R. Vesicarius L. ima nefroprotektivni učinek proti oksidativnemu stresu, ki ga povzroči cisplatin
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Mahmudul Hasan1, Večina. Sayla Tasmin2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Md. Abu Reza1in Ariful Haque2*
Povzetek
Ozadje:Cisplatin je izjemno zdravilo proti raku, vendar se je njegova uporaba izjemno zmanjšala zaradi hude nefrotoksičnosti. R. vicarious L. je listnata zelenjava z očitnim antiangiogenim, protivnetnim, antiproliferativnim, hepatoprotektivnim in nefroprotektivnim potencialom. Zato je bila ta študija zasnovana za pregled njegovega metanolnega ekstrakta (RVE) glede morebitnega nefroprotektivnega učinka.
Metode:Predvsem in vitro je bila antioksidativna aktivnost RVE potrjena na podlagi sposobnosti 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) za lovljenje prostih radikalov. Nato so mišje samce Swiss Albino zdravili s cisplatinom (2,5 mg/kg) 5 zaporednih dni, da so povzročili nefrotoksičnost. Okrevanje od nefrotoksičnosti je bilo natančno preučeno z zdravljenjem živali z RVE (25, 50 in 100 mg/kg) intraperitonealno (ip) naslednjih 5 zaporednih dni. Po končanem zdravljenju smo miši žrtvovali in zbrali ledvice. Del smo ga homogenizirali v natrijevem fosfatnem pufru za ovrednotenje ravni malondialdehida (MDA), drugi del smo uporabili za ovrednotenje ekspresije genov (NQO1, p53 in Bcl-2). Poleg tega je bila sposobnost RVE za nevtralizacijo vodikovega peroksida (H2O2) ocenjena v celicah HK-2 in vitro. Končno so bile bioaktivne fitokemikalije v RVE določene s plinsko kromatografsko-masno spektrometrijo (GC-MS).
Rezultati:RVE je in vitro pokazal antioksidativno aktivnost v odvisnosti od odmerka z vrednostjo IC50 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Zdravljenje z RVE je izjemno (p < {{0}}.05)="" zmanjšalo="" vsebnost="" mda="" v="" ledvičnem="" tkivu.="" poleg="" tega="" je="" bila="" ekspresija="" genov="" nqo,="" p53="" in="" bcl-2="" znatno="" (p=""><0,05) zmanjšana="" na="" način,="" odvisen="" od="" odmerka,="" zaradi="" dajanja="" rve.="" rve="" je="" značilno="" (p="">< 0,05)="" spremenil="" raven="" h2o2="" v="" celicah="" hk-2="" na="" skoraj="" normalno.="" iz="" gc-ms="" deset="" spojin,="" vključno="" s="" tremi="" znanimi="" antioksidanti="" "4h-piran-4-en,="" 2,="" 3-dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil-"="" ,="" "heksadekanojska="" kislina"="" in="" "skvalen".="" izvleček="" je="" bil="" bogat="" z="" alkaloidom="">
Zaključek:Na splošno ima RVE zaščitni učinek pred poškodbami ledvic, ki jih povzroča cisplatin.
Ključne besede:Cisplatin, R. vicarious, miši, ledvice, celice HK-2, oksidativni stres, gen NQO1
Cistanche deserticola preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec
Uvod
Oksidativni stres je posledica nesorazmerja med tvorbo reaktivnih kisikovih spojin (ROS) in rednimi antioksidativnimi obrambnimi mehanizmi [1]. Redne biokemične reakcije, pogosta izpostavljenost neugodnemu okolju in povečan vnos ksenobiotikov povzročajo nastanek ROS [1]. ROS medsebojno delujejo s cisteinskimi ostanki redoks občutljivih signalnih molekul, vključno s transkripcijskimi faktorji, proteinskimi tirozin fosfatazami in proteinskimi kinazami; posledično oksidacija tiolnih skupin na teh ostankih vodi k spremembam ciljnih proteinov, bioloških učinkov, signalnih zmogljivosti, imunosti in dodatnih paradigem žive/mrtve celice [2]. Kemične vrste, ki vsebujejo kisik in imajo reaktivne lastnosti, so znane kot ROS, ki vključuje proste radikale in neradikalne molekule, kot sta superoksid in H2O2 [3]. Oksidativni stres, ki ga povzroča ROS, je povezan z etiologijo številnih bolezni, vključno z rakom. Akutna mieloična levkemija (AML) je rakava rast krvnih celic v kostnem mozgu. Celični in molekularni dogodki, na katerih temelji AML, vključujejo poškodbe DNK, klonsko razmnoževanje, povečano celično smrt in nadaljnjo genetsko nestabilnost, ki so posledica oksidativnega stresa, ki ga povzroči ROS [4]. Človeška fiziologija je bila obdarjena s številnimi mehanizmi, ki lahko ustvarijo antioksidante za zaščito pred oksidativnim stresom, kar vodi do zaščite celic pred toksičnimi učinki in služi preprečevanju bolezni [5]. Vendar celice razvijejo endogene mehanizme za preprečevanje oksidativnega stresa in ohranjanje potrebnih ROS [6].
