Vloga ledvičnega androgenega receptorja pri spolnih razlikah v presnovi amoniaka

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Autumn N. Harris et al

Povzetek

V presnovi in ​​strukturi amoniaka v ledvicah obstajajo razlike med spoloma, od katerih so mnoge posledicatestosteron. Cilj te študije je bil ugotoviti vlogo ledvičnega izražanjatestosteronakanoničnega receptorja, androgenega receptorja (AR), v teh spolnih dimorfizmih. Študirali smo miši zledvica-specifična AR delecija [KS-AR-knockout (KO)], ustvarjena s tehnikami Cre/loxP; kontrolne miši so bile Cre-negativne sorodnice iz legla (divji tip). Pri mišjih samcih, ne pa samicah, je KS-AR-KO povečal izločanje amoniaka, kar je odpravilo spolne razlike. Čeprav je strukturna velikost ledvic običajno vzporedna z izločanjem amoniaka, se je KS-AR-KO zmanjšalledvicavelikost, volumska gostota kortikalnih proksimalnih tubulov in višina celic kortikalnih proksimalnih tubulov pri samcih – nobena ni bila spremenjena pri samicah in volumska gostota zbiralnega kanala je bila nespremenjena pri obeh spolih. Analiza ključnih beljakovin, ki sodelujejo pri ravnanju z amoniakom, je pri mišjih samcih pokazala, da KS-AR-KO poveča ekspresijo fosfoenolpiruvat karboksikinaze (PEPCK) in Na þ -K þ -2Cl kotransporterja (NKCC2) ter zmanjša Na þ/H þ izmenjevalec izoforme 3 (NHE3) in ekspresije elektrogenega Na þ -bikarbonatnega kottransporterja 1 (NBCe1)-A. Pri mišjih samicah KS-AR-KO ni spremenil teh parametrov. Ti učinki so se pojavili, čeprav KS-AR-KO ni spremenil plazmetestosteron, vnos hrane ali serumski Na þ, K þ ali HCO3 pomembno pri obeh spolih. Skratka, od AR odvisne signalne poti pri moških, vendar ne pri ženskah,ledviceuravnava izražanje PEPCK in NKCC2 in vodi do spolnih razlik v izločanju amoniaka. Nasprotni učinki na NHE3 in NBCe1-Izraz verjetno omejuje obseg sprememb izločanja amoniaka. Ker AR ni prisoten v debelem naraščajočem kraku, je učinek KS-AR-KO na izražanje NKCC2 posreden. Nazadnje, AR posreduje večjeledvicavelikosti in volumske gostote proksimalnih tubulov pri samcih v primerjavi z mišjimi samicami.

NOVO IN OPOMBE VREDNOSpolni dimorfizmi pri presnovi amoniaka vključujejo signalne poti, odvisne od androgenih receptorjev (AR), pri moških, ne pa pri ženskah,ledviceki vodijo do spremenjene ekspresije proksimalnega tubula (PT), fosfoenolpiruvat karboksikinaze in debelega ascendentnega uda Na þ -K þ -2Cl kottransporterja. Prilagodljivi odzivi v Na þ/H þ izmenjevalcu 3 in elektrogenem Na þ -bi-karbonatnem kottransporterju 1-A izraz omejuje obseg učinka na izločanje amoniaka. Končno je večja velikost ledvic in volumska gostota PT pri mišjih samcih posledica signalizacije androgena PT prek AR.

ključne besede: kislinsko-bazični; amoniak; androgeni receptor; spolne razlike;testosteron

cistanche poveča testosteron

UVOD

The presence of sex differences in many aspects of mammalian biology has been well established with sexual dimorphisms in structure and/or function have been identified in nearly every organ, including the kidney (1–3). Sex affects many aspects of kidney function and disease. Sex differences in blood pressure are widely recognized and thought to be related to sex-specific variations in nitric oxide, the renin-angiotensin-aldosterone system, and inflammation (4, 5). There are also differences in the expression of many renal epithelial cells Naþ transporters (6, 7). Understanding these differences can identify new disease mechanisms and/or new and improved therapeutic opportunities. The kidney regulates acid-base homeostasis, which is critical for normal health (8, 9). Renal ammonia Fn1 1 metabolism has a major role in acid-base homeostasis; ammonia excretion is the predominant component of basal net acid excretion, and changes in ammonia metabolism account for >80 odstotkov odziva na eksogene dražljaje (10–16). Motnja regulacije kislinsko-bazične homeostaze neposredno vpliva na praktično vsak večji organski sistem, pospešuje napredovanje kronične ledvične bolezni in je povezana s povečano umrljivostjo (17–19).

Naše študije so pokazale, da obstajajo pomembni spolni učinki tako na presnovo amoniaka kot na strukturo ledvic. Moška ledvica izloča manj amoniaka kot ženska ledvica in to kljub temu, da je moška ledvica večja in ima večji kortikalni volumen kot ženska ledvica (20). Ta razlika v izločanju amoniaka je v korelaciji z variacijami v številnih ledvičnih vidikih, vključno z več encimi, ki sodelujejo pri nastajanju in recikliranju amoniaka, v velikosti proksimalnih tubulov v debelem naraščajočem kraku Henlejeve zanke (TAL) Naþ -Kþ ​​- 2Cl - ekspresija kottransporterja (NKCC2) in ekspresija glikoproteina Rhesus (Rh) v zbiralnem kanalu (20). Nazadnje obstajajo razlike med spoloma v odzivu na obremenitev s kislino (21). Mnoge od teh spolnih razlik se obrnejo z orhiektomijo prek mehanizma, ki ga razveljavijo fiziološkitestosteronzamenjavo, kar kaže, da vključujejotestosteron-odvisne signalne poti (22).

Kanonična pot, skozi katerotestosteronposreduje biološke učinke, vključuje vezavo na androgene receptorje (AR) (23, 24). Ekspresijo proteina AR in mRNA so desetletja opazili tako v moških kot ženskih ledvicah (25–28). Nedavno smo pokazali, da se protein AR izraža specifično v proksimalnem tubulu in da izražanja ni bilo mogoče zaznati niti v TAL niti v zbirnem kanalu (22), kjer so znane spolne razlike v proteinih, ki sodelujejo pri ravnanju z amoniakom. Naše študije so nadalje pokazale, da je bila ekspresija AR v proksimalnih tubulih prisotna v moških in ženskih ledvicah, pri čemer je bila ekspresija približno dvakrat večja v moških ledvicah kot v ženskih ledvicah (22). Ta opažanja kažejo, da lahko AR posreduje nekatere, vendar ne vse, učinke spola na strukturo ledvic ter na nastajanje in transport amoniaka. Postavljajo tudi vprašanje o vlogi AR v ženskih ledvicah.

