Serovari Salmonelle Enterica v odsotnosti genov TtrA in PduA okrepijo celični imunski odziv med okužbami piščancev

Salmonella spp. je eden glavnih povzročiteljev bolezni, ki se prenašajo s hrano, odgovoren za povzročanje gospodarske izgube v perutninski industriji in posledice za javno zdravje. Tako sposobnost preživetja patogena v črevesnem okolju med vnetjem kot tudi njihov odnos z imunskim sistemom gostitelja igrata ključno vlogo med okužbami pri perutnini. Cilj te študije je bil kvantificirati prisotnost makrofagov in populacij celic CD4+ /CD8+ z uporabo imunohistokemijske tehnike v komercialnih linijah piščancev, eksperimentalno okuženih z divjim tipom in mutiranimi sevi salmonele. Enteritidis in Salmonella Typhimurium brez genov ttrA in pduA. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA je sprožila večji odstotek obarvanega območja kot divji tip, z izjemo lahkih kokoši nesnic. Divji tip seva Salmonella Typhimurium in okužbe s Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA vodijo do podobnega vzorca, pri katerem so pri 1 in 14 dpi slepi tonzili in ileum ptic pokazali bolj izrazito obarvano območje v primerjavi s 3 in 7 dpi. V vseh proučevanih linijah so opazili izrazito infiltracijo makrofagov v primerjavi s celicami CD4+ in CD8+. Na splošno so živali, okužene z mutiranim sevom, pokazale pozitivno obarvano območje višje od divjega tipa. Delecije v genih ttrA in pduA so povzročile intenzivnejšo infiltracijo makrofagov ter celic CD4+ in CD8+ v pticah gostiteljicah, kar kaže na odsotnost atenuacije patogena, tudi pri različnih sevih salmonele.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Salmonella enterica je patogen, ki se prenaša s hrano in povzroča izgube pri živini ter neposredno vpliva na javno zdravje. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) in Typhimurium (Salmonella Typhimurium) že desetletja povezujejo predvsem z okužbami s hrano. Med letoma 1995 in 2010 je bila Salmonella Enteritidis ugotovljena v 34,2 % vseh vzorcev, pozitivnih na Salmonella spp1. Poleg tega so Winter et al.2 objavili obsežno študijo, ki je preučevala vlogo gena, ki kodira tetrationat, pri čemer so izbrali serotip Salmonella Typhimurium, vendar so uporabili miši kot poskusni model. Ob upoštevanju tega bi lahko poglobitev našega znanja o interakciji med gostiteljem in patogenom pomagala izboljšati meritve nadzora in izkoreninjenja. V patogenezo salmoneloze je vključenih več dejavnikov, kot je sposobnost razmnoževanja patogena v okolju vnete sluznice, odvisno od pridobivanja hranil in anaerobnega dihanja2. Vendar pa razpoložljivost hranil ne zagotavlja preživetja bakterij v konkurenčnem okolju, ki je gosto naseljeno z drugimi mikroorganizmi. Tako sposobnost Salmonelle enterica, da presnavlja tetrationat z uporabo tetrationat reduktaze za proizvodnjo 1,2-propandiola kot vira energije, daje prednost pri telesni pripravljenosti. Ta encim sestavljajo TtrA, TtrB in TtrC. Prva navedena podenota pripada superdružini molibdopterina (MPT) in ima domeno, ki meji FeS, ki sodeluje pri redukciji tetrationata v tiosulfat (S2O3 2-)2–4. Te 1,2-propandiol uporabljajo mikrokompartmenti bakterij (MCP). Ta struktura je sestavljena iz sedmih različnih proteinov, med katerimi je PduA glavna komponenta strukture MCP5. Najprej se 1,2-propandiol pretvori v propionaldehid, ta pa se z aktivnostjo propandiol dehidrataze reducira v propanol in propionat. Ta proces ustvarja ATP s fosforilacijo, gradientom elektronov (1-propanol) za regeneracijo NAD in posrednikom (propionil-CoA), ki se lahko uporablja kot ogljik in vir energije v celotnem metil citratu preko, saj je odvisen od sintetiziranega vitamina B12 na endogeni način6. Med okužbami pri piščancih sposobnosti serovarjev Salmonella enterica, da vdrejo in preživijo znotraj črevesnih epitelijskih celic in makrofagov, sledi izogibanje imunskemu odzivu7. V tem kontekstu je okužba kritična faza, ki je odvisna od interakcije med bakterijskimi in gostiteljskimi celicami ter sposobnosti bakterij, da premagajo ovire črevesnega epitelija, da se zagotovi njihova kolonizacija in razmnoževanje. Kljub temu aktivira vnetne in imunske odzive8, ki vodijo do endocitoze in fagocitoze epitelijskih oziroma antigen predstavljajočih celic (APC). Protimikrobna aktivnost teh celic sproži prirojeni odziv prek makrofagov, sklop prilagodljivega imunskega odziva pa temelji na aktivaciji CD4+ in CD8+9. Da bi osvetlili interakcije med gostiteljem in patogenom v ozadju črevesne okužbe s salmonelo pri piščancih, ocenjujemo populacijo celic imunskega sistema med črevesno kolonizacijo in sistemsko okužbo pri pticah komercialnih linij, ki jih izzovejo divji tipi mutantnih sevov Salmonella Enteritidis in Salmonella Typhimurium , ki nosi delecije v genih, povezanih s presnovo tetrationata (ttrA) in 1,2-propandiola (PDU).