NAD(P)H: kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1) je flavoencim [7], ki lahko katalizira dvo- ali štirielektronsko redukcijo in to lastnost uporablja za razstrupljanje kininov [8]. Lahko zaščiti celice pred oksidativnimi poškodbami tako, da zadrži redoks kroženje ob strani in zmanjša nastajanje prostih radikalov [8]. Poleg ksenobiotičnega razstrupljanja je NQO1 vključen tudi v nevtralizacijo superoksida, modulacijo proteasomske razgradnje p53 [9], inhibicijo Bcl-2 [10] in povečano dovzetnost za poškodbe celic [11].
Cisplatin je prvo zdravilo proti raku na osnovi platine, ki ga je odobrila Uprava za prehrano in zdravila (FDA) [12]. Cisplatin izvaja apoptozo z indukcijo oksidativnega stresa in prekomerne ekspresije tumor supresorskega gena p53 [12]. Številni neželeni učinki, vključno z nefrotoksičnostjo, hepatotoksičnostjo, gastrotoksičnostjo, ototoksičnostjo, mielosupresijo in nevrotoksičnostjo, so posledica oksidativnega stresa, ki ga povzroči cisplatin [12]. Ti neželeni učinki so izjemno zmanjšali uporabo cisplatina, čeprav ima izjemno protirakavo delovanje. Dobro je znano, da cisplatin inducira oksidativni stres in zavira gen NQO1 v mišjih ledvicah [13]. Zato postaja iskanje in potrjevanje učinkovitih naravnih virov antioksidantov področje ozaveščanja. Uživanje prehranskih antioksidantov rastlinskega izvora, kot so flavonoidi, karotenoidi in fenolne spojine, lahko vodi do zaščite pred srčno-žilnimi boleznimi, katarakto in rakom [14].
R. vicarious (Polygonaceae) je v bengalščini znan kot "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" [15]. Raste v puščavskih in polpuščavskih območjih Azije, Avstralije in Severne Afrike [16]. Je malo raziskana ogrožena rastlina v Bangladešu. V Bangladešu ljudje zaužijejo celotno rastlino kot zelenjavo po kuhanju s soljo, različnimi začimbami in oljem. Včasih ljudje uporabljajo samo sveže liste v mešani solati kot alternativo solati. Surov list je rahlo kisel, po kuhanju pa postane zelo kisel. Poleg tega se v ribje jedi med kuhanjem običajno vmeša manjše število listov, da imajo rahlo kiselkast okus.
Ta rastlina se uporablja kot zelenjava in zdravilna rastlina po vsem svetu [17]. Listi in semena se uporabljajo kot protistrup za kačji in škorpijonov strup [17]. V ljudskem zdravljenju se R. vicarious že dolgo uporablja za zdravljenje bolezni jeter, slabe prebave, zaprtja, hemoroidov, bruhanja, vetrov, srčnih težav, bolečin, motenj vranice, dispepsije, zobobola, bronhitisa, astme, garij, levkoderme in kot odvajalo, želodec, predjed, tonik, diuretik in analgetik [18]. Ta rastlina vsebuje številne biološko pomembne spojine, vključno s flavonoidi, antrakinoni, karotenoidi, vitamini, lipidi in organskimi kislinami, ki so dobro znani kot antioksidanti, protimikrobna sredstva in sredstva proti raku [19]. Vsak del te rastline vsebuje kvercetin (flavonoide) v povišani količini [15]. Ta rastlina vsebuje 0.25 mg vitamina A, 1,33 mg vitamina C, 2,37 mg vitamina E [15], 3,38 mg flavonoidov in 5,66 mg polifenolov [20] na 100 g suhe teže.
Shahat in sodelavci [21] so pokazali antiangiogene in antiproliferativne učinke metanolnega (80-odstotnega) izvlečka R. vicarious nadzemnega dela proti hepatocelularnemu karcinomu na modelu podgan. Druga študija je pokazala in vitro antiangiogeni potencial ekstrakta R. vicarious [22]. Metanolni ekstrakt celega R. vicarious ščiti pred hepatotoksičnostjo, ki jo povzroča ogljikov tetraklorid in vivo [23]. Protivnetni učinek pri kuncih je bil očiten z metanolnim ekstraktom listov R. vicarious [24]. Nedavna študija [25] je poročala o in vivo nefroprotektivnem učinku frakcioniranega etanolnega ekstrakta R. vicarious proti toksičnosti gentamicina in kalijevega dikromata.
Ob upoštevanju zgornjih informacij smo želeli pregledati učinek izvlečkov R. vicarious (RVE) v smislu okrevanja po nefrotoksičnosti, ki jo povzroča cisplatin, z ohranjanjem izražanja gena NQO1 v živalskem modelu.
koristi cistanche za zdravje: zdravljenje bolezni ledvic
Materiali in metode
Kemikalije in reagenti
Cisplatin in 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) sta bila kupljena pri SIGMA-ALDRICH (ZDA).