Tako je bil namen te študije določiti vlogo ledvičnega AR pri posredovanju teh identificiranih spolnih dimorfizmov v ledvični presnovi amoniaka in strukturi ledvic. Ker ima aktivacija AR številne biološke učinke, ki lahko posredno spremenijo kislinsko-bazično homeostazo in s tem ravnanje z amoniakom, je interpretacija študij z uporabo farmakološke inhibicije AR in/ali globalne delecije AR zapletena. Zato so v tej študiji uporabili miši z delecijo AR, specifično za ledvice [KS-AR-knockout (KO)], ustvarjeno s tehnikami Cre-loxP. Primerjali smo Cre-pozitivne miši z njihovimi Cre-negativnimi sorodniki iz legla, da bi ugotovili učinek KS-AR-KO. Ocenjeni so bili samci in samice miši, da bi omogočili razumevanje vloge AR pri obeh spolih.

korenine cistanche tubulosa

METODE

Živali

Uporabili smo miši z mesti loxP, ki obkrožajo ekson 2 gena AR (ARflfl/flfl), ki je bil prej opisan (29–31). Inducirali smo delecijo AR celotne ledvice z vzrejo miši, ki izražajo Cre-rekombinazo pod nadzorom promotorja Pax-8 (Pax8Cre; 32). KS-AR-KO miši so bile ARflfl/flfl, Pax8-Cre þ; kontrolne miši so bile ARflfl/flfl, Pax8-Cre. Vse miši so bile na osnovnem sevu C57/Bl6. Vse miši smo genotipizirali z uporabo DNK, ekstrahirane iz vzorcev sponk repa. Miši, uporabljene v teh poskusih, so bili odrasli miši samci in samice, stari -4 mesecev. Miši so vzdrževali na standardni dieti za glodavce (18 odstotkov beljakovin, Harlan Teklad, Madison, WI) s prostim dostopom do vode. Univerza Floride in odbori za institucionalno oskrbo in uporabo živali v zdravstvenem sistemu Severne Floride/Južne Georgie so odobrili vse protokole za živali. Vzrejo živali je izvajalo usposobljeno osebje na Univerzi Florida College of Medicine Cancer and Genetics Transgenic Animal Core Facility.

Eksperimenti z metabolično kletko

Miši so za 3 dni postavili v presnovne kletke in jih hranili z običajno hrano v prahu (18 odstotkov beljakovin, Harlan Teklad), pomešano z vodo v razmerju 1:1. Izmerili so dnevno porabo hrane in zbrali dnevne 24--urne vzorce urina. Vzorci urina so bili zbrani v epruvete, ki so vsebovale mineralno olje, uravnoteženo z vodo, da se prepreči izhlapevanje in izguba molekul plina. Zabeležena sta bila dnevna količina urina in pH. Vzorci urina so bili shranjeni pri - 20 stopinjah do nadaljnje analize.

Analiza krvi

Kri je bila pridobljena s kanilacijo trebušne aorte pri miših, anesteziranih z izofluranom, vlečena v heparinizirano brizgo in takoj analizirana na koncentracije Naþ, K þ in bikarbonata s Siemensovim mikroanalitičnim analizatorjem krvnih plinov (RAPIDLab 348 Analyzer, Siemens, München, Nemčija). ). Testosteron v serumu je bil izmerjen v središču Medicinske fakultete Univerze v Virginiji za raziskave na področju reprodukcijskega liganda in analize jedra (IBL America mouse testosterone ELISA, Minneapolis, MN)

Analiza urina

Amoniak v urinu je bil izmerjen z modifikacijo komercialno dostopnega kompleta (A7553, Pointe Scientific, Canton, MI), kot je opisano prej (20, 33). pH urina je bil izmerjen z mikro-pH elektrodo (ROSS semi-micro pH, Orion 8103BN, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Izločanje titrabilne kisline je bilo določeno z uporabo predhodno opisanih standardnih tehnik (20, 33).

Protitelesa

Tabela 1 prikazuje protitelesa, uporabljena v tej študiji, njihove dobavitelje in njihove kataloške/identifikacijske številke.

izvleček cistanche tubulosa poveča testosteron in poveča spolno sposobnost

Priprava beljakovin

Živali smo anestezirali z inhalacijskim izofluranom in ledvice splaknili s srčno perfuzijo in vivo s PBS (pH 7,4), ki je vseboval 6,000 U/L Na-heparina in 120 mg/L lidokaina. Desno ledvico smo hitro odstranili in skorjo, zunanjo medulo in notranjo medulo izolirali na hladnem odru pod disekcijskim mikroskopom. Vzorci so bili na hitro zamrznjeni v tekočem dušiku in do uporabe shranjeni zamrznjeni pri - 80 stopinjah. Tkiva smo homogenizirali v reagentu za ekstrakcijo tkivnih beljakovin T-PER (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) z uporabo pestičev iz mikrocevk (USA Scientific, Ocala, FL) in beljakovine ekstrahirali v skladu s priporočili proizvajalca. Alikvot je bil uporabljen za kvantifikacijo celotne beljakovine z uporabo testa bicinhoninske kisline (BCA), preostanek pa je bil do uporabe shranjen zamrznjen pri 80 stopinjah.

Postopki imunoblota Deset mikrogramov ledvičnih beljakovin smo podvrgli elektroforezi na 10-odstotnem PAGE ReadyGel (Bio-Rad, Hercules, CA). Gele smo elektroforetično prenesli na nitrocelulozne membrane, blokirali s 5 g/dL nemastnega suhega mleka, razredčenega v pufru Blotto (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA in 0,05 % Tween 20, pH 7,6), in inkubirali pri 4 C čez noč s primarnim protitelesom v nemastnem suhem mleku. Ekvivalenco obremenitve in prenosa smo ocenili z barvanjem s Ponceau S in z vrednotenjem ekspresije hišnega proteina b-aktina. Po izpiranju so bile membrane izpostavljene sekundarnemu protitelesu (kozji anti-kunčji IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), konjugiranemu s hrenovo peroksidazo v razredčitvi 1:5, 000. Mesta reakcije protitelo-antigen smo vizualizirali z izboljšano kemiluminiscenco (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) in digitalnim slikovnim sistemom Kodak Image Station 440CF. V izbranih poskusih so bili madeži odstranjeni. Gostota pasov je bila normalizirana tako, da je bila povprečna gostota v regiji (skorja ali zunanja medula) v tkivu samca divjega tipa (WT) 100. Oba spola (moški in samica) ter oba genotipa (WT in KO) so bili naloženi na isti gel za te poskuse. Odsotnost nasičenosti je bila potrjena s preučevanjem porazdelitve intenzivnosti slikovnih pik v vseh imunoblotih.