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Rezultati

Poskus 1—izziv Salmonella Enteritidis.

Rezultati kvantificiranja prisotnosti celic imunskega odziva v slepih tonzilah, cekumu, ileumu in jetrih brojlerjev, lahkih in pol težkih nesnic so prikazani v tabelah 1, 2 in 3. Našli smo več CD-jev. 4+ in infiltracijo makrofagnih celic pri pitovnih piščancih, okuženih s Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA), kot o pitovnih piščancih okuženih s sevom divjega tipa Salmonella Enteritidis (wt-SE) ali neokuženih pticah, v vseh ocenjenih tkivih. Izjema je bila ugotovljena za infiltracijo celic CD4+ pri 3 dpi v slepih tonzilah, ileumu in jetrih ter za infiltracijo makrofagov pri 3 in 14 dpi v jetrih brojlerjev, okuženih s SEΔttrAΔpduA. Poleg tega je bilo število infiltriranih celic CD8+ opaženo v večji količini pri pticah, ki so bile izzvane s SEΔttrAΔpduA pri 1 in 7 dpi v cekumu in jetrih, pri 3 dpi v slepih tonzilah in 14 dpi v ileumu. V nasprotju s tem so imele ptice, okužene z wt-SE, visoko infiltracijo celic CD8+ v ileumu in slepih tonzilah pri 1 oziroma 7 dpi (tabela 1; dopolnilna slika S1). Tabela 2 in dodatna slika S2 prikazujeta CD4+ in CD8+ ter infiltracijo makrofagov v tkivih poltežkih kokoši nesnic. Na splošno je prišlo do velikih razlik med področji celičnih infiltratov tako glede izzivalnega seva kot proučevanih tkiv. Ptice, izzvane s SEΔttrAΔpduA, so pokazale višje površine, pokrite s celicami CD4+ (v ileumu pri 1 in 14 dpi ter jetrih pri 7 dpi) in makrofagi (v ileumu pri 7 dpi in jetrih pri 3, 7 in 14 dpi), kot v istem tkivu ptic, okuženih z wt-SE. Po drugi strani pa so celice CD8+ našli v večjih količinah v tonzilah slepega črevesa (pri 1 in 7 dpi) in cekumu (pri 3 dpi) ptic, ki so bile okužene s sevom wt-SE. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA je drugače opažena pri pitovnih piščancih in poltežkih nesnicah, pri izzivu lahkih kokoši nesnic pa je sprožila celična področja z manj intenzivnim imunskim odzivom kot divji tip. Ptice z Wt-SE so pokazale večja območja infiltracije CD4+ v slepih tonzilah (pri 1 in 3 dpi), cekumu (pri 3, 7 in 14 dpi), ileumu (pri 1 in 7 dpi) in jetrih (pri 14 dpi). Podobno so izzivi s SEΔttrAΔpduA povzročili zmanjšana območja infiltracije obeh CD8+ v slepih tonzilah (pri 1 dpi) in ileumu (pri 7 in 14 dpi) ter makrofagov v slepih tonzilah in cekumu (pri 3 dpi), v primerjavi s pticami, okuženimi z wt-SE. V jetrih ptic, okuženih s SEΔttrAΔpduA in z wt-SE, niso opazili nobenih pomembnih sprememb območja celic imunskega sistema CD8+ in celic makrofagov. Podrobni rezultati izziva z lahkimi kokošmi nesnicami so prikazani v tabeli 3 (glejte dodatno sliko S3).