Komplet za kolorimetrično analizo kreatinina (ID izdelka – 700,460) je bil kupljen pri Cayman Chemical (ZDA). Dulbeccov modificirani Eagle's Medium (DMEM), fetalni goveji serum (FBS) in antibiotik (10,000 U/mL penicilina in 10,000 ug/mL streptomicina) so bili kupljeni pri Gibcu (Gibco Laboratories, ZDA). Komplet ROS-Glo™ H2O2 Assay in GoTaq® qPCR Master Mix sta bila pridobljena pri Promegi (ZDA). Komplet za reverzno transkripcijo TIAN-Script M-MLV je bil kupljen pri TIANGEN (Kitajska), primerji pa pri IDT (Integrated DNA Technologies, Malezija). Vse druge kemikalije in reagenti, uporabljeni v tem poskusu, so bili analitske kakovosti.
Zbiranje rastlinskih vzorcev in priprava ekstrakta
Sveže nadomestne rastline R. so bile kupljene na lokalnem trgu v Sonadighi, Rajshahi, Bangladeš. Vzorec rastline je identificiral in potrdil dr. Ahmad Humayan Kabir, Oddelek za botaniko, Univerza Rajshahi, Bangladeš. Vzorec pod vavčerjem št. 00095 je bil shranjen v herbariju Oddelka za botaniko Univerze Rajshahi. Nadzemni deli rastline so bili očiščeni, posušeni pri 37 stopinjah, z elektronskim sušilnikom zmleti v grob prah in shranjeni v zaprti posodi pri 4 stopinjah. Fini prašek (10 g) smo raztopili v metanolu (500 ml). Vsebino smo sonificirali (Soniprep 150, Kitajska) pri 20 kHz 10 minut. Filtracija ekstrakta je bila izvedena s filtrirnim papirjem iz steklenih vlaken (Macherey NAGEL, GmBH, Nemčija) z DURAN Filtering Apparatus (Nemščina). Končno smo filtrat koncentrirali z uporabo liofilizatorja (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, ZDA). Izvleček so končno poimenovali RVE.
Test antioksidativne aktivnosti in vitro
In vitro antioksidativna zmogljivost RVE je bila izvedena na podlagi odstranjevanja DPPH, kot je opisano prej [26] z malo spremembami. Sposobnost RVE za odstranjevanje radikalov DPPH je bila ocenjena na podlagi pretvorbe vijolične barve DPPH v rumeno barvo. Reakcijska mešanica v vsaki mikrocentrifugalni epruveti (2 ml) je vsebovala 950 μL metanolne raztopine radikalov DPPH (0,1 mM) in 50 μL RVE iz petih različnih koncentracij (200, 500, 1000, 2000 in 4000 ug). /ml metanola), da dobimo končne koncentracije 10, 25, 50, 100 in 200 ug/ml. Druga epruveta, ki je vsebovala 50 μL metanola in 950 μL metanolne raztopine DPPH, je bila ohranjena kot kontrola. Epruvete pustimo 30 minut v temnem prostoru. Absorbanco zmesi smo izmerili pri 517 nm s spektrofotometrom GENESYS 10S UV-VIS (Thermo SCIENTIFIC, ZDA). Končno je bil odstotek aktivnosti lovljenja radikalov (RSA) izračunan na podlagi razbarvanja DPPH z uporabo naslednje formule odstotek RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100, kjer je ADPPH absorbanca raztopine DPPH (kontrola) in ARVE je absorbanca raztopine RVE. Koncentracija, pri kateri je RVE povzročil 50-odstotni RSA, je bila označena kot vrednost IC50 in je bila izračunana z uporabo grafa, ki prikazuje odstotek RSA glede na različne uporabljene koncentracije RVE.
Poskusne živali in eksperimentalni načrt
Miši samci Swiss Albino, stari 42 dni (30–32 g telesne teže), so bili aklimatizirani 1 teden pred začetkom poskusa v sobi (temperatura približno 25 ± 2 stopinji in ~ 50-odstotna vlažnost, 12-urni cikel temno/svetlo). Pitna voda in hrana sta bili zagotovljeni ad libitum.
Miši so bile naključno ločene v osem skupin (n {{0}}). Prvo (kontrolno) skupino smo zdravili z 0.2 ml 0,9-odstotnega NaCl. Naslednje štiri skupine so bile zdravljene s cisplatinom v odmerku 2,5 mg/kg 5 dni v intervalu 24 ur. Po dajanju cisplatina je ena skupina (druga skupina) ostala brez nadaljnjega zdravljenja in dodeljena kot kontrolna skupina pod stresom. Tretja, četrta in peta skupina so bile nadalje zdravljene z RVE pri 25, 50 oziroma 100 mg/kg 5 dni. Nadaljnje tri skupine so bile 5 dni zdravljene samo z RVE pri 25, 50 oziroma 100 mg/kg. Cisplatin in RVE smo raztopili v destilirani vodi. Vsa zdravljenja so bila dana intraperitonealno. Po 24 urah zadnjega zdravljenja so bile živali evtanazirane po izpahu materničnega vratu [25]. Nato so s škarjami odprli peritonej, po punkciji srca odvzeli kri in s kleščami odvzeli ledvice. Krv je bila podvržena preverjanju ravni kreatinina v serumu. Ledvice so bile podvržene ocenjevanju ravni malondialdehida in izražanja genov.