Imunoblot postopki

Deset mikrogramov ledvičnih beljakovin smo podvrgli elektroforezi na 10-odstotnem PAGE ReadyGel (BioRad, Hercules, CA). Gele smo elektroforetično prenesli na nitrocelulozne membrane, blokirali s 5 g/dL nemastnega suhega mleka, razredčenega v pufru Blotto (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA in 0,05 % Tween 20, pH 7,6), in inkubirali pri 4 °C.C čez noč s primarnim protitelesom v nemastnem suhem mleku. Ekvivalenco obremenitve in prenosa smo ocenili z barvanjem s Ponceau S in z vrednotenjem ekspresije hišnega proteina b-aktina. Po izpiranju so bile membrane izpostavljene sekundarnemu protitelesu (kozji anti-kunčji IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), konjugiranemu s hrenovo peroksidazo v razredčitvi 1:5,000. Mesta reakcije protitelo-antigen smo vizualizirali z izboljšano kemiluminiscenco (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) in digitalnim slikovnim sistemom Kodak Image Station 440CF. V izbranih poskusih so bili madeži odstranjeni. Gostota pasov je bila normalizirana tako, da je bila povprečna gostota v regiji (skorja ali zunanja medula) v tkivu samca divjega tipa (WT) 100. Oba spola (moški in samica) ter oba genotipa (WT in KO) so bili naloženi na isti gel za te poskuse. Odsotnost nasičenosti je bila potrjena s preučevanjem porazdelitve intenzivnosti slikovnih pik v vseh imunoblotih.

Priprava tkiva za imunohistokemijo

Miši smo anestezirali z inhalacijskim izofluranom. Ledvice smo ohranili s srčno perfuzijo in vivo s PBS (pH 7,4), ki je vseboval 6,000 U/L Na-heparina in 120 mg/L lidokaina, ki mu je sledil periodat-lizin-2 odstotkov paraformaldehida, prečno narežemo na več 2- do 3- mm debelih rezin in nato za 24–30 ur potopimo pri 4 stopinjah v isti fiksativ. Vzorci ledvic vsake živali so bili vdelani v poliestrski vosek, narejen s polietilen glikol 400 distearatom (Polysciences, Warrington, PA) z 10 odstotki 1-heksadekanola, 2-mm debele odseke pa so izrezali in namestili na z želatino prevlečeno diapozitivi.

korist cistanche tubulosa: povečanje spolne sposobnosti

Imunohistokemija

Imunolokalizacija za glikoprotein B družine Rh (Rhbg), glikoprotein C družine Rh (Rhcg), izoformo 3 izmenjevalca Naþ /Hþ (NHE3), glutamin sintetazo (GS), NKCC2 in AR je bila dosežena z uporabo predhodno opisanih imunoperoksidaznih postopkov (20, 22, 34–37). Na kratko, rezine smo razvoskali v etanolu, rehidrirali, segrevali v Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) 30 minut na 88 °C in nato 30 minut na 96 stopinj, 30 minut ohlajali in splaknili v PBS. Aktivnost endogene peroksidaze je bila blokirana z inkubiranjem odsekov v 3 odstotkih H2O2 v destilirani vodi 45 minut. Sekcije so bile 15 minut blokirane z beljakovinskim blokom brez seruma (Dako Cytomation) in nato čez noč inkubirane pri 4 °C s primarnim protitelesom. Odseke smo sprali v PBS, inkubirali 30 minut s polimerno vezanim, s peroksidazo konjugiranim konjskim anti-kunčjim IgG (ImmPRESS, Vector Laboratories, Burlingame, CA), ponovno sprali s PBS in nato za 5 minut izpostavili diaminobenzidinu. Odseke smo sprali z destilirano vodo, dehidrirali s ksilenom, namestili in opazovali s svetlobnim mikroskopom. Primerjave označevanja so bile narejene med odseki iz istega imunohistokemijskega poskusa. Odseke smo pregledali na mikroskopu Zeiss Axio Imager A2, opremljenem z optiko DIC, in fotografirali z barvnim digitalnim fotoaparatom Axiocam 305 in programsko opremo Zen 2.3 (Zeiss).

Imunolokalizacija za fosfoenolpiruvat karboksikinazo (PEPCK) je bila dosežena z uporabo modificiranih postopkov imunoperoksidaze, kot je opisano prej (20, 22, 38– 40). Na kratko, sekcije so bile razvoskane v etanolu, rehidrirane, segrevane v Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) na 96 C 60 min, ohlajene 30 min in splaknjene v PBS. Aktivnost endogene peroksidaze je bila blokirana z inkubacijo odsekov v 3 odstotkih H2O2 v metanolu 45 minut. Odrezke smo 15 minut obdelali s 0,5-odstotnim Tritonom X-100 v PBS. Sekcije so bile nato večkrat izprane v PBS, ki je vseboval 1 odstotek BSA, 0.05 odstotkov saponina in 0,2 odstotka želatine, čemur je sledilo 15-minutno blokiranje z beljakovinskim blokom brez seruma (DAKO Cytomation) in nato inkubirano čez noč pri 4 C s primarnim protitelesom. Odseke smo sprali v PBS, ki je vseboval 0,1 odstotka BSA, 0,05 odstotka saponina in 0,2 odstotka želatine, čemur je sledil PBS, in inkubirali 60 minut s polimerom vezanim, s peroksidazo konjugiranim kozjim anti-kunčjim IgG (MACH2, Biocare Medical, Concord, CA), ponovno speremo v PBS in nato izpostavimo diamino-benzidinu 5 minut.

Negativna kontrola

Vsak imunohistokemijski poskus je vključeval odsek, ki je bil izpostavljen postopkom imunskega označevanja brez primarnih protiteles, da se zagotovi, da je bila oznaka posledica le primarne vezave protiteles.

Morfometrična analiza

Volumska gostota proksimalnega tubula v skorji in zunanjem pasu zunanje medule ter zbirnega kanala v skorji in notranjem traku zunanje medule je bila določena z uporabo standardnih tehnik štetja točk, kot je opisano prej (20–22, 41 ).

Kvantitativna imunohistokemija

Kvantitativno imunohistokemijo smo izvedli, kot smo že opisali in potrdili (20, 22, 33, 37, 42). Segmente proksimalnih tubulov je proučeval v odsekih, označenih pod enakimi pogoji v istem poskusu imunskega označevanja, s strani opazovalca, ki ni videl terapevtske skupine. Posebni izmerjeni segmenti proksimalnih tubulov so bili začetni proksimalni zaviti tubul (PCT), definiran kot segmenti PCT, ki se nadaljujejo z Bowmanovo kapsulo, proksimalni ravni tubul (PST) v medularnem žarku in PST v zunanjem traku zunanje medule. Uporabili smo digitalne mikrofotografije visoke ločljivosti, posnete naključno izbranih polj ledvične skorje in zunanjega traku zunanje medule z uporabo mikroskopa Zeiss Axio Imager A2, opremljenega z barvno digitalno kamero Axiocam 305 in programsko opremo Zen 2.3 (Zeiss), brez uporabe tehnik za izboljšanje slike . Z uporabo programske opreme ImageJ (v, 1.34j, National Institutes of Health, Bethesda, MD) smo izmerili intenzivnost slikovnih pik prek ravne črte, ki poteka od lumna tubula skozi posamezno celico. Ti podatki so bili nato analizirani z uporabo po meri napisane programske opreme, izvedene v programu Microsoft Excel 2016. Neto intenzivnost pri vsaki slikovni piki na črti je bila nato določena kot razlika med absolutno intenzivnostjo in srednjo intenzivnostjo slikovnih pik ozadja, izmerjeno zunaj celice. Celotno celično izražanje je bilo določeno z integracijo neto intenzivnosti slikovnih pik v celotni celici. Višina celice je bila določena kot razdalja v slikovnih pikah med apikalnim in bazolateralnim robom celic in pretvorjena v absolutno dolžino z uporabo kalibriranega določanja velikosti posamezne slikovne pike. Analiziranih je bilo najmanj 15 posameznih celic iz vsaj štirih fotomikrografov iz vsake ledvice. Podatki iz vseh pregledanih celic danega tipa segmenta proksimalnega tubula so bili povprečeni, da bi dobili eno podatkovno točko na žival za statistično analizo.