Tabela 1. Predstavitev pomembne razlike v zvezi s kvantitativno porazdelitvijo različnih celic imunskega odziva v organih pitovnih piščancev, okuženih z divjimi in mutiranimi sevi Salmonella Enteritidis v različnih dneh po okužbi. DPI, dnevi po okužbi; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis divji tip; ns, ni bistvene razlike. Znotraj vsakega organa in DPI * pomeni razliko z dvosmerno ANOVA, ki ji sledi Bonferronijev primerjalni test med vrednostmi divjih in mutantnih sevov (*P manj kot ali enako 0.05; **P manj kot ali enako 0.01; ***P Manjše ali enako 0,001; ****P Manjše ali enako 0,0001). Sev, predstavljen v tabeli (∆-SE ali wt-SE) kot pomemben znotraj organa in DPI, je tisti, ki prikazuje glavno območje inflacije v vsako celico.

Tabela 2. Prikaz pomembne razlike v zvezi s kvantitativno porazdelitvijo različnih celic imunskega odziva v organih poltežkih kokoši nesnic, okuženih z divjimi in mutiranimi sevi Salmonella Enteritidis v različnih dneh po okužbi. DPI, dnevi po okužbi; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis divji tip; ns, ni bistvene razlike. Znotraj vsakega organa in DPI * pomeni razliko z dvosmerno ANOVA, ki ji sledi Bonferronijev primerjalni test med vrednostmi divjih in mutantnih sevov (*P manj kot ali enako 0.{{10}}5 ; **P Manjše ali enako 0.01; ***P Manjše ali enako 0,001; ****P Manjše ali enako 0,0001). Sev, predstavljen v tabeli (∆-SE ali wt-SE) kot pomemben znotraj organa in DPI, je tisti, ki prikazuje glavno območje inflacije v vsako celico.

Tabela 3. Predstavitev pomembne razlike v zvezi s kvantitativno porazdelitvijo različnih celic imunskega odziva v organih lahkih kokoši nesnic, okuženih z divjimi in mutiranimi sevi Salmonella Enteritidis v različnih dneh po okužbi. DPI, dnevi po okužbi; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis divji tip; ns, ni bistvene razlike. Znotraj vsakega organa in DPI * pomeni razliko z dvosmerno ANOVA, ki ji sledi Bonferronijev primerjalni test med vrednostmi divjih in mutantnih sevov (*P manj kot ali enako 0.{{10}}5 ; **P Manjše ali enako 0.01; ***P Manjše ali enako 0,001; ****P Manjše ali enako 0,0001). Sev, predstavljen v tabeli (∆-SE ali wt-SE) kot pomemben znotraj organa in DPI, je tisti, ki kaže glavno območje infiltracije v vsako celico.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Poskus 2—izziv Salmonella Typhimurium.