Merjenje serumskega kreatinina
Serumski kreatinin je bil izmerjen s kompletom za kolorimetrično analizo kreatinina-700,460 (Cayman Chemical, ZDA) po protokolu proizvajalca, ki je priložen kompletu.
Merjenje peroksidacije lipidov v ledvicah
Malondialdehid (MDA) je končni produkt lipidne peroksidacije v ledvičnem tkivu in se običajno meri kot indikator proizvodnje ROS. Vendar je bila raven MDA izmerjena v ledvičnem tkivu v skladu s predhodno študijo [27]. Najprej smo ledvično tkivo homogenizirali v natrijevem fosfatnem pufru (0.1 M, pH 7,4). Reakcijsko raztopino, ki je vsebovala 0.8 odstotkov tiobarbiturne kisline (1,5 ml), 8,1 odstotka SDS (200 μL), 20 odstotkov (pH 3,5) ocetne kisline (1,5 ml) in dH2O (600 μL), smo dodali 100 µL homogeniziranega tkiva in zmes nato inkubiramo pri 95 stopinjah 1 uro. Po ohlajanju smo zmesi centrifugirali pri 10,000 g 10 minut pri 4 stopinjah in izmerili absorbanco supernatanta pri 532 nm s standardnim 1, 1, 3, 3- tetra metoksi propanom. Količino skupnih beljakovin smo izmerili s kompletom Bradford Protein Assay (BIO-RAD, ZDA) in s primerjavo s standardnim govejim serumskim albuminom (BSA). Intenzivnost lipidnih peroksidov je bila izražena kot nanomoli (nM) MDA na miligram (mg) beljakovin.
Verižna reakcija polimeraze v realnem času (PCR v realnem času)
PCR v realnem času je bil izveden, kot je opisano prej [28, 29]. Celotno RNA iz ledvičnega tkiva smo izolirali z uporabo reagenta TRIzol® (Invitrogen) v skladu s protokolom, ki ga je predložil proizvajalec. Izolirano RNA (1 ug) smo nato pretvorili v cDNA. Najprej smo vzeli 2 μL naključnega heksamera (10 μM), 2 μL dNTP (10 mM), 1 ug RNA in H O brez nukleaze do 15 μL in inkubirali 5 minut pri 70 stopinjah. Zmes smo takoj postavili na led za 2 minuti. Nato smo v vsako epruveto dodali 4 μL pufra 1. verige (5x) in 1 μL M-MLV reverzne transkriptaze ter inkubirali 10 minut in 50 minut.
min pri 25 stopinjah oziroma 42 stopinjah. Končno je bil encim reverzne transkriptaze M-MLV inaktiviran z inkubacijo zmesi pri 95 stopinjah 5 minut. Sintetizirane produkte cDNA smo izpostavili PCR v realnem času za kvantifikacijo ekspresije genov NQO1, p53 in Bcl-2 z uporabo specifičnih primerjev (Tabela 1). Vsaka reakcija (10 μL) je bila izvedena v trojniku, ki je vsebovala 5 μL GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, ZDA), 0,5 μL (10 mM) vsakega primerja, 3 μL vode brez nukleaze in 1 μL cDNA v 48-reakcijskih ploščah z vdolbinicami. Toplotno cikliranje je bilo izvedeno z uporabo naprave za PCR v realnem času (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, ZDA) z naslednjimi pogoji cikla: 95 stopinj za 10 minut, čemur je sledilo 40 ciklov pri 95 stopinjah za 30 s, 50 stopinj za 30 s in 72 stopinj za 25 s. Specifičnost reakcij PCR je bila potrjena z analizo krivulje taljenja pri 95 stopinjah za 15 s, 45 stopinjah za 15 s in 95 stopinjah za 15 s. Specifičnost reakcij PCR je bila potrjena z analizo krivulje taljenja pri 95 stopinjah za 15 s, 45 stopinjah za 15 s in 95 stopinjah za 15 s. Relativno kvantifikacijo genske ekspresije smo izvedli z uporabo endogenega gena GAPDH kot kontrole na podlagi metode ΔΔCq.
Kultura in zdravljenje celic
Človeško epitelno celično linijo ledvičnih proksimalnih tubulov, celice HK-2, smo vzdrževali v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS in antibiotiki (50 e./ml penicilina in 50 ug/ml streptomicina) v inkubatorju s 5 odstotki CO2 in 95 odstotek vlažnosti pri 37 stopinjah.
