Lipokalin, povezan z izločeno nevtrofilno želatinazo, kaže močnejšo sposobnost zaviranja povečanja ciste celic ADPKD v primerjavi z nesekretirano obliko Ⅱ

3. Rezultati

3.1. Primerjava ekspresije NGAL in celične proliferacije med celicami divjega tipa M-1 in celicami 2L3 ADPKD

Celična linija 2L3 je bila vzpostavljena s transdukcijo virusa SV40 primarnih ledvičnih epitelijskih celic miši Pkd1L3/L3 [17]. Kot kontrolo so bile uporabljene M-1 celice (mišja divja linija ledvičnih epitelijskih celic), kupljene pri BCRC (Hsinchu, Tajvan). Genotipizacija PCR transkriptov Pkd1 celic 2L3 in M-1 je bila izvedena za preverjanje genotipov z uporabo primerjev pred in po prvem mestu loxP v intronu 30 ciljnega alela (slika 1A). Tkiva miši Pkd1+/+, Pkd1L3/+ in Pkd1L3/L3 so bila uporabljena kot genotipske kontrole. Produkti PCR iz celic M-1 so pokazali en pas divjega tipa (WT) Pkd1+/+ (473 bp), medtem ko so produkti PCR iz celic 2L3 pokazali en pas Pkd1L3/L3 (507 bp) zaradi dodatnega segmenta loxP (34 bp) (slika 1B).

Za opredelitev, ali sta bili celici M-1 in 2L3 izledvičnih tubulih podobnega izvora, smo najprej primerjali morfologijo med 2 celičnima linijama; Celice M-1 in celice 2L3 so pokazale zelo podobno morfologijo (slika 1C). Poleg tega je bilo izvedeno barvanje lektina z lektinom Lotus tetragonolobus (LTL, marker diferenciranih proksimalnih tubulov, označen s fluoresceinom) in aglutininom Dolichos biflorus (DBA, marker diferenciranih distalnih tubulov in zbiralnih kanalov, označen z rodaminom), da bi preverili njihov izvor. iz ledvičnih tubulov (slika 1D). Rezultati obarvanja so pokazali, da so bile celice M-1 in 2L3 tako LTL- (večinoma kolokalizirane z DAPI) kot DBA-pozitivne (lokalizirane v citoplazmi) (slika 1D). Ta rezultat je nakazal, da celice M-1 in 2L3 izvirajo izledvičnih tubulihpodobnega izvora in imajo lahko podobne značilnosti. Rezultati PCR v realnem času so pokazali, da so imele celice 2L3 močno zmanjšane ravni izražanja mRNA Pkd1 v primerjavi s celicami M-1 (slika 1E), kar je bilo skladno s podatki iz miši 2L3 z nivoji izražanja proteina Pkd1 le 25 % miši divjega tipa [17]. Dokazano je bilo, da imajo miši 2L3 višje ravni NGAL in proteina receptorja NGAL (NGAL-R) v svojih ledvicah kot miši divjega tipa [31]. Rezultati PCR v realnem času so pokazali, da je bila raven izražanja mRNA Lcn2 15.96-krat večja v celicah 2L3 kot v celicah M-1 (slika 1F), kar je skladno s podatki, sporočenimi za miši 2L3 [31], medtem ko med obema skupinama ni bilo pomembne razlike v izražanju mRNA Slc22a17 (slika 1G). Rezultati Western blota so tudi pokazali, da so imele celice 2L3 višjo stopnjo izražanja NGAL kot celice M-1, medtem ko ni bilo pomembne razlike v ravni izražanja NGAL-R med obema skupinama (slika 1H). Celice in supernatante celic M-1 in 2L3 smo zbrali po gojenju 48 ur, da smo kvantificirali NGAL v celičnih lizatih in supernatantih (ki predstavljajo izločeni NGAL) z ELISA. Skladno z rezultati Western blota je ELISA pokazala, da je imel 2L3 znatno višjo znotrajcelično NGAL in izločanje NGAL v supernatantu kot M-1 (slika 1I).

Dokazano je, da miši 2L3 kažejo večjo celično proliferacijo kot miši divjega tipa [17]. Izvedeni so bili testi vključitve MTT in BrdU, da bi raziskali, ali je celična linija 2L3 pokazala tudi boljšo sposobnost preživetja in proliferacijo kot celice divjega tipa (slika 2A–C). Reprezentativne slike so pokazale večje sotočje celic 2L3 kot celic M-1 po gojenju 48 ur z enakim začetnim številom setev (slika 2A). Testi MTT so pokazali, da so imele celice 2L3 znatno boljšo sposobnost preživetja kot celice M-1, gojene 24 in 48 ur (slika 2B). Za primerjavo proliferacijske sposobnosti celic M-1 in 2L3 smo celice gojili 24 ur po testu vključitve BrdU, ki je pokazal, da imajo celice 2L3 bistveno boljšo proliferacijo kot celice M-1 (slika 2C) .

NOVA ZELIŠČA ZA BOLEZNI LEDVIC

3.2. Učinki dodatka mNGAL na sposobnost preživetja in proliferacijo celic 2L3

Izkazalo se je, da dajanje eksogenega NGAL zmanjša rast cist in vitro [25]. Naša prejšnja študija je pokazala, da je prekomerna ekspresija NGAL v mišjem modelu ADPKD (Pkd1L3/L3; miši NGALTg/Tg) zmanjšala napredovanje ciste, ki ga spremljajo spremembe v nizu molekularnih poti, vključenih vcelična proliferacija, apoptoza, infibroza[31]. Zato smo raziskali učinke rekombinantnega mNGAL na sposobnost preživetja celic 2L3 z uporabo testa MTT (slika 3). Čistost rekombinantnega mNGAL (brez signalnega peptida), očiščenega iz E. coli, je bila najprej določena s SDS-PAGE in barvanjem s Coomassie modrim, kar je razkrilo en sam 20-kD pas in zelo svetel dimerni pas pri visokih koncentracijah ( Slika 3A). Poleg tega je bila stabilnost mNGAL v mediju celične kulture analizirana z Western blottingom, ki je pokazal stabilnost mNGAL v mediju vsaj 48 ur (slika 3B). Opazili smo, da je mNGAL znatno zmanjšal sposobnost preživetja celic 2L3 v primerjavi s kontrolno skupino po zdravljenju 8 ur (slika 3C). V tem poskusu je bil kot pozitivna kontrola uporabljen rapamicin, ki je priznan kot zaviralec mTOR in je znano, da zavira proliferacijo epitelijskih celic in rast cist v modelu miši PKD [32]. Poleg tega je test vključitve BrdU tudi pokazal, da je 24-urno zdravljenje z mNGAL znatno zaviralo proliferacijo celic 2L3 (slika 3D). Proliferacija celic je ključna značilnost ADPKD in ugotovitev, da bi lahko proliferacijo celic 2L3 zmanjšala mNGAL, je pokazala, da bi mNGAL lahko dodatno zaviral nastajanje cist v celicah 2L3.

3.3. Signalne poti, na katere vpliva