Rezultati kvantifikacije prisotnosti celic imunskega odziva v tonzilah cekuma, cekumu, ileumu in jetrih brojlerjev, poltežkih kokoši nesnic in lahkih kokoši nesnic so prikazani v tabelah 4, 5 oziroma 6. Na splošno so brojlerji, okuženi z mutiranim sevom, vse štiri dni vzorčenja pokazali pozitivno označeno območje, višje od tistih, okuženih s sevom divjega tipa Salmonella Typhimurium (wt-STM). Poleg tega v neokuženih kontrolnih skupinah niso opazili nobenih sprememb celic imunskega odziva. Površine celic CD4+ v vseh tkivih brojlerjev so dosegle statistično razliko pri 1 dpi, z večjimi infiltracijami za izziv s Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Pomembna razlika med območjem kvantificiranega imunskega odziva pri pticah, okuženih s STM∆ttrA∆pduA in wt-STM, je bila z večjimi infiltracijami, ko je bil izziv z mutantnim sevom v cekumu in ileumu pri 1 dpi, in jetrih pri 14 dpi (CD8+ celice); v cekumu, ileumu in jetrih pri 1 in 14 dpi (makrofagi) (tabela 4; dopolnilna slika S4). Rezultati pri poltežkih nesnicah niso pokazali nobene statistične razlike med izzivi mutantnega in divjega tipa seva za celice CD4+ v cekumu in celice CD8+ v tonzilah in ileumu v cekumu v vseh 4 dneh ocenjene po okužbah (tabela 5; dopolnilna slika S5). Ko pa so opazili pomembno območje koncentracije celic imunskega sistema, so bile poltežke kokoši nesnice izzvane s STM∆ttrA∆pduA: območje infiltracije glavnih makrofagov v vseh proučevanih tkivih (pri 1 in 14 dpi); veliko območje infiltracije celic CD4+ v tonzilah slepega črevesa in jetrih (pri 1, 7 in 14 dpi) (tabela 5; dopolnilna slika S5). Tabela 6 in dopolnilna slika S6 prikazujeta infiltracijo CD4+, CD8+ in makrofagov v tkivih lahkih kokoši nesnic. Ptice, izzvane s STM∆ttrA∆pduA, so pokazale glavno območje celic imunskega sistema CD4+ in celice makrofagov v slepih tonzilah in cekumu (pri 14 dpi) ter ileumu (pri 1 in 14 dpi) v primerjavi s celicami imunskega odziva območje istih tkiv pri pticah, okuženih z wt-STM. V slepih tonzilah, cekumu in ileumu pri okuženih pticah niso odkrili nobene statistične razlike za območje infiltracije CD8+. V nasprotju z rezultati, pridobljenimi v drugih tkivih, so imela jetra ptic, okuženih s STM∆ttrA∆pduA, bolj izrazito obarvano območje celic imunskega odziva za celice CD4+ in CD8+ pri vseh štirih dpi, in makrofagi pri 1 in 14 dpi.

Tabela 4. Predstavitev pomembne razlike v zvezi s kvantitativno porazdelitvijo različnih celic imunskega odziva v organih brojlerjev, okuženih z divjimi in mutantnimi sevi Salmonella Typhimurium v ​​različnih dneh po okužbi. DPI, dnevi po okužbi; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium divji tip; ns, ni bistvene razlike. Znotraj vsakega organa in DPI * pomeni razliko z dvosmerno ANOVA, ki ji sledi Bonferronijev primerjalni test med vrednostmi divjih in mutantnih sevov (*P manj kot ali enako 0.05; **P manj kot ali enako 0.01; ***P Manjše ali enako 0,001; ****P Manjše ali enako 0,0001). Sev, ki je v tabeli (∆-STM ali wt-STM) predstavljen kot pomemben znotraj organa in DPI, je tisti, ki prikazuje glavno območje inflacije v vsako celico.

Tabela 5. Prikaz pomembne razlike v zvezi s kvantitativno porazdelitvijo različnih celic imunskega odziva v organih poltežkih kokoši nesnic, okuženih z divjimi in mutantnimi sevi Salmonella Typhimurium v ​​različnih dneh po okužbi. DPI, dnevi po okužbi; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium divji tip; ns, ni bistvene razlike. Znotraj vsakega organa in DPI * pomeni razliko z dvosmerno ANOVA, ki ji sledi Bonferronijev primerjalni test med vrednostmi divjih in mutantnih sevov (*P manj kot ali enako 0.{{10}}5 ; **P Manjše ali enako 0.01; ***P Manjše ali enako 0,001; ****P Manjše ali enako 0,0001). Sev, ki je v tabeli (∆-STM ali wt-STM) predstavljen kot pomemben znotraj organa in DPI, je tisti, ki prikazuje glavno območje inflacije v vsako celico.

Tabela 6. Predstavitev pomembne razlike v zvezi s kvantitativno porazdelitvijo različnih celic imunskega odziva v organih lahkih kokoši nesnic, okuženih z divjimi in mutantnimi sevi Salmonella Typhimurium v ​​različnih dneh po okužbi. DPI, dnevi po okužbi; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium divji tip; ns, ni bistvene razlike. Znotraj vsakega organa in DPI * pomeni razliko z dvosmerno ANOVA, ki ji sledi Bonferronijev primerjalni test med vrednostmi divjih in mutantnih sevov (*P manj kot ali enako 0.{{10}}5 ; **P Manjše ali enako 0.01; ***P Manjše ali enako 0,001; ****P Manjše ali enako 0,0001). Sev, predstavljen v tabeli (∆-STM ali wt-STM) kot pomemben znotraj organa in DPI, ki prikazuje glavno območje infiltracije vsake celice.