Merjenje H2O2
Raven H2O2 v celicah HK-2 je bila ocenjena s kompletom ROS-Glo™ H2O2 Assay (Promega, ZDA) v skladu s protokolom, ki ga je zagotovil proizvajalec kompleta. Celice HK-2 (1000 celic) v 70 μL DMEM smo dali v vdolbinice 96-mikrotitrske plošče z vdolbinicami. Ko smo omogočili pritrditev celic na površino stene, smo 10 μL DMEM iz vdolbinic mikrotitrske plošče nadomestili z 10 μL cisplatina (25 μM v DMEM) in hranili v inkubatorju 12 ur. Nato smo dodali 10 μL RVE, da smo dosegli končne koncentracije 125, 250 in 500 ug/mL v DMEM in inkubirali nadaljnjih 12 ur. Nato je bilo v vsako vdolbinico dodanih 20 μL raztopine substrata H2O2 in 100 μL raztopine za odkrivanje ROS-Glo™. Reakcijo smo inkubirali pri sobni temperaturi 20 minut. Na koncu smo izmerili luminiscenco z uporabo GloMax Luminometer (Promega, ZDA).
GC-MS analiza
GC-MS analiza RVE (raztopljenega v metanolu) je bila izvedena, kot je opisano prej [30] z uporabo GCMS-QP2020 (SHIMADZU), ki vključuje samodejni vzorčevalnik (AOC{ {5}}s), samodejni injektor (AOC-20i) in plinski kromatograf (GC-2010 Plus), povezan z masnim spektrometrom, opremljenim s SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Kapilarna kolona Sil MS (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Nosilni plin Helij je bil vzdrževan pri konstantnem pretoku 1,72 mL/min, volumen vbrizga 5 μL pa je bil izpostavljen razmerju 10:1. Temperatura injektorja je bila vzdrževana pri 220 stopinjah, temperatura ionskega vira je bila 280 stopinj, temperatura pečice je bila programirana od 80 stopinj (zadrži 2 minuti), s povečanjem za 5 stopinj/min do 150 stopinj (čas zadrževanja 5,0 min), nato 5 stopinj/min do 280 stopinj, ki se konča z 8-minutno izotermijo pri 280 stopinjah. Masni spektri so bili posneti pri 1, 5 kV z intervalom skeniranja 0, 5 s, vzorec pa je bil voden v območju 45–350 m/z. Zakasnitev topila je bila od 0 do 3 minute, skupni čas delovanja GC-MS pa 55 minut. Relativno koncentracijo zaznanih spojin smo izmerili s primerjavo njene povprečne površine vrha s celotno površino. Interpretacija masnega spektra v GC-MS je bila izvedena z uporabo baz podatkov Nacionalnega inštituta za standarde in tehnologijo (NIST), vključno z NIST08, NIST08s in NIST14.
Statistična analiza
Statistične analize so bile izvedene z ANOVA po Dunnettovem testu T3 z uporabo programske opreme IBM SPPS (različica 20). Podatki so izraženi kot srednje vrednosti ± standardni odklon (SD). Pomembna primerjava je bila obravnavana na str<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Rezultati
Test antioksidativne aktivnosti in vitro
Čeprav so prej poročali, da ima RVE antioksidativno delovanje, smo ponovno preverili antioksidativno aktivnost našega ekstrakta z uporabo DPPH sposobnosti lovljenja prostih radikalov. RVE je nevtraliziral DPPH odvisno od odmerka (slika 1). RVE je pokazal precejšnjo antioksidativno aktivnost in vitro in izračunana vrednost IC50 RVE je bila 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Merjenje serumskega kreatinina
Raven serumskega kreatinina pri miših je bila po dajanju cisplatina pomembno (p < {{0}},05)="" povečana="" (tabela="" 2).="" zdravljenje="" z="" rve="" je="" izjemno="" (p="">< 0,05)="" izboljšalo="" raven="" kreatinina="" v="" odvisnosti="" od="" odmerka="" (tabela="">
Merjenje peroksidacije lipidov v ledvicah
V primerjavi s kontrolo je cisplatin znatno (p < {{0}},05)="" povečal="" vsebnost="" mda="" v="" ledvičnem="" tkivu="" miši="" (tabela="" 3).="" nasprotno="" pa="" je="" zdravljenje="" z="" rve="" znatno="" (p=""><0,05) povrnilo="" mda="" na="" skoraj="" normalno="" vrednost="" v="" odvisnosti="" od="" odmerka="" (tabela="">
PCR v realnem času
Cisplatin je značilno (p < {{0}}.05)="" zmanjšal="" izražanje="" mrna="" nqo1="" za="" 0.15-krat="" in="" povečal="" mrna="" p53="" in="" bcl-2="" izraz="" za="" 24="" oziroma="" 42-krat="" (slika="" 2).="" rve="" je="" znatno="" (p="">< 0.05)="" ublažil="" ekspresijo="" mrna="" nqo1,="" p53="" in="" bcl-2="" na="" način,="" ki="" je="" odvisen="" od="" odmerka="" (slika="" 2).="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" samo="" s="" cisplatinom,="" se="" je="" izražanje="" mrna="" nqo1="" povečalo="" za="" 3,57,="" 6,36="" in="" 9.28-krat="" pri="" 25,="" 50="" in="" 100="" mg/kg="" rve="" (slika="" 2a).="" spet="" se="" je="" ekspresija="" mrna="" p53="" zmanjšala="" za="" 0.63,="" 0,46="" in="" 0.21-krat="" pri="" 25,="" 50="" oziroma="" 100="" mg/kg="" rve="" (slika="" 2b).="" ekspresija="" mrna="" bcl-2="" se="" je="" prav="" tako="" zmanjšala="" za="" 0,71,="" 0,40="" in="" 0.32-krat="" pri="" 25,="" 50="" oziroma="" 100="" mg/kg="" rve="" (slika="" 2c).="" vendar="" pa="" niso="" bile="" ugotovljene="" pomembne="" (p=""> 0,05) spremembe v ravni izražanja genov NQO1, p53 in Bcl-2 zaradi zdravljenja z RVE (slika 3).