Ugotovili smo, da je interkalirana velikost celic tipa A in izražanje beljakovin, specifičnih za celice, kot je opisano prej (20, 22). Na kratko, pridobili smo visoko zmogljive digitalne mikrofotografije notranjega traku zunanje medule tkivnih odsekov, ki so bili podvrženi imunohistokemiji za interkalirani celično specifični marker Rhbg ali Rhcg. Posamezne interkalirane celice so bile omejene s programsko opremo ImageJ (v. 1.34j, National Institutes of Health). Velikost celice je bila določena kot število slikovnih pik znotraj označenih območij in pretvorjena v območje z uporabo kalibrirane meritve slikovnih pik na mikrometer. Intenzivnost imunske oznake pri vsaki slikovni piki je bila določena kot razlika med absolutno intenzivnostjo slikovnih pik in povprečno intenzivnostjo ozadja, intenzivnost imunske oznake ene celice pa je bila določena z integracijo neto intenzivnosti slikovnih pik znotraj celice z uporabo po meri napisane programske opreme, izvedene v Microsoft Excel 2016.

cistanche zdravijo ledvično bolezen in tako povečajo spolno sposobnost

REZULTATI

Preverjanje delecije AR, specifične za ledvice

Farmakološka blokada AR ali globalna delecija povzroči široko paleto fenotipskih sprememb (43), ki bi lahko posredno spremenile ledvične strukturne odzive in odzive amoniaka. Da bi se izognili tem težavam, smo ustvarili miši KS-AR-KO s tehnikami Cre loxP. Učinkovitost ledvične delecije AR smo potrdili z imunohistokemijo (slika 1). Pri miših WT je imunohistokemija pokazala, da je jedrska imunska oznaka AR omejena na proksimalni tubul; to je bilo podobno našim ugotovitvam pri normalni mišji ledvici (22). V ledvicah KO ni bilo zaznavne imunske oznake AR pri obeh spolih (slika 1). Te ugotovitve kažejo generacijo miši z ledvično delecijo AR.

statistična analiza z uporabo programske opreme SPSS (26.2) in Microsoft Excel 2016.

Ker ima testosteron številne zunajledvične učinke, ki bi lahko posredno spremenili ledvične kislinsko-bazične mehanizme, smo upoštevali možnost, da bi KS-AR-KO lahko spremenil ravni testosterona ali estradiola v plazmi. Vendar pa se koncentracije testosterona in estradiola v plazmi niso bistveno razlikovale med mišmi WT in KO pri obeh spolih (tabela 2).

Fiziološka karakterizacija delecije AR, specifične za ledvice. Telesna teža je bila večja pri mišjih samcih WT kot pri mišjih samicah WT, kljub temu, da ni bilo spolnih razlik pri vnosu hrane, kot je bilo že poročano (22), kar je skladno z znanimi zunajledvičnimi učinki spola na telesno težo. Vendar KS-AR-KO ni spremenil dnevnega vnosa hrane ali telesne teže pri obeh spolih (tabela 2).

Teža ledvic je bila znatno večja pri samcih miši WT kot pri samicah miši WT (slika 2), podobno kot smo prej poročali pri normalnih miših (22). KS-AR-KO je pomembno zmanjšal težo ledvic pri samcih KS-AR-KO miši, do te mere, da se teža ledvic KS-AR-KO samcev ni pomembno razlikovala od teže WT ali KS-AR-KO samic (slika 2). . Pri mišjih samicah KS-AR-KO ni bistveno spremenil teže ledvic. Tako učinek spola na težo ledvic zahteva izražanje AR v moških ledvicah.

Niti plazemske koncentracije Naþ, K þ niti bikarbonata se niso bistveno razlikovale med mišmi WT in KS-AR-KO za oba spola (tabela 2). Očistek sečnine, ki se uporablja kot označevalec hitrosti glomerulne filtracije, se ni bistveno razlikoval med mišmi WT in KS-AR-KO pri obeh spolih (tabela 2).

Neto izločanje kisline

Neto izločanje kisline vključuje dva procesa: izločanje amonija (NH4þ ) in izločanje titrabilne kisline. Pri mišjih samcih je KS-AR-KO znatno povečal izločanje amoniaka, kar je odpravilo razliko med spoloma v izločanju amoniaka (slika 2). KS-AR-KO pri mišjih samicah ni bistveno spremenil izločanja amoniaka. KS-AR-KO ni bistveno spremenil izločanja titrirane kisline pri nobenem spolu (tabela 2). KS-AR-KO je znatno znižal pH urina pri mišjih samcih, ne pa tudi pri mišjih samicah (tabela 2); vendar je učinek KS-AR-KO na izločanje amoniaka ostal po statističnem upoštevanju pH urina (P < 0,001="" z="" anova).="" tako="" proksimalni="" tubul="" ar="" posreduje="" med="" spolnimi="" razlikami="" v="" izločanju="" amoniaka="" pri="" mišjih="" samcih,="" vendar="" njegova="" delecija="" ni="" imela="" pomembnega="" vpliva="" na="" izločanje="" amoniaka="" pri="" mišjih="">

Vpliv delecije AR, specifične za ledvice, na strukturo proksimalnega tubula

Proksimalni tubuli predstavljajo večji delež kortikalne prostornine pri moških ledvicah kot pri ženskih ledvicah, kar je odvisno od testosterona (20, 22). Tako smo določili učinke delecije KS-AR pri mišjih samcih in samicah na strukturo proksimalnih tubulov. Z uporabo imunooznake PEPCK kot markerja, specifičnega za proksimalne tubule, je imunohistokemija kvalitativno pokazala, da je KS-AR-KO zmanjšal delež skorje, ki je bil proksimalni tubul (slika 3A). Kvantitativna analiza z uporabo formalnih tehnik štetja točk (41) je pokazala, da je KS-AR-KO pomembno zmanjšal gostoto volumna proksimalnih tubulov v skorji samcev, kar je vzporedno s spremembo teže ledvic (slika 3B). Nasprotno pa v zunanjem pasu zunanje medule KS-AR-KO ni pomembno spremenil gostote volumna proksimalnih tubulov pri mišjih samcih (slika 3B). Pri mišjih samicah KS-AR-KO ni kvalitativno spremenil deleža skorje, ki je bil proksimalni tubul (slika 3A), in kvantitativno ni spremenil volumske gostote proksimalnega tubula niti v skorji niti v zunanji meduli (slika 3B). Spolna razlika v volumski gostoti kortikalnih proksimalnih tubulov, ki je prisotna pri miših WT, ni bila prisotna pri miših KS-AR-KO. Tako pri moških ledvicah AR posreduje spolne razlike v gostoti volumna proksimalnih tubulov v skorji. Zdi se, da v zunanji meduli izražanje AR ne vpliva na gostoto volumna proksimalnih tubulov pri obeh spolih.