Diskusija

Bakterije lahko, kadar so izpostavljene anaerobnim pogojem, uporabljajo presnovne substrate tetrationat in 1,2-propandiol za vire energije in dihanja10. Tako so Salmonella spp. že dolgo predmet preiskav, kako bi izbris genov, za katere je znano, da so odgovorni za te poti, vplival na njihovo preživetje v gostitelju. Kolikor nam je znano, je bila objavljena samo ena študija, ki je preučevala istočasno vlogo gena, ki kodira tetrationat in propandiol. Naša raziskovalna skupina je poročala o učinkih teh izbrisov z ocenjevanjem sistemske okužbe in fekalnega izločanja Salmonelle Enteritidis in Salmonelle Typhimurium v ​​komercialnih linijah piščancev11. Da bi povečali razpravo o tej temi, so pričujoči rezultati poudarili imunsko celico, infiltrirano v različnih tkivih piščančjih linij, ki so bile izzvane tako z divjim tipom kot z mutiranimi sevi, ki nosijo delecije v genih ttrA in pduA. V 2-tedenskem poskusu pozitivno obarvana področja celic in makrofagov CD4+ in CD8+ sledijo večinoma podobnemu vzorcu, pri čemer pri 1 in 14 dpi predstavljajo večje število imunskih odzivov celice. To je mogoče pojasniti s primarnim stikom obrambnega sistema gostitelja, ko patogen vdre. Prejšnje poročilo je pokazalo, da lahko okužba pri okuženih piščancih, tudi če se salmonela ne izloči pri 12 dpi, postane pozitivna pri brisu kloake pri 13 dpi12, kar pojasnjuje, zakaj so bila področja celic imunskega sistema pri 3 in 7 dpi nižja, a spet v porastu. . Na prvi pogled bi pričakovali, da bi bil izzvani odziv gostitelja zmanjšan, ko bi bila izbrisana tako pduA kot ttrA, saj imata ta geni pomembno vlogo pri preživetju med okužbo s salmonelo 2, 4, 13–15. Vendar pa so naši rezultati primerjave dvojnega mutanta brez obeh genov pokazali nasprotno, mutantni sevi Salmonella Enteritidis in Salmonella Typhimurium so sprožili celice z višjim imunskim odzivom kot divje vrste sevov.

Prednosti cistanche tubulosa- okrepiti imunski sistem

Najkrajše obarvano območje bi lahko privedlo do velikega števila kolonij v črevesnem traktu, kar potrjuje prejšnjo študijo, v kateri so sevi Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA in Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA v brisih kloake odkrili v večjem številu kot korelacija njihovega divjega tipa11 . Salmonela se lahko obnaša kot zunajcelična ali znotrajcelična bakterija, odvisno od razpoložljivega repertoarja hranil, in se pojavi kot preklop med črevesno kolonizacijo in internalizacijo v gostiteljske celice16. Ko makrofagi zaužijejo bakterije in jih ubijejo, se nekateri peptidni fragmenti prenesejo na površino celice, ki predstavlja antigen, in jih kodira glavni histokompatibilni kompleks (MHC), razred II. Ta vezava peptida na MHC II stimulira T CD4+ limfocite. Če pa se bakterije odločijo invazijo na gostiteljsko celico in vstopijo v citoplazmo makrofaga, peptidna povezava z drugo vrsto MHC, razreda I, stimulira proizvodnjo T CD8+ limfocitov17. Zanimivo je, da celice CD4+ in CD8+ predstavljajo isti vzorec makrofagov v celotnem poskusu, celo predstavljajo različne imunske odzive. Ker celice CD4+ in CD8+ v glavnem predstavljajo limfocite T, ki so del adaptivnega imunskega odziva, so makrofagi del prirojenega imunskega odziva9. Poleg tega smo opazili, da imajo pitovni piščanci bolj izrazito pozitivno označena območja kot kokoši nesnice, kar je potrdila prejšnja študija, v kateri so brojlerji, ki so bili izzvani z mutiranimi sevi, pokazali na primer bolj invazivno črevesno kolonizacijo in sistemsko okužbo11. Naše ugotovitve kažejo, da imunohistokemijski pristop zagotavlja zanimive informacije o obnašanju celic imunskega odziva na več organih različnih komercialnih linij med okužbo s serovarji Salmonella enterica. Poleg tega ta študija dokazuje, da je izbris obeh genov, tudi pri različnih sevih salmonele, povzročil bakterije, ki so v gostitelju izzvale celico z višjim imunskim odzivom, kar kaže, da patogen ni bil oslabljen. Menimo lahko, da je salmonela morda uspela najti drug mehanizem preživetja, da postane še bolj patogena. Uporaba operonov ttr in pdu v sozvočju z operoni cob in PRP je bila v prejšnji študiji prikazana kot nujna za anaerobno dihanje16, zaradi česar verjamemo, da ni potrebno samo izbrisati več genov iz vsakega operona18, ampak imamo tudi razmisliti o izbrisu celotnega sklopa, da bi dosegli manj patogene vrste Salmonelle enterice.

