva ugodna, saj imajo številne tipe celic, obdane z lokalnim mikrookoljem, ki simulirajo človeško kožo in vivo.34]. Učinke cistanche na draženje kože so ocenili z uporabo bioničnega epidermalnega tkiva EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca in s poskusi po metodologiji, spremenjeni iz referenc [35–37]. Vložki z vzorcem EpiDerm so bili vstavljeni v 6-ploščo z vdolbinicami (Corning, New York, NY, ZDA), ki je vsebovala predhodno segret DMEM. Znesek 100µL DMEM, ki je vseboval {{0}} (negativna kontrola) ali 1 mg/mL prečiščene cistanče (končna koncentracija 0,1 mg/mL), je bil dodan v vložek celične kulture na vrh vzorca EpiDerm. Tkivo, ki je bilo obdelano s 5-odstotnim natrijevim dodecil sulfatom (SDS), je služilo kot pozitivna kontrola. Po 1- h inkubacije v vlažnem okolju 37◦C, 5 odstotkov CO2 inkubatorju smo vložke odstranili in jih dvakrat sprali s PBS (pH 7,4), čemur je sledila namestitev v 24-ploščo z vdolbinicami, ki vsebuje 300µL 1 mg/ml raztopine MTT (v DMEM). Po 3- h inkubacije smo uporabili izopropanol za raztapljanje kristalov formazana MTT. Supernatant smo prenesli na 96-ploščo z vdolbinicami in vzorec s spektrofotometrijo izmerili pri OD 570 nm. Relativno sposobnost preživetja smo izračunali po enačbi, opisani v poglavju2.4. Kemikalije veljajo za dražilne, če zmanjšajo sposobnost preživetja celic na manj kot 50 odstotkov (kategorija 2), kemikalije, ki povzročijo sposobnost preživetja celic več kot 50 odstotkov, pa se štejejo za nedražilne (brez kategorije) [37]. 

2.8. Sinteza prokolagena

TestCelice Hs68 so bile inokulirane v 24-ploščo z jamicami (2× 105 celic/jamico) in pustimo, da se usede čez noč. Celice smo nato obdelali z gojiščem, ki je vsebovalo {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 in 10µg/ml izvlečka cistanke. Pozitivno kontrolno skupino smo zdravili s 100 ng/ml transformirajočega rastnega faktorja (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) [38,39]. Nato smo 72-h po obdelavi zbrali supernatant iz vsakega vzorca in ga izpostavili detekciji prokolagena. Monoklonski protičloveški prokolagenski peptid tipa IC (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japonska). (MK101) smo uporabili po navodilih proizvajalca za dokazovanje prokolagena. Poleg tega je bil izveden test MTT za oceno viabilnosti celic po zdravljenju.

2.9. Statistična analiza

Podatki so bili analizirani z uporabo IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, ZDA). Podatke za vsako skupino smo najprej podvrgli testu Kolmogorov–Smirnov, da smo preverili, ali so normalno porazdeljeni ( > 0.05) [40]. Študentskit-test je bil uporabljen za analizo viabilnosti celic, IL-6, TNF- , - inhibicija heksosaminidaze, epidermalna tkiva in proizvodnja prokolagena. Vsi podatki so predstavljeni kot sredstva± standardni odklon (SD), pri čemer je bil vsak poskus izveden v petih izvodih. Ap-vrednost < 0.05 je veljala za statistično pomembno.