Zdi se, da te spremembe v strukturi proksimalnih tubulov pri samcih miši KS AR-KO vključujejo spremembe velikosti celic. Pri mišjih samcih je KS-AR-KO znatno zmanjšal višino proksimalnih tubulnih celic v PCT in kortikalni PST, tj. v celotni skorji (slika 3C). Višina celic v PST v zunanji meduli ni bila bistveno spremenjena (slika 3C). Ti rezultati so vzporedni z ugotovitvami volumske gostote. Delecija AR, specifična za ledvice, pri mišjih samicah ni spremenila višine celic proksimalnih tubulov niti v PCT, kortikalnem PST niti v PST v zunanji meduli, kar je vzporedno s pomanjkanjem učinka na volumsko gostoto in celotno velikost ledvic pri samici ledvic (sl. 2B).

Teža ledvice, prostorninska gostota kortikalnih proksimalnih tubulov in višina celic v PCT in kortikalni PST so bile vse večje pri moških ledvicah WT kot pri ženskih ledvicah WT, kar je vzporedno z našimi prejšnjimi opažanji (20, 22). Pri mišjih samcih KS-AR-KO ta spolna razlika ni več obstajala in vsak od teh parametrov se ni bistveno razlikoval od tistih, opaženih pri mišjih samicah WT ali KS-AR-KO. Tako so spolne razlike v teži ledvic, prostorninski gostoti kortikalnih proksimalnih tubulov in višini celic v PCT in kortikalni PST odvisne od izražanja AR.

Učinek delecije AR, specifične za ledvice, na strukturo zbiralnega voda

Obstajajo pomembne spolne razlike v zbiralnem kanalu, pri čemer je gostota prostornine zbiralnega kanala večja v deležu skorje ali zunanje medule, ki je bil zbiralni kanal pri samcih ali samicah miši (slika 4A). Kvantitativna morfometrična analiza je pokazala, da KS-AR-KO ni pomembno spremenil volumske gostote zbiralnega kanala niti v skorji niti v zunanji meduli pri obeh spolih (slika 4B). Tako ledvična AR ne posreduje pri spolnem dimorfizmu v prostorninski gostoti zbiralnega kanala.

Izražanje amoniagenskega encima Rezultati pri neto izločanju kisline kažejo, da delecija AR, specifična za ledvice, poveča izločanje amoniaka pri mišjih samcih, čeprav zmanjša gostoto volumna proksimalnih tubulov in višino celic v skorji. To kaže, da učinkov na izločanje amoniaka ni mogoče pripisati preprosto hipertrofiji proksimalnih tubulov, ki vodi do povečane tvorbe amoniaka, ampak so namesto tega posledica ločenih in specifičnih učinkov na tvorbo amoniaka in/ali transport amoniaka. Tako smo nato pregledali ključne beljakovine, ki sodelujejo pri nastanku amoniaka in transportu amoniaka.

PEPCK je ključni encim proksimalnih tubulov, ki je potreben za nastanek amoniaka in se nahaja izključno v proksimalnem tubulu v ledvicah (16, 44). Pri mišjih samcih je KS-AR-KO znatno povečal kortikalno izražanje PEPCK; pri mišjih samicah ni bilo učinka KS-AR-KO (slika 5A). Povečanje izražanja PEPCK pri samcih miši KS-AR-KO je odpravilo razliko v spolu pri miših WT (slika 5A). Preiskava izražanja imunskih oznak PEPCK je pokazala, da so imeli samci miši KS-AR-KO večjo intenzivnost imunskih oznak PEPCK v PCT in kortikalnem PST kot miši WT (slika 5B). V zunanjem pasu zunanje medule ni bilo zaznavne razlike v intenzivnosti imunske oznake PEPCK (slika 5B). Kvantitativna imunohistokemija mišjih samcev je pokazala, da je KS-AR-KO znatno povečal intenzivnost imunske oznake PEPCK v PCT in kortikalni PST, ne pa tudi v zunanjem pasu zunanje medule (slika 5C). Tako pri mišjih samcih, vendar ne pri mišjih samicah, izražanje AR v proksimalnem tubulu zmanjša izražanje PEPCK v segmentih kortikalnih proksimalnih tubulov, ne pa tudi v PST v zunanji meduli.

Proksimalni tubul ima sposobnost recikliranja amoniaka, ki vključuje GS (37, 42, 45, 46). Ne pri mišjih samcih ne pri samicah KS-AR-KO ni bistveno spremenil izražanja GS (slika 5D). Tako se zdi, da ledvični AR ne modulira izražanja GS.

Učinek delecije AR, specifične za ledvice, na izražanje NBCe1

NBCe1 je protein integralne membrane proksimalnega tubula z glavno vlogo pri reabsorpciji filtriranega bikarbonata, ki uravnava tudi presnovo amoniaka (47–49). V mišji ledvici sta prisotni dve spojeni različici NBCe1, NBCe1-A in NBCe1-B (50, 51). Z uporabo protitelesa pan-NBCe1, ki prepozna obe različici NBCe1, smo ugotovili, da je KS-AR-KO znatno zmanjšal kortikalno izražanje NCBe1 v moških, ne pa tudi ženskih ledvicah (slika 6A).

Vpliv delecije AR, specifične za ledvice, na transporterje amoniaka Ledvično izločanje amoniaka vključuje usklajen transport NH3/NH4þ s specifičnimi membranskimi proteini (10, 16, 52). To vključuje prenašalce v proksimalnem tubulu (NHE3), TAL Henlejeve zanke (NKCC2) in imunooznačevanja zbiralnega kanala ni bilo mogoče zaznati v segmentih zunanjega medularnega proksimalnega tubula (slika 6C), kot je bilo prej poročano (48). Nato smo uporabili kvantitativno imunohistokemijsko analizo, da smo kvantificirali segmentno specifične spremembe v izražanju NBCe1-A. To je pokazalo, da je KS-AR KO pri mišjih samcih zmanjšal izražanje NBCe1-A v PCT in kortikalnem PST, tj. v celotni skorji (slika 6D). Tako ekspresija AR uravnava ekspresijo kortikalnih proksimalnih tubulov NBCe1-A v moških ledvicah, ne pa tudi v ženskih.