Materiali in metode

Poskuse, ki so bili izvedeni v skladu z ustreznimi smernicami in predpisi, je odobril Etični odbor za uporabo živali Državne univerze v Sao Paulu (CEUA/Unesp Process—006621/18; 10. maja 2018), izvedeni so bili v aviarni patologiji. Laboratorij Oddelka za patologijo, teriogenologijo in eno zdravje s Fakultete za kmetijske in veterinarske vede Državne univerze v Sao Paulu (FCAV/Unesp), Jaboticabal, Brazilija.

Bakterijski sevi in ​​konstrukcija mutantov.

Bakterijski sevi, uporabljeni tukaj, so bili shranjeni v krioprotektivnem mediju, sestavljenem iz brozge Lysogeny (LB; BD DifcoTM, ZDA) s 30 % glicerola (Merck, BR—H30402394 228) in shranjeni v ultra zamrzovalniku (− 80 stopinj) v Laboratoriju za ptičjo patologijo pri FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (pristopna številka: AM933172) in Salmonella Typhimurium str. 9819 so povzročili odpornost na nalidiksično kislino in spektinomicin (Nalr Spcr) in so zagotovili genetsko ozadje za konstruiranje mutantnih sevov z lambda-rdečo tehniko20 z manjšimi modifikacijami, opisano v Saraiva et al.11. Tukaj zgrajene mutantne bakterije so v besedilu identificirane kot SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) in STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

Eksperiment in vivo.

Poskus 1—Salmonella Enteritidis. Šestintrideset 1-dnevnih piščancev iz vsake od treh različnih linij (brojlerjev, poltežkih kokoši nesnic in lahkih kokoši nesnic), skupaj sto osem živali, je bilo pridobljenih iz komercialnih valilnic. Ob prihodu je bilo pregledano dno škatel za transportne kartice, da se potrdi status ptic brez salmonele21, živali pa so bile nameščene v kovinskih kletkah znotraj aklimatiziranega prostora in so prejemale krmo in vodo brez antibiotikov ad libitum. Prvi dan je bil izbran svetlobni program 24-h, da se zagotovi optimalno zaužitje vode in hrane, nato pa je bil prvi teden sprejet svetlobni program 12-h, preostale dni pa se je zmanjšal na 8 ur. Inokulum je bil pripravljen v skladu z Berchieri Junior et al.22. Za to so bile zamrznjene kulture cepljene v LB in inkubirane čez noč pri 37 stopinjah pod 150 obrati na minuto. Naslednji dan smo bakterijske kulture prenesli v sveže gojišče in inkubirali 18 ur pod enakimi pogoji kot prej. Nato je bilo 0,2 mL iz kultur, ki so vsebovale 108 enot, ki tvorijo kolonije, na mL (CFU/mL), oralno inokuliranih s kovinsko sondo neposredno v pridelek ptic. Oblikovanih je bilo devet skupin (A do I) in naključno razdeljenih glede na različne linije in seve (tabela 7). En, tri, sedem in 14- dni po okužbi (dpi) so bile tri ptice na skupino vsak dan do jutra evtanazirane z izpahom materničnega vratu, da bi pobrali medialni del slepih tonzil, cekuma, in ileum ter distalni del levega režnja jeter za nadaljnjo imunohistokemijsko (IHC) analizo. Za to so bili vzorci potopljeni v n-Heksan pa (n-Hexano pa, Synth, Brazilija), ki je bil predhodno ohlajen v tekočem dušiku. Takoj po zamrznitvi tkiva smo ga prenesli v 2 ml kriocevko (Corning, ZDA) in kondicionirali v tekočem dušiku. Po vzorčenju so bila tkiva shranjena pri -80 stopinjah do postopka za IHC.

