Going Micro pri leptospirozni ledvični bolezni Ⅱ

4. Imunski odziv gostitelja na Leptospira spp.

Glavna pot okužbe z leptospirami je neposredna penetracija skozi sluznico ali odprto kožo s krvjo, tkivi, urinom ali okuženo vodo, ki se razširi po sistemskem krvnem obtoku in razširi v več organov, npr.jetra, pljuča in proksimalni tubulnefron v ledvicah, kjer se lahko razmnoži in preživi mesec dni [51]. V začetni fazi okužbe seprirojeni imunski odzivigra temeljno vlogo kot prva obrambna linija pri leptospirozi, saj vpliva na odzivreceptorji za prepoznavanje vzorcev, fagocitoza makrofagov, indukcija zunajceličnegakopičenje nevtrofilcev, inposeg v sistem komplementa [52].

Theimunski odzivpri ljudeh igra bistveno vlogo prirazvoj kliničnih znakov, tako kot dejavniki virulence nekaterih patogenih sevov. Večina človeških leptospiroz je asimptomatskih ali blagih in le v 10 % primerov se razvijejo hude oblike z večorgansko odpovedjo in povečano smrtnostjo, povezano zcitokinska nevihtain stanje imunske paralize. Patogene vrste stimulirajo humoralni odziv v fazi bakteriemije, čeprav je kasnejše vedenjeimunski odzivje nejasno. V študijah bolnikov z več kliničnimi manifestacijami leptospiroze je bila resnost klinične slike povezana z različnimi ravnmi citokinov v serumu, kot so TNF-, IL-10 in IL-6 [53], vendar ta sklep ostaja sporen [54]. Ti pogoji so vodili do povečanega zanimanja za razumevanje imunskega odziva na splošno in bioloških dogodkov, ki se zgodijo med okužbo.

KAKO ČASA TRAJA, DA CISTANCHE ZAČNE DELOVATI?

4.1. Leptospira in sistem komplementa

Proteolitična aktivnost leptospiralnih proteaz proti zunajceličnemu matriksu omogoča, da okužba vstopi v krvni obtok. Sistem komplementa v obtočnem sistemu je eden glavnih mehanizmov prirojenega imunskega odziva na patogene leptospire. Vendar je Leptospira razvila strategije za izogibanje napadu sistema komplementa z vezavo proteinov na molekule komplementa in proizvodnjo proteaz, kot je termolizin, termostabilen nevtralni encim metaloproteinaze, ki vpliva na verigo proteina C3. Patogeni sevi vežejo faktor H (FH), protein 1, povezan s faktorjem komplementa H (FHR-1), faktorju H podoben protein 1 (FHL-1) in vezavni protein C4b (C4BP), vsi ki so odgovorni za zaviranje sistema komplementa [55]. Obstajajo tri glavne strategije za izogibanje komplementu patogenim leptospiram [55,56] z interferenco regulatorjev komplementa gostitelja, proteaze gostitelja in bakterijske proteaze. Za regulatorje komplementa Leptospira uporablja faktor H (FH; regulator alternativne poti komplementa) in C4 vezavni protein (C4BP; regulator klasičnih in lektinskih poti komplementa), da pospeši razpad konvertaz C3 in deluje tudi kot kofaktorja za faktor I za cepitev C3b in C4b [57,58]. Leptospiralni protein (LcpA) skupaj z vitronektinom (Vn; regulator terminalne poti) veže C9 in zavira njegovo polimerizacijo [59], s čimer potencialno blokira tvorbo membransko aktivirajočega kompleksa (MAC) [60]. Poleg tega patogena leptospira veže več gostiteljskih proteaz, kot je aktivator plazminogena tipa urokinaze (uPA), ki inducira aktivni plazmin [61] (serinska proteaza) za prebavo C3b, C4b in C5 na površini leptospire [62]. Poleg tega lahko metaloproteaze in termolizin, endogena proteaza Leptospira, cepijo in inaktivirajo več proteinov komplementa (C2, C3, C4 in faktor B) [60]. Kombinacija regulatorjev komplementa iz gostitelja in patogene leptospire olajša kolonizacijo bakterij v ciljnih organih gostitelja [63].