(Rhbg in Rhcg). Spolne razlike v izločanju amoniaka so povezane z razlikami v izražanju vsakega od teh (6, 20), testosteron pa uravnava izražanje tako NHE3 kot NKCC2 (22). NKCC2 posreduje reabsorpcijo amoniaka TAL (10, 16, 52). Pri mišjih samcih je KS-AR-KO znatno povečal izražanje proteina NKCC2 z uporabo imunoblot analize; pri mišjih samicah ni bilo pomembne spremembe (slika 8). Ta sprememba izražanja pri mišjih samcih verjetno prispeva k spremenjenemu medularnemu ranžiranju amoniaka in s tem olajša učinek KS-AR-KO na povečanje izločanja amoniaka pri mišjih samcih.

Rh glikoproteina Rhbg in Rhcg sta primarna proteina, ki posredujeta pri izločanju amoniaka v zbiralnem kanalu, njuno izražanje pa je na splošno vzporedno s spremembami v izločanju amoniaka (10, 16, 52). Vendar pa KS-AR-KO ni bistveno spremenil izražanja proteina Rhbg niti pri samcih niti samicah miši KS-AR-KO niti v skorji niti v notranjem pasu zunanje medule (slika 9). Učinki na izražanje Rhcg so bili podobni. Imunohistokemija Rhcg, ovrednotena kvalitativno in z uporabo kvantitativne imunohistokemije, ni pokazala pomembnih sprememb v intenzivnosti imunooznačevanja Rhcg v interkaliranih celicah zunanjega traku zunanje medule pri obeh spolih (slika 10). Tako se zdi, da ledvični AR ne modulira ekspresije Rhbg ali Rhcg.

DISKUSIJA

Ta študija zagotavlja pomembne nove informacije o mehanizmu, kako AR modulira spolne dimorfizme v ledvicah. Ker ima AR številne vloge zunaj ledvic, kar bi lahko zapletlo razumevanje njegove vloge v ledvicah, smo ustvarili prvo miško KS-AR-KO. KS-AR-KO pri mišjih samcih je povečal izločanje amoniaka, vendar zmanjšal skupno velikost ledvic, gostoto volumna proksimalnih tubulov in višino celic proksimalnih tubulov, kar je odpravilo prej ugotovljene razlike med spoloma. Ekspresija več ključnih proteinov (PEPCK in NKCC2), vključenih v ravnanje z amoniakom, se je povečala s KS-AR-KO, kar je verjetno prispevalo k povečanemu izločanju amoniaka. Hkrati se je zmanjšala ekspresija drugih proteinov (NHE3 in NBCe1-A), kar bo zmanjšalo spremembe v izločanju amoniaka. KS-AR-KO ni imel zaznavnega učinka pri mišjih samicah ali v zbiralnem kanalu obeh spolov. Tabela 3 prikazuje te učinke. Te ugotovitve kažejo, da ravnanje z amoniakom v ledvicah in struktura proksimalnih tubulov vključujeta od ledvičnega AR odvisne signalne poti v skorji moške ledvice, ne pa tudi ženske ledvice in ne v zunanji meduli obeh spolov.

Prva večja ugotovitev v tej študiji je, da izražanje AR posreduje med spolnimi razlikami v velikosti ledvic. Prejšnje študije na ljudeh, podganah in miših so pokazale, da so ledvice samcev večje od ledvic samic (3, 56, 57). Prvi dokaz, da je to vključevalo od testosterona odvisno signalno pot, je bila ugotovitev, da je prekomerno dajanje androgenov kvalitativno povečalo velikost proksimalnih tubulov pri podganah (57). Nadaljnji dokazi pri odraslih moških kažejo, da je od odmerka odvisno povečanje volumna ledvic, z ocenjenim povečanjem za 4.04-cm3 na 100 mg tedenskega dodatka testosterona (58). Nedavno smo pokazali, da imajo miši samci večjo velikost ledvic in proksimalnih tubulov kot miši samice (20, 22) in da so te razlike odvisne od testosterona (22). V skladu s temi prejšnjimi ugotovitvami ta študija dokazuje, da pri mišjih samcih ledvična ekspresija AR uravnava velikost celotne ledvice in proksimalnih tubulov. Poleg tega KS-AR-KO povzroči, da je velikost ledvic moških enaka kot pri ženskah z nedotaknjenim izražanjem AR. Tako lahko pri mišjih samcih testosteron, ki deluje prek ledvičnih AR odvisnih signalnih poti, v celoti pojasni spolni dimorfizem v velikosti ledvic in proksimalnih tubulov.

Druga pomembna ugotovitev je, da so razlike v izločanju amoniaka na podlagi spola posredovane preko poti, odvisnih od AR, pri samcih miši. Naše prejšnje študije so pokazale, da mišje samice izločajo približno dvakrat več amoniaka z urinom kot mišji samci (20–22), uporabljajo različne odzivne poti za odziv na obremenitev s kislino (21) in da razlika v bazalnem izločanju amoniaka vključuje odvisnost od testosterona mehanizem (22). Ta študija razširja te ugotovitve s prikazom, da KS-AR-KO odpravlja spolni dimorfizem pri izločanju amoniaka. Spremembe v prehranskih fiksnih kislinskih obremenitvah lahko spremenijo izločanje amoniaka, vendar sprememb v izločanju amoniaka pri miših z delecijo AR ni mogoče pripisati temu mehanizmu, saj KS-AR-KO ni spremenil vnosa hrane. Večina sprememb, ki se pojavijo v presnovi amoniaka, na primer pri presnovni acidozi ali hipokalemiji, povzroči spremembe v velikosti ledvic in proksimalnih tubulov, ki so vzporedne z izločanjem amoniaka (59–61). Vendar so miši samci z ledvično delecijo AR povečali izločanje amoniaka, vendar so zmanjšali skupno velikost ledvic in proksimalnih tubulov, kar kaže, da učinek na izločanje amoniaka ni nespecifičen odziv na spremembe ledvične mase. Ta neskladna velikost ledvic in odziv amoniaka kot odziv na ledvično delecijo AR je vzporeden z ugotovitvami v naših prejšnjih študijah z uporabo modela gonadektomije, ki je ocenjeval učinek testosterona (22). Tako pri mišjih samcih testosteron, ki deluje preko ledvične AR pri samcih, uravnava izločanje amoniaka po poteh, ki niso povezane z učinki na velikost ledvic, velikost proksimalnih tubulov in endogene kislinske obremenitve, povezane z vnosom hrane.