H2O2merilni test
Pri merilnem testu H2O2 je H2O2raven je veljala za sorazmerno s luminiscenco. Dajanje cisplatina je znatno (p < {{0}}.05)="" povečalo="" raven="" h2o2="" za="" 2.2-krat="" (slika="" 4).="" zdravljenje="" z="" rve="" je="" znatno="" zmanjšalo="" (p="">< 0.05)="" raven="" h2o2="" za="" 0,25,="" 0,38="" in="" 0.49-krat="" pri="" 125,="" 250="" in="" 500="" ug/ml,="">
GC-MS analiza
Skupaj 10 spojin (tabela 4 in slika 5), vključno z "Isoborneol, pentametildisilanil eter (seskviterpenski alkohol)", "Timin (pirimidinska nukleobaza)", "4H-Pyran-4-one, 2,{{ 8}}dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil- (saponin)", "Heksadekanojska kislina, metil ester (metil ester maščobne kisline)", "9,12- Oktadekadienojska kislina, metil ester (metil ester maščobne kisline)", "9-oktadecenojska kislina (Z)-, metil ester (metil ester maščobne kisline)", "Metil stearat (metil ester maščobne kisline)", "Diizooktil ftalat (ester)«, »13-Dokozenamid, (Z)- (alkaloid)« in »Skvalen (triterpen)« so bili odkriti v RVE.
koristi cistanche tubolosa: znižanje lipidov v krvi
Diskusija
Naravni in sintetični antioksidanti so bili temeljito raziskani in pokazalo se je, da delujejo bodisi za preprečevanje bodisi za izboljšanje toksičnosti v fiziologiji živali [31]. Antioksidantna dopolnila so sestavine, ki se razvijejo bodisi s kemično sintezo bodisi z ekstrakcijo iz naravnih živil, vendar ti po sestavi niso enaki antioksidantom, ki so na voljo v hrani [5]. Zato se mnenja glede tega, ali imajo sintetični antioksidanti podobne zdravstvene koristi kot naravni antioksidanti, razlikujejo ali ne [32]. Prihaja potreba po zmanjšanju uporabe sintetičnih antioksidantnih dodatkov in iskanju alternativnih, poceni, obnovljivih, naravnih in po možnosti varnejših virov učinkovitih naravnih antioksidantov.
Eden najpomembnejših mehanizmov je pot faktorja, povezanega z jedrskim faktorjem eritroid-2-2 (Nrf2), ki na splošno ščiti celice pred oksidativnim stresom, ki ga povzročajo eksogeni ali endogeni stresorji [27]. Učinkoviti antioksidanti inducirajo izražanje Nrf2, ki se nadalje premakne v jedro in se veže na element antioksidativnega odziva (ARE), ki izzove izražanje razstrupljevalnega in antioksidativnega gena NQO1 faze II [33, 34]. NQO1 je široko in različno izražen na tkivno specifičen način. NQO1 je citosolni antioksidant flavoprotein, ki katalizira 2-elektronsko redukcijo kinonov v hidrokinone, kar ima za posledico razstrupljanje elektrofilov in pričakovanje redoks kroženja [35]. Glede na prejšnjo študijo [36], -lapachone aktivira NQO1, ki dodatno poveča intracelularno raven NAD plus in ščiti ledvico pred akutno poškodbo, ki jo povzroča cisplatin.
Znano je, da cisplatin povzroča poškodbe glomerulne filtracijske membrane z oksidativnim stresom, vnetjem in apoptozo, kar skupaj povzroči zmanjšano hitrost glomerularne filtracije in izgubo normalne prepustnosti membrane [37]. Zato je bila raven serumskega kreatinina povečana. Serumski kreatinin je eden od potencialnih označevalcev delovanja ledvic. Zdravljenje s cisplatinom je povečalo vsebnost MDA v ledvičnem tkivu, ki je sekundarni produkt peroksidacije lipidov, in to poročilo je enako kot v prejšnjih študijah [27, 35, 37, 38]. Zdravljenje z RVE je znatno zmanjšalo vsebnost MDA v ledvičnem tkivu. Hkrati se je znižala tudi raven kreatinina, kar kaže na izboljšavni učinek RVE.