4.2. Leptospira in nevtrofilci

Med okužbo patogene vrste Leptospira sprožijo močno aktivacijo nevtrofilcev in provnetni odziv. Nevtrofilci so pomembni za nadzor mikroorganizmov, vendar prispevajo tudi k poškodbam tkiva v gostitelju. Dokazano je bilo, da nizke ravni ekstracelularnega kopičenja nevtrofilcev zaradi nizke aktivnosti nevtrofilcev v obtoku povečajo leptospiremijo, kar kaže, da je intravaskularna tvorba rekrutiranja nevtrofilcev lahko kritična pri preprečevanju zgodnjega širjenja patogenih leptospir [64].

4.3. Leptospire in makrofagi

V začetni fazi okužbe z leptospiro imajo makrofagi pomembno vlogo pri izločanju spirohet. Ta efektorski mehanizem je skupaj z učinkovitim citokinskim odzivom povezan s fagocitnim nadzorom in širjenjem okužbe, čeprav Leptospira spp. dokazano inducira apoptozo v makrofagih po poti Fas/FasL-kaspaze-8/-3 ter olajša njihovo preživetje in proliferacijo v gostitelju zaradi sproščanja apoptoze in endonukleaze, ki inducira mitohondrijski faktor makrofagi [65]. Nedavne raziskave so bile izvedene na mikrotranskriptomu makrofagov, okuženih z Leptospira, da bi določili epigenetske mehanizme, kot je posttranskripcijska regulacija z RNA. Makrofagi, okuženi z Leptospiro, so pokazali, da so mikroRNA (miRNA) regulirane z okužbo s spiroheto, kar dokazuje, da je ta regulacija ključnega pomena pri odzivu teh celic imunskega sistema pri okužbi z Leptospiro [66]. V človeških makrofagih ima aktivacija vnetja, ki ga posredujejo reaktivne kisikove spojine in lizosomski katepsin B, ki nastane zaradi okužbe z leptospiro, visoke ravni NLRP3 in IL-18, kar daje prednost proizvodnji IL-1 in vodi do visokega možnost fagocitoze in hitro modeliranje nekaterih citokinov v korelaciji z odpornostjo na leptospirozo [67].

4.4. Humoralni odziv na leptospiro

Za specifični humoralni odziv proti leptospiram je značilna proizvodnja protiteles IgM in IgG tretji dan po pojavu simptomov. Poleg tega so poročali o proizvodnji IgA od prvega dne do devetega meseca po okužbi; dejansko je bilo povečanje IgM uporabljeno kot alternativni ukrep pri zgodnji diagnozi leptospiroze [68]. Učinek humoralnega odziva pri ljudeh z leptospirozo omogoča serološko diagnozo po naravni okužbi [69]. Najpomembnejši vidik humoralnega odziva pri okužbi z leptospiro je lahko tvorba zaščitnih protiteles. Cepiva, ki so trenutno na voljo za leptospirozo, so sestavljena iz popolnih celičnih pripravkov in imajo omejitve, kot so nizka učinkovitost, številni stranski učinki, nizko ustvarjanje imunskega spomina in pomanjkanje navzkrižne zaščite za razlike serovarjev. Zato je razvoj novih cepiv potreben za nadzor bolezni, trenutno pa potekajo raziskave za proizvodnjo cepiv iz genetske imunizacije [70]. Leptospirine OMP veljajo za antigen z boljšo imunogenostjo za limfocite B, ki vključujejo strukturne epitope OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} in LipL41263-282 [71]. Ti epitopi so obetavni kandidati za razvoj univerzalnega cepiva.

4.5. Prilagodljivi imunski odziv na leptospiro: T-celice in citokini

Patogene vrste Leptospira inducirajo imunski odziv, ki ga posredujejo limfociti T in B, spremlja pa ga izražanje citokinov, ki so lahko povezani z gravitacijskimi kartami. Aktivacija celic T med okužbo z leptospirami sproži vnetni odziv, predvsem s proizvodnjo citokinov. To je ključnega pomena za zgodnjo eliminacijo okužbe, vendar lahko nenadzorovana proizvodnja protivnetnih citokinov povzroči tudi prekomerno proizvodnjo citokinov, ki ji sledi stanje imunske paralize, kar lahko povzroči sepso in večorgansko odpoved. Limfociti T proizvajajo IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- in TNF-, ki delujejo kot kemoatraktanti za pridobivanje levkocitov na mestu okužbe. Zanimivo je, da so se in ex vivo naivne celice δ T razmnožile v kulturah mononuklearnih celic periferne krvi (PBMC), stimuliranih z antigeni Leptospira, skupaj s proizvodnjo IL-17 in IFN [72]. Poleg tega, medtem ko so miši divjega tipa, okužene z leptospirozo, pokazale višje ravni obilice citokinov, vključno z IL-4, IL-10 in IL-13, v primerjavi z neokuženimi mišmi, je kronična mišja mišja posledica Leptospira nefritis (miši Daf1-/-) so pokazale večjo ekspresijo aktina v gladkih mišicah, IL-10, IL-13, vendar ni razlike med IL-12 in IL{{21} } ravni [73]. Kot taka imata lahko Daf1 in IL-17 ključno zaščitno vlogo pri napredovanju kronične ledvične bolezni kot povezava med mišjo kronično ledvično boleznijo, ki jo povzroči Leptospira, in ledvično fibrozo [72,73]. Vendar pa hipoteza o izbranem citokinskem odzivu pri napredovanju bolezni pri človeški leptospirozi zaenkrat še ni dokončna. Pri bolnikih s hudo leptospirozo in prizadetostjo pljuč so bile dosežene povišane vrednosti IL-6, CXCL8 in IL-10 v primerjavi z bolniki z blago leptospirozo [53]. Te visoke koncentracije citokinov pri bolnikih z leptospirozo poudarjajo njihovo ključno vlogo pri razvoju hude leptospiroze.

Pri bolnikih s hudo okužbo najdemo limfocite CD4+ T s provnetnim profilom in proizvajalci IL-2 in IFN-, medtem ko so CD4+ CD25 visoki proizvajalci IL-10 so skoraj odsotni. Zdi se, da regulacija imunskega odziva, ki ga posredujejo limfociti T, ne preprečuje poškodb tkiva, ki nastanejo zaradi vnetnega odziva na Leptospira. V limfocitih CD4+ T pri ljudeh s hudo leptospirozo je proizvodnja TNF- in drugih protivnetnih citokinov večja kot pri tistih z blago obliko bolezni, kar kaže, da se lahko ti citokini uporabljajo kot označevalci resnost v imunološki fazi okužbe [74]. Proizvodnja IL-10 je bila povezana s tveganjem smrti pri ljudeh z leptospirozo; vendar je študija, izvedena na izpostavljenih in asimptomatskih ljudeh, povezala proizvodnjo tega citokina z nadzorom vnetnega odziva in preživetja [74]. Med okužbo z leptospiro se vnetni mediatorji in delovanje nekaterih levkocitnih celic, kot so limfociti T, hitro uravnavajo pri odpornih posameznikih, v nasprotju s tem, kar se zgodi pri posameznikih s hudimi oblikami leptospiroze [75].

Če povzamemo, imunski odziv na okužbo z leptospiro ni popolnoma razumljen zaradi kliničnega vedenja bolnikov z leptospirozo, ki sodelujejo z različnimi virulenčnimi dejavniki bakterijskega genoma, kar daje leptospiri solidno patogeno sposobnost.

5. Klinične manifestacije

Klinične manifestacije leptospiroze so različne, od blagih, nespecifičnih simptomov, kot so gripi podobni simptomi (zvišana telesna temperatura, mialgija in glavobol), do hudih simptomov skupaj s končnimi poškodbami organov (npr. AKI, akutna odpoved jeter). in krvavitvena diateza, znana tudi kot Weilov sindrom), akutna hemoptiza zaradi pljučne krvavitve, akutna zmedenost zaradi aseptičnega meningoencefalitisa in akutno srčno popuščanje zaradi akutnega ali subakutnega miokarditisa [7]. V skladu s tem so trije kazalci suma okužbe z leptospirozo sestavljeni iz (i)akutna vročinska bolezen, (ii) zlatenica in (iii)akutna poškodba ledvic[12]. Napovedovalci hude oblike leptospiroze so huda mialgija na začetku, huda nagnjenost h krvavitvam in izrazita zlatenica. Zanimivo je, da prisotnost bodisi že obstoječegakronična ledvična bolezen(majhna velikost ledvice) ali povečane, kongestirane ledvice z anurijo so povezane z najslabšim izidom [12]. Zato je treba bolnike z ledvično boleznijo, povezano z leptospirozo, nemudoma zdraviti.

6. Diagnoza

6.1. Klinična diagnoza

Diagnoza leptospiroze temelji na zgodovini izpostavljenosti, dejavnikih tveganja in kliničnih manifestacijah. Visok indeks suma se lahko izogne ​​poznejšim poškodbam organov. Vendar se simptomi leptospiroze pogosto zamenjujejo z drugimi vzroki akutnega vročinskega sindroma, kot so okužba z mrzlico denga, malarija, hepatitis in aktivna avtoimunska bolezen. Pomanjkanje patognomoničnih znakov leptospiroze pomeni, da diagnoza okvirno temelji na oceni vročine in mialgije pri bolnikih z endemičnega območja. Zato je laboratorijska diagnoza leptospiroze nujna.

6.2. Laboratorijska diagnoza

Leptospirozo je težko diagnosticirati v laboratoriju, zlasti v akutni fazi. Izvede se lahko z neposredno identifikacijo spirohet ali njihovih komponent v telesnih tekočinah ali tkivih, izolacijo leptospir v kulturi ali odkrivanjem določenih protiteles v različnih kliničnih fazah. Leptospirozo je zaradi nejasnega kliničnega videza težko ločiti od bolezni, kot so malarija, mrzlica denga, rikecija, gripa, hepatitis in rumena mrzlica. Zato so za potrditev diagnoze potrebni laboratorijski testi. Odkrivanje protiteles proti leptospiram, samih leptospir ali njihove deoksiribonukleinske kisline je osnova za te teste (DNK). Trenutna laboratorijska diagnostika vključuje tako neposredno identifikacijo (odkrivanje spirohet Leptospira ali DNK v vzorcih ali izolacijo organizma iz vzorcev) kot posredno detekcijo (serološko diagnozo ali serologijo za ugotavljanje okužbe z leptospirami, ki temelji na dokazovanju specifičnih protiteles proti različnim Leptospiralni antigeni) (tabela 1).

6.2.1. Neposredni mikroskopski pregled, kultura in odkrivanje antigena

Leptospire so tanke, svetle, aktivno gibljive spirale z značilnim hitrim vrtenjem (trzajoča gibljivost) pod konvencionalnim temnopoljskim mikroskopom (DFM) in približno 10 leptospir/mL je potrebnih za detekcijo ene celice na polje. Pri enem tednu daljšem trajanju okužbe je v izkoristku DFM približno 10 % umrlih (od 100 do 90 %). Za povečanje občutljivosti, več posebnih metod obarvanja; Warthin–Starry srebrno barvanje [76] in imunsko barvanje (imunohistokemija, imunofluorescenca, imunomagnetno zajemanje antigena in imunoperoksidazno barvanje [77]), ki zahtevajo primarna protitelesa, specifična za serovar (v izolaciji ali kombinaciji).

Tabela 1. Laboratorijski testi za diagnozo leptospiroze.

LAMP, izotermno ojačanje, posredovano z zanko; PCR, verižna reakcija s polimerazo; NGS, sekvenciranje naslednje generacije; IHA, posredna hemaglutinacija; ELISA, encimski imunski test; IgM, imunoglobulin M; MAT, makroskopski test aglutinacije; MCAT, aglutinacijski test z mikrokapsulami; DNK, deoksiribonukleinska kislina; DFM, mikroskopija temnega polja

Vzporedno je možna kultura Leptospira iz krvi, urina, cerebrospinalne tekočine in biopsijskega tkiva v prvih nekaj dneh do 10 dni po pojavu simptomov bolezni (stadij leptospiroze). Ker počasi rastejo (čas podvojitve 6–8 ur), zahtevni in nagnjeni k kontaminaciji, je treba vzorce kulture hraniti vsaj 3–4 mesece, preden jih zavržemo kot negativne) s samo 23-odstotno občutljivostjo, vendar je nujno za test občutljivosti na zdravila [6]. Kot tak je gojišče EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) (kompleks oleinskega albumina) sestavljeno iz govejega serumskega albumina (frakcija V), Tweena 80, amonijevega klorida tiamina, monokalijevega fosfata, dinatrijevega fosfata in različnih hranil [78]. običajno uporabljajo, medtem ko so za nekatere serovarje potrebni bolj specializirani mediji T80/40/LH (polisorbat 40, hidrolizat laktalbumina, superoksid dismutaza in kunčji serum) [79]. Zdi se, da je Hornsby–Alt–Nally (HAN) dober medij za primarno izolacijo velikega in raznolikega nabora izbirčnih patogenih leptospir [80].

Odkrivanje leptospiralnih antigenov z imunoperoksidazo, imunofluorescenco ali imunomagnetnim sistemom za zajemanje antigenov je bilo razvito za vzorce z nizko bakterijsko obremenitvijo ali pa mikroskopije v temnem polju ni mogoče uporabiti, vendar se zaradi omejitve primarnih protiteles ne izvaja rutinsko [77]. Nasprotno, prepoznavanje nukleinske kisline z novim pomnoževanjem DNK; verižna reakcija s polimerazo (PCR) (tj. ugnezdeni PCR, kvantitativni PCR [qPCR]), izotermno pomnoževanje z zanko (LAMP) in sekvenciranje naslednje generacije (NGS) so dragoceni za zgodnjo in natančno laboratorijsko diagnozo, zlasti pri Izolacija leptospir z inokulacijo bioloških medijev in hibridizacijo DNA (sonda DNA) [81,82]. Različne leptospiralne tarče (kot je 16S ribosomska RNA) ali DNA je mogoče pomnožiti za diagnozo [83] in PCR v realnem času (RT-PCR) je bolj občutljiv in specifičen kot standardni PCR [84]. Ker se lahko nekateri primerji RT-PCR vežejo na nespecifično mesto, kar vodi do lažno pozitivnih rezultatov, so bili najnovejši testi multipleksne PCR v realnem času razviti z uporabo dveh sklopov primerjev [85]. Ugnezdeni PCR pomaga tudi pri odkrivanju bolj specifičnih in občutljivih mest DNK z dodatnimi sklopi primerjev [86,87]. Vendar pa so trenutni trendi za diagnozo leptospiroze uporaba seroloških in molekularnih tehnik, kot sta PCR in ELISA (lažje od zlatega standarda serološkega MAT), za države z omejenimi viri [88,89]. Poleg tega je tehnika LAMP [90] za odkrivanje gena 16S rRNA (rrs) stroškovno učinkovita, hitra in visoko učinkovita za odkrivanje patogenih leptospir v urinu. Trenutno je NGS najbolj natančno zasnovana od kulture neodvisna metoda za analizo jedra genoma v telesnih tekočinah (kri in urinu) [91] in prihodnja usmeritev testov leptospiroze bi bila usmeritev k molekularni klasifikaciji leptospir, ki presega omejitev kulturna izolacija leptospir iz kliničnih vzorcev. Zato je vrednost PCR pri klinični diagnozi leptospiroze še posebej velika in pojavlja se več sodobnih tehnik.

6.2.2. Odkrivanje protiteles proti leptospiri

Uporablja se več seroloških diagnoz; na primer testi protiteles, specifični za rod (indirektna hemaglutinacija [IHA], encimski imunosorbentni test [ELISA], Lepto Dri Dot [aglutinacija z lateksom], aglutinacija z mikrokapsulami [MCAT]) in testi protiteles, specifični za serovar (test mikroskopske aglutinacije [ MAT]) [92,93]. Kot taka so merila MAT za diagnozo (i) štirikratno zvišanje titra v parnih serumih (serokonverzija trenutne okužbe) ali (ii) en sam visok titer (večji ali enak 1:400 ali 1:800, višji pri epidemiji območja) (seropozitivnost) (protitelesa lahko vztrajajo nekaj časa po okužbi ali navzkrižno reagirajo z drugimi boleznimi). Poleg tega MAT zahteva živo ploščo vseh serovarjev Leptospira v regiji, s ploščo lokalno standardiziranih serovarjev [93,94] po Svetovni organizaciji za zdravje živali (19 antigenov, ki predstavljajo 15 seroskupin) [95]. Ker so protitelesa zaznavna 5–7 dni po okužbi, je lahko test MAT negativen (titer < 1:50) v prvih dneh okužbe. Diagnozo leptospiroze je mogoče opraviti z vzorci urina [96] z uporabo serologije in molekularne detekcije (16S rRNA), zlasti pri bolnikih z nedavno okužbo (MAT večji ali enak 1:800 ali ELISA IgM pozitiven ali oboje) [97] .

Z omejenimi sredstvi je rezultat klinične napovedi [98], ki temelji na ustrezni klinični anamnezi in povezanih laboratorijskih testih s točkovanjem v sedmih vidikih, naslednji: hipotenzija (3), zlatenica (2), bolečine v mišicah (2), AKI (1,5). , nizek hemoglobin (3), hipokaliemija s hiponatremijo (3) in nevtrofilija (1) (mejna povzeta ocena 4 ima površino pod karakteristično krivuljo delovanja sprejemnika {{10}}).78 ( 95 % IZ 0.68–0.89) za diagnozo leptospiroze [77]). Ta ocena verjetnosti Thai-Lepto ob sprejemu bi lahko bila diagnostično orodje za zgodnjo domnevno diagnozo leptospiroze pri bolnikih s hudim kliničnim sumom na to bolezen.