Večina tvorbe amoniaka poteka v proksimalnem tubulu. Naše prejšnje delo je identificiralo spolne dimorfizme pri nastajanju amoniaka v proksimalnih tubulih, ki so odvisni od testosterona, pridobljenega iz testisov (22). Rezultati te študije nadalje razširjajo te ugotovitve, tako da kažejo, da ledvična AR pri mišjih samcih uravnava ekspresijo encima PEPCK, ki proizvaja amoniak, ne pa tudi encima GS za recikliranje amoniaka. Ta učinek na ekspresijo PEPCK ni nespecifičen učinek, povezan s spremembami velikosti proksimalnih tubulov, saj so učinki ledvične delecije AR na velikost proksimalnih tubulov nasprotni njenim učinkom na ekspresijo PEPCK. Poleg tega ugotovitev, da delecija AR v ledvicah ne spremeni izražanja GS, kaže, da je GS reguliran z mehanizmi, ki se razlikujejo od tistih, ki se uporabljajo za PEPCK.

Amoniak, ki nastane v proksimalnem tubulu, se izloča prednostno v luminalno tekočino prek apikalnega NHE{0}}odvisnega mehanizma (54, 55). Prejšnje študije so pokazale, da izguba testosterona zmanjša izražanje NHE3 (22, 62). Ugotovitve te študije nadalje razširjajo te ugotovitve s tem, da kažejo, da ledvična delecija AR pri mišjih samcih zmanjša izražanje NHE3. Tako se zdi, da testosteron, ki deluje prek aktivacije AR, poveča izražanje NHE3 v kortikalnem proksimalnem tubulu. Vendar je pomembno priznati, da ti učinki niso vzporedni z izločanjem amoniaka in se namesto tega predvideva, da bodo zmanjšali opažene spremembe v izločanju amoniaka. Namesto tega lahko ti učinki prispevajo k večji reabsorpciji NaCl v proksimalnih tubulih, ki je prisotna pri moških (6, 7), ker je NHE3 kritičen tudi za filtrirano reabsorpcijo NaCl in vode.

Reabsorpcija amoniaka v TAL vzpostavi intersticijski gradient amoniaka, ki je potreben za zbiranje izločanja amoniaka v kanalu (63, 64). Prejšnje študije naše skupine so pokazale, da je izražanje NKCC2 večje pri mišjih samicah kot pri mišjih samcih (20–22), da obstaja spolni dimorfizem v odzivu NKCC2 na obremenitev s kislino (21) in da je razlika v bazalni ekspresiji NKCC2 vključuje od testosterona odvisen mehanizem (22). Ta študija kaže, da je izguba ledvičnega AR pri mišjih samcih povečala izražanje NKCC2. Velikost tega učinka je bila skoraj enaka razliki, ki smo jo ugotovili med samci in samicami miši (20, 21) in v trenutni študiji odpravila spolni dimorfizem izražanja NKCC2. Poleg tega je ugotovljena razlika med samci miši z nedotaknjeno ledvično AR in delecijo AR vzporedna z našimi prej ugotovljenimi razlikami med samci miši z orhiektomijo v primerjavi z nepoškodovanimi in lažno operiranimi kontrolami (24). Tako se zdi, da testosteron, ki deluje prek AR, posreduje spolni dimorfizem v izražanju NKCC2. Vendar se zdi, da je ta uredba posredna, saj niti v našem prejšnjem poročilu (22) niti v tej študiji ni bilo zaznavnega izraza AR v TAL. Eden od možnih posrednih mehanizmov, ki pojasnjuje to opažanje, je, da pri moških delecija AR vodi do zmanjšane velikosti proksimalnih tubulov, kar v kombinaciji z zmanjšano ekspresijo NHE3 proksimalnih tubulov poveča povečano dostavo topljenca v TAL, kar stimulira ekspresijo NKCC2.

Izločanje amoniaka v zbiralnem kanalu je glavni dejavnik izločanja amoniaka v urinu, Rh glikoproteina Rhbg in Rhcg pa sta primarna prenašalca amoniaka v zbiralnem kanalu (16, 65–68). Pred tem smo pokazali spolne dimorfizme v gostoti prostornine zbiralnega kanala in izražanju Rh glikoproteinov, pri čemer so imele mišje samice večjo gostoto volumna zbiralnega kanala, velikost interkaliranih celic ter izražanje Rhbg in Rhcg (20). Ta študija ni odkrila nobenih zaznavnih sprememb v prostorninski gostoti zbiralnega kanala ali izražanju Rhbg in Rhcg kot odziv na KS-AR-KO pri mišjih samcih ali samicah. To je vzporedno s pomanjkanjem učinka pomanjkanja testosterona, ki ga povzroči orhiektomija, na gostoto volumna zbiralnega kanala, velikost interkaliranih celic ter izražanje Rhbg in Rhcg (22). Sklepamo, da se spolni dimorfizem v zbirnem kanalu pojavi prek mehanizmov, ki ne vključujejo testosterona in od AR odvisnih signalnih poti.

Zdi se, da se zunanja medula drugače odziva na spol, testosteron in AR kot skorja. V nasprotju z ledvično skorjo v zunanji meduli ni spolnega dimorfizma v prostorninski gostoti proksimalnih tubulov ali višini proksimalnih tubulov (20), ni učinka pomanjkanja testosterona, povzročenega z orhiektomijo, na te parametre (22) in ni vpliva ledvične Izbris AR (sedanja študija). To pomanjkanje učinka izražanja spola, testosterona in AR ni posledica odsotnosti izražanja AR, saj smo pokazali izražanje AR v celotnem proksimalnem tubulu, vključno z zunanjo medulo (22). Razumevanje mehanizmov, na katerih temelji ta aksialna razlika v odzivu proksimalnega tubula na spol, testosteron in AR, bo pomembna pot za prihodnje preiskave.

Zadnja ugotovitev je, da delecija AR ni imela zaznavnih učinkov na ženske ledvice. AR je prisoten v celotnem proksimalnem tubulu pri obeh spolih in čeprav je pri ženskah izražen v nižjih ravneh, je bila absolutna razlika v izražanju le - 50 odstotkov (22). Deloma bi pomanjkanje učinka delecije AR lahko pomenilo zmanjšano aktivacijo AR s krožečim testosteronom, ki je, kot je prikazano v tej študiji, bistveno manj pri ženskah kot pri moških. Vendar pa imunohistokemija kaže na znatno jedrsko lokalizacijo AR v ženskih ledvicah (ref. 22 in pričujoča študija), kar običajno kaže na aktivacijo od AR odvisnih signalnih procesov. Ta opažanja kažejo na možnost, da druge razlike, odvisne od spola, poslabšajo signalne mehanizme, odvisne od AR, v ženskem proksimalnem tubulu.