Poleg tega se je ekspresija NQO1 znatno zmanjšala, ekspresija p53 in Bcl-2 pa se je znatno povečala po izpostavljenosti cisplatinu. V smislu izražanja NQO1 in p53 in vivo je naš rezultat skladen s predhodno študijo [13]. Nedavna študija [39] je pokazala, da je cisplatin bistveno zmanjšal izražanje Bcl-2 v ledvicah miši, vendar smo presenetljivo ugotovili povečano izražanje. Ta razlika je lahko posledica razlike v odmerku [40], saj so Mohamed in sodelavci [39] uporabljali 8 mg/kg 12 dni, medtem ko smo mi uporabljali 2,5 mg/kg samo 5 dni. Druga študija [41] je navedla, da lahko cisplatin poveča izražanje Bcl-2 v odmerku, ko ni citotoksičen. Spet povečana ekspresija Bcl-2 senzibilizira celice za oksidativni stres [40].
Vendar pa je izražanje p53 nizko pri normalnih fizioloških pogojih, vendar se pričakuje, da bo po zdravljenju s cisplatinom povečano, ker to kemoterapevtsko sredstvo na osnovi platine aktivira od p53 odvisno apoptotično pot. Ko smo miši zdravili s cisplatinom, se je p53 znatno povečal v mišjih ledvicah v primerjavi s kontrolo. Drugi protoonkogen Bcl-2 je prav tako povezan s stopnjo izražanja NQO1. S posnemanjem ekspresije p53 smo ugotovili tudi, da so se ravni Bcl- 2 zvišale pri zdravljenju s cisplatinom, vendar so se po zdravljenju z RVE znatno ponovno pokrile. To je možno, da se kot odgovor na oksidativni stres aktivira gen p53 in povzroči zaustavitev celičnega cikla, staranje ali apoptozo [6]. Pri razstrupljanju se pogosto šteje, da je prekomerna ekspresija NQO1 povezana z apoptozo v rakavih celicah [10], čeprav je osnovni mehanizem apoptoze in prekomerne ekspresije NQO1 še vedno sporen. Poleg tega pri hepatocelularnem karcinomu prekomerna ekspresija NQO1 zmanjša ekspresijo Bcl-2 [10]. Protoonkogen Bcl- 2 ima tudi p53 kot korelacijo z izražanjem NQO1. p53 je transkripcijski faktor, specifičen za zaporedje, ki se aktivira s številnimi vrstami celičnega stresa [42], medtem ko je čezmerna ekspresija Bcl-2 delovala kot stabilizator mitohondrijskih por za olajšanje sproščanja citokroma-c ob oksidativnem stresu [12]. V našem primeru smo preverili oba genska odziva z zdravljenjem s cisplatinom v normalnem ledvičnem tkivu in ugotovili njuno povečano izražanje. Zdravljenje z RVE je vrnilo izražanje p53 in Bcl-2 na skoraj normalno na način, ki je bil odvisen od odmerka. Ta vrsta razveljavitve izraza Bcl-2 je bila prikazana tudi z uporabo čistilca ROS Trolox [43]. Poleg tega je bila raven H2O2 izrazito povečana tudi v celicah HK-2 zaradi zdravljenja s cisplatinom in vitro. Po zdravljenju z RVE se je raven H2O2 bistveno povrnila na približno normalno vrednost. To je morda posledica učinka zdravljenja z RVE, ki je povečal izražanje NQO1 [44], kar zagotavlja zaščito pred oksidativnim stresom [6].
GC-MS kromatogram je potrdil obstoj desetih spojin v RVE. Med njimi "4H-piran- 4-on, 2, 3-dihidro-3, 5-dihidroksi-6-metil-", "heksadekanojska kislina" in " Skvalen" so znani antioksidanti [45–47]. Te tri spojine skupaj so verjetno imele sinergističen nefroprotektivni učinek. Prejšnje študije so poročale tudi o indukciji izražanja NQO1 z vitaminom A [48], vitaminom C [49], vitaminom E [50], flavonoidi [51] in polifenoli [50]. Zato to poročilo predlaga razjasnitev, ali ta izvleček vsebuje kaj od vitamina A, vitamina C, vitamina E, flavonoidov in polifenola ali ne.
Zaključek
Celotna ugotovitev kaže, da je RVE fiziološko učinkovit pri zaščiti ledvic pred poškodbami, ki jih povzroča cisplatin. Zato je ključnega pomena razjasniti natančne spojine, ki so odgovorne za ublažitev nefrotoksičnosti, ki jo povzroča cisplatin, kar lahko postane koristno za uporabo pri ljudeh.
Zahvala
Avtorji so hvaležni Bangladeškemu svetu za znanstvene in industrijske raziskave (BCSIR), podružnica Rajshahi za zagotavljanje laboratorijske podpore za kvantificiranje RNA.
Prispevki avtorjev
MMH je izvajal eksperimentalno načrtovanje, eksperimentiranje, analizo in pripravo podatkov, pisanje in urejanje rokopisa, revidiranje in pripravo rokopisa; MST & MME opravila eksperimentiranje in analizo podatkov; AME & MAR sta prispevala k nadzoru in virom; AH je bil odgovoren za konceptualizacijo, nadzor, vire in urejanje rokopisa. Vsi avtorji
pregledal rokopis. Avtorji so prebrali in odobrili končni rokopis.
financiranje
Trenutno delo so financirali podporni projekt raziskovalcev Univerze Taif številka (TURSP - 2020/75), Univerza Taif, Taif, Savdska Arabija.
Dostopnost podatkov in materialov.
Vsi relevantni podatki so na voljo in se lahko na zahtevo posredujejo ustreznemu avtorju.
Izjave
Etična odobritev in soglasje za sodelovanje
Etiko za izvedbo tega poskusa je odobril Odbor za institucionalno živalsko, medicinsko etiko, biološko varnost in biološko zaščito (IAMEBBC), Inštitut za biološke znanosti (IBSc), Univerza Rajshahi, in je bila navedena pod številko obvestila 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Vse metode so bile izvedene v skladu s smernicami in predpisi, ki jih je določil zgoraj omenjeni etični odbor. Ta študija je bila izvedena v skladu s smernicami ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). "Soglasje za sodelovanje" ne velja za to študijo.
Podrobnosti avtorja
1 Laboratorij za molekularno biologijo in beljakovine, Oddelek za genetsko inženirstvo in biotehnologijo, Fakulteta za življenje in znanosti o Zemlji, Univerza Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladeš. 2 Laboratorij za molekularno patologijo, Inštitut za biološke znanosti, Univerza Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladeš. 3 Oddelek za biotehnologijo, Fakulteta za znanost, Univerza Taif, PO Box 11099, Taif 21944, Savdska Arabija. 4Oddelek za genetiko, Fakulteta za kmetijstvo, Aleksandrijska univerza, Aleksandrija 21545, Egipt.
Reference
1. Bagchi K, Puri S. Prosti radikali in antioksidanti v zdravju in bolezni: pregled. East Mediterr Health J. 1998; 4: 350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH, et al. Ferulat, aktivna sestavina pšeničnih kalčkov, izboljša neravnovesje PTK/PTP, ki ga povzroča oksidativni stres, in inaktivacijo PP2A. Toxicol Res. 2018; 34 (4): 333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Nekateri genetski profili v jetrih miši z Ehrlichovim ascitesom, ki nosijo tumor, pod stresom obsevanja. J Radiat Res Appl Sci. 2014; 7 (2): 188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY, et al. Vpletenost oksidativnega stresa v ponovitev akutne mieloične levkemije. J Biol Chem. 2010; 285 (20): 15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Prosti radikali, antioksidanti pri boleznih in zdravju. Int J Biomed Sci. 2008; 4: 89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Vloge NAD (P) H-kinon oksidoreduktaze 1 (NQO1) pri napredovanju raka in kemorezistentnosti. J Clin Exp Oncol. 2017; 6: 1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1) pri občutljivosti in odpornosti na protitumorske kinone. Biochem Pharmacol. 2012; 83 (8): 1033–40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: kinon akceptorska oksidoreduktaza 1 (NQO1), multifunkcionalni antioksidativni encim in izjemno vsestranska citoprotekcija. Arch Biochem Biophys. 2010; 501 (1): 116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP, et al. Zaviranje NADPH z dikumarolom: kinon oksidoreduktaza inducira zaviranje rasti raka trebušne slinavke prek mehanizma, ki ga posreduje superoksid. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Prekomerna ekspresija NAD (P) H: kinon oksidoreduktaza 1 zavira proliferacijo celic hepatocelularnega karcinoma in inducirano apoptozo z aktiviranjem poti AMPK/PGC-1. DNA Cell Biol. 2017; 36 (4): 256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Zatiranje NAD (P) H-kinon oksidoreduktaze 1 je povečalo občutljivost celic holangiokarcinoma na kemoterapevtska sredstva. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1–13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatin pri zdravljenju raka: molekularni mehanizmi delovanja. Eur J Pharmacol. 2014; 740: 364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-alilmerkaptocistein zmanjša s cisplatinom povzročeno nefrotoksičnost z zaviranjem apoptoze, oksidativnega stresa in vnetja. Hranila. 2017; 9 (2): 166.
14. Matkowski A. Rastlinska in vitro kultura za proizvodnjo antioksidantov—pregled. Biotechnol Adv. 2008; 26 (6): 548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Antioksidativna aktivnost Rumex vicarious L. v vegetativni fazi rasti. Asian J Pharm Clin Res. 2012; 5: 111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) v Avstraliji: ponovna obravnava. Nujcija. 1984; 5: 75–122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Induktorska aktivnost kinon oksidoreduktaze 1 nekaterih zdravilnih rastlin Savdske Arabije. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Profil bioaktivnih spojin Rumex vicarious L. J Food Sci. 2011; 76 (8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde-Filho PF, et al. Viri alfa-, beta-, gama-, delta- in epsilon-karotenov: pregled dvajsetega stoletja. Rev Bras. 2008; 18 (1): 135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Fitokemijski pregled, in vitro antioksidant in antibakterijsko delovanje ekstrakta Rumex vicarious L. Znanstvena študija Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017; 18: 367–76.