Poskus 2—Salmonella Typhimurium. Ta poskus je bil izveden po enakih značilnostih, omenjenih zgoraj v poskusu 1. Šestintrideset piščancev (starih 1 dan) je bilo naključno razdeljenih v devet skupin (A do I) na podlagi njihovih rodov in sevov (tabela 7).

Tabela 7. Ustanovljene skupine glede na različne linije in seve. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis divji tip; wt-STM, Salmonella Typhimurium divji tip; NC, negativna kontrola.

Imunohistokemija.

Odsek tkiva. Zbrani vzorci so bili preneseni iz –80 stopinj v kriostat (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nemčija) pri –22 stopinjah, kjer so bili posamično blokirani v spojini OCT (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Nizozemska) na 30 minut pred tem. do 6 µm odseka z nizkoprofilnimi rezili za enkratno uporabo (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nemčija). Omeniti velja, da so bili rezi narejeni pri –22 stopinjah, razen rezov jeter, ki so bili narejeni pri –15 stopinjah. Pripravljeni so bili diapozitivi, ki so vsebovali tri ponovitve reza vsakega organa na označen odziv imunske celice, z redčenjem med vsako ponovitvijo. S čopičem so bili rezi tkivnih rezov postavljeni na histološka stekelca, predhodno obdelana s poli-l-lizinom (Sigma-Aldrich, Združeno kraljestvo, kat. št. P4832) in silanom (Sigma-Aldrich, ZDA. Kat. št. 440574). Stekelca smo nato shranili pri -20 stopinjah do IHC barvanja. Barvanje imunskih celic. Najprej so bila stekelca potopljena v 200 ml ohlajenega acetona (Acetone PA-ACS, Synth, Brazilija) in inkubirana pri -20 stopinjah 10 minut. Po tem smo stekelca prenesli v vlažno komoro (EasyPath®, Brazilija) pri sobni temperaturi za 5 minut, da se vzorci posušijo. Predmetna stekelca smo nato sprali s PBS in lužo pustili 5 minut, da bi preprečili dehidracijo tkiva. Deset, tkiva smo potopili v 200 ml 4% H2O2 na 10 minut v temnem prostoru in ponovno sprali s PBS. Območje okoli delov tkiva je bilo posušeno z vpojnim papirjem in vzorec je bil obdan s hidrofobnim peresom (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Danska). Korak pranja, ki je zapustil lužo, smo ponovili kot prej. Za barvanje imunskih celic smo uporabili komplet brez biotina Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, ZDA), pri čemer smo izbrali metodo Avidin-Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC). V ta namen smo odstranili lužo in tkivom dodali kapljice reagenta nespecifičnega blokatorja barve ozadja. Predmetna stekelca smo 30 minut hranili v vlažni komori na temnem mestu, korak izpiranja smo ponovili in dodali 200 µL primarnega protitelesa (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Mouse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, ZDA), nato smo dodali razredčeno v razmerju 1:200 (v/v) v reagentu za redčenje protiteles (Antibody diluent, Abcam©, ZDA). Predmetna stekelca smo inkubirali pri 4 stopinjah 18 ur. Naslednji dan stekelca sprali kot prej. Po odstranitvi odvečnega PBS smo dodali deset kapljic sekundarnega protitelesa (Reveal Complement, Abcam©, ZDA) in vlažno komoro za 30 minut postavili v temen prostor. Nato smo kapljico 3,3′-diaminobenzidina (DAB Chromogen 50×, Abcam©, ZDA) razredčili v 1 ml substrata (DAB Substrate, Abcam©, ZDA), katerega volumen zadošča za tri stekelca, in dodali k odseke tkiva. Eno minuto kasneje smo stekelca za 5 minut potopili v 200 ml dH2O. Po tem so jih prenesli v plastično kocko, ki je vsebovala Harrisov hematoksilin (Êxodo Científca, Brazilija) in jih pustili 1 minuto. Zadaj smo stekelca izpirali 10 minut pod tekočo vodo pri nizkem tlaku. Diapozitivi so bili predloženi seriji alkohol-ksilen (70 % alkohol, 90 % alkohol, 100 % alkohol, ksilen I in ksilen II). Na koncu so bila pokrovna stekelca nameščena na objektna stekelca po dodajanju kapljice brezvodnega pritrdilnega medija (Entellan®, Merck, Brazilija). Slike iz delov tkiva so bile posnete naključno, pri čemer so izbrali pet naključnih vidnih polj z uporabo optičnega mikroskopa (leča 400×) (Coleman®, model N-120) z adapterjem za digitalni fotoaparat za nadaljnjo statistično analizo (slika 1 ).

Analiza podatkov.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Odstotek celic in makrofagov CD{{0}} in CD8+ je bil izračunan z uporabo Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, ZDA). Kvantificirali so jih kot odstotne vrednosti s pozitivno površino markerja imunskih celic/skupno površino. Statistične analize in grafike so bile narejene z uporabo programske opreme GraphPad Prism v.8.0.1 za macOS (GraphPad Sofware, La Jolla California, ZDA), podatki pa so bili predloženi analizi variance (ANOVA), ki ji je sledila Bonferronijeva večkratna primerjava, ob upoštevanju stopnje pomembnosti, nižje od 5 % (P manj kot ali enako 0,05).

Slika 1. Odsek slepega črevesa brojlerjev, okuženega s Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA, ki kaže imunoreakcije v makrofagih, 7 dni po okužbi (×400; avidin–biotin streptavidin peroksidaza, kontrastno obarvana s hematoksilinom).

Reference

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Viri človeške netifusne salmoneloze: pregled. Braz. J. Poult. Sci. 12 (1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE et al. Vnetje črevesja zagotavlja respiratorni akceptor elektronov za salmonelo. Narava 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Specifičnost dihalnih poti, vključenih v redukcijo žveplovih spojin s Salmonella enterica. Mikrobiologija (branje) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. Črevesno vnetje omogoča salmoneli, da uporablja etanolamin za tekmovanje z mikrobioto. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Regulacija uporabe fukoze in 1,2-propandiola s serovarjem Salmonella enterica Typhimurium. Spredaj. Microbiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Katabolizem propionata pri Salmonella Typhimurium LT2: Dve divergentno prepisani enoti obsegata lokus prp pri 8,5 centisomih, prpR kodira člana družine aktivatorjev sigma-54 in gene prpBCDE tvorijo operon. J. Bacteriol. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR Primerjava 3 metod kulture in testov PCR za odkrivanje Salmonelle Gallinarum in Salmonelle Pullorum v krmi za perutnino. Perutnina. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Dinamika infiltracije imunskih celic v lamino proprijo cekuma piščancev po neonatalni okužbi s sevom Salmonella Enteritidis. Dev. Comp. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fiziopatologija do imunskega sistema. V Doenças das Aves (ur. AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Alternativni tetrationat akceptor elektronov podpira B12-odvisno anaerobno rast Salmonella enterica serovar Typhimurium na etanolamin ali 1,{{4} }propandiol. J. Bacteriol. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. Dešifriranje vloge genov ttrA in pduA za serovarje Salmonella enterica v modelu okužbe pri piščancih. ptičji Pathol. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL. Navzkrižno reaktivni celični in humoralni imunski odzivi na serovare Salmonella enterica Typhimurium in Enteritidis so povezani z zaščito pred heterolognim ponovnim izzivom. vet. Immunol. Imunopatol. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ Osupljiv podvig: Da bi tekmovala s črevesno mikrobioto, Salmonella žene svojega gostitelja, da zagotovi respiratorni sprejemnik elektronov. Črevesni mikrobi 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI et al. Salmonela uporablja energijske taksije, da izkoristi črevesno vnetje. Patog PLoS. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te dinamične interakcije med salmonelo in mikrobioto v zahtevni niši prebavil. Int. Sch. Res. ne 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Encim IIANtr uravnava invazijo salmonele prek katabolizma 1,2-propandiola in propionata. Sci. Rep. 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Obramba gostitelja proti bakterijskim patogenom: obramba tkiva in krvi. V Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (ur. Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelberg stranska izguba gena dihalnih potreb v modelu okužbe pri piščancih. Mikrobni patogen. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Zmanjšanje fekalnega izločanja seva F98 Salmonella Typhimurium pri piščancih, cepljenih z živimi in ubitimi organizmi S. Typhimurium. Epidemiol. Okužiti. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Enostopenjska inaktivacija kromosomskih genov v Escherichia coli K-12 z uporabo produktov PCR. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. preiskava v transportni škatli enodnevnih ptic. Braz. J. Microbiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Opažanja o obstojnosti in vertikalnem prenosu serovarjev Salmonella enterica Pullorum in Gallinarum pri piščancih: Vpliv bakterijskega in gostiteljskega genetskega ozadja. ptičji Pathol. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).