Perspektive in pomen

Boljše razumevanje mehanizma in bioloških posledic vpliva spola na strukturo ledvic in presnovo amoniaka je ključnega pomena za optimizacijo naše sposobnosti oskrbe moških in žensk z motnjami kislinsko-bazičnega ravnovesja. Kljub nedavnemu napredku v našem razumevanju vpliva spola na presnovo amoniaka in vloge ledvične AR so potrebne dodatne študije. Vsekakor obstajajo od testosterona neodvisni učinki spolnosti, katerih mehanizem trenutno ni popolnoma razumljen. Ali to vključuje neposredne učinke drugih spolnih steroidnih hormonov, kot so estrogeni ali progesteron, posredne učinke aktivacije proksimalnih tubulov AR ali učinke spolnih kromosomov, ki so neodvisni od gonadnih hormonov, bodo pomembna vprašanja za prihodnje študije.

cistanche lajša težave z ledvicami in krepi kdelovanje ledvic

ZAHVALA

Zahvaljujemo se dr. Sharon W. Matthews in Chao Chen (Univerza na Floridi, osnovni laboratorij za elektronsko mikroskopijo medicinske fakultete) za odlično obdelavo tkiv za naše imunohistokemične poskuse. Zahvaljujemo se Centru za raziskave in analizo reproduktivnih ligandov Medicinske fakultete Univerze v Virginiji za merjenje ravni testosterona v serumu. Zahvaljujemo se dr. Gail Prins za dobavo protiteles proti AR in za njihovo strokovno znanje o AR.

RAZKRITJA

Avtorji ne navajajo nobenih nasprotij interesov, finančnih ali drugih.

AVTORSKI PRISPEVKI

ANH in IDW sta zasnovala in oblikovala raziskavo; ANH, RAC, H.-WL in JWV so izvajali poskuse; Analizirani podatki ANH, RAC, H.-WL, JWV in IDW; ANH, RAC, JWV in IDW so interpretirali rezultate poskusov; ANH pripravljene številke; ANH je pripravil osnutek rokopisa; ANH, RAC, H.-WL, JWV in IDW so uredili in revidirali rokopis; ANH, RAC, H.-WL, JWV in IDW so potrdili končno različico rokopisa.

REFERENCE

1. Odbor Medicinskega inštituta za razumevanje biologije spola in spola D; Wizemann TM, Pardue ML (uredniki). Raziskovanje bioloških prispevkov k zdravju ljudi: Ali je spol pomemben? Washington, DC: National Academies Press, 2001. doi:10.17226/10028.

2. Karp NA, Mason J, Beaudet AL, Benjamini Y, Bower L, Braun RE, et al. Razširjenost spolnega dimorfizma v fenotipskih lastnostih sesalcev. Nat Commun 8: 15475, 2017. doi: 10.1038/ncomms15475.

3. Sabolić I, Asif AR, Budach WE, Wanke C, Bahn A, Burckhardt G. Razlike med spoloma v delovanju ledvic. Pflugers Arch 455: 397–429,b2007. doi:10.1007/s00424-007-0308-1.

4. Ramirez LA, Sullivan JC. Spolne razlike pri hipertenziji: kje smo bili in kam gremo. Am J Hypertens 31: 1247–1254, 2018. doi:10.1093/ajh/hpy148.

5. Layton AT, Sullivan JC. Nedavni napredek pri spolnih razlikah v delovanju ledvic. Am J Physiol Renal Physiol 316: F328–F331, 2019. doi:10.1152/ajprenal.00584.2018.

6. Veritas LC, Girardi ACC, Curry J, Pei L, Ralph DL, Tran A, Castelo-Branco RC, Pastor-Soler N, Arranz CT, Yu ASL, McDonough AA. Spolni dimorfni vzorec ledvičnih prenašalcev in homeostaze elektrolitov. J Am Soc Nephrol 28: 3504–3517, 2017. doi: 10.1681/ASN.

7. Li Q, McDonough AA, Layton HE, Layton AT. Funkcionalne posledice spolnega dimorfizma transportnih vzorcev skupaj s podganjim proksimalnim tubulom: modeliranje in analiza. Am J Physiol Renal Physiol 315: F692–F700, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00171.2018.

8. Mitch WE. Presnovne in klinične posledice metabolične acidoze. J Nephrol 19 Suppl 9: S70–S75, 2006.

9. Hamm LL, Nakhoul N, Hering-Smith KS. Kislinsko-bazična homeostaza. Clin J Am Soc Nephrol 10: 2232–2242, 2015. doi:10.2215/CJN.07400715.

10. Weiner ID, Mitch WE, Sands JM. Presnova sečnine in amoniaka ter nadzor izločanja dušika skozi ledvice. Clin J Am Soc Nephrol 10: 1444–1458, 2015. doi: 10.2215/CJN.10311013.

11. Narobe O, Davies HE. Izločanje kisline pri boleznih ledvic. QJ Med 28: 259–313, 1959.

12. Baertl JM, Sancetta SM, Gabuzda GJ. Povezava akutnega pomanjkanja kalija z ledvično presnovo amonija pri bolnikih s cirozo. J Clin Invest 42: 696–706, 1963. doi: 10.1172/JCI104761.

13. Maher T, Schambelan M, Kurtz I, Hunter HN, Jones JW, Sebastian A. Izboljšanje presnovne acidoze z omejitvijo kalija v prehrani pri hiperkalemičnih bolnikih s kronično ledvično insuficienco. J Lab Clin Med 103: 432–445, 1984.

14. Striže L, Gabuzda GJ. Pomanjkanje kalija in endogena preobremenitev z amonijem iz ledvic. Am J Clin Nutr 23: 614–618, 1970. doi:10.1093/akne/23.5.614. F642 AJP-Renal Physiol doi:10.1152/ajprenal.00260.2021 www.ajprenal.org

15. Tannen RL, McGill J. Vpliv kalija na ledvično proizvodnjo amoniaka. Am J Physiol 231: 1178–1184, 1976. doi:10.1152/ajplegacy. 1976.231.4.1178.

16. Weiner ID, Verlander JW. Prenašalci amoniaka in njihova vloga pri kislinsko-bazičnem ravnovesju. Physiol Rev 97: 465–494, 2017. doi:10.1152/physrev.00011.2016.

17. Kovesdy CP, Anderson JE, Kalantar-Zadeh K. Povezava ravni bikarbonata v serumu s smrtnostjo pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo, ki ni odvisna od dialize. Nephrol Dial Transplant 24: 1232–1237, 2009. doi:10.1093/ndt/gfn633.

18. Navaneethan SD, Schold JD, Arrigain S, Jolly SE, Wehbe E, Raina R, Simon JF, Srinivas TR, Jain A, Schreiber MJ Jr, Nally JV Jr. Serumski bikarbonat in smrtnost pri 3. in 4. stopnji kronične ledvične bolezni . Clin J Am Soc Nephrol 6: 2395–2402, 2011.

19. Raphael KL, Murphy RA, Shlipak MG, Satterfield S, Huston HK, Sebastian A, Sellmeyer DE, Patel KV, Newman AB, Sarnak MJ, Ix JH, Fried LF; Zdravstvena ABC študija. Koncentracija bikarbonata, kislinsko-bazično stanje in umrljivost v študiji zdravja, staranja in telesne sestave. Clin J Am Soc Nephrol 11: 308–316, 2016.

20. Harris AN, Lee HW, Osis G, Fang L, Webster KL, Verlander JW, Weiner ID. Razlike v ledvični presnovi amoniaka v moških in ženskih ledvicah. Am J Physiol Renal Physiol 315: F211–F222, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00084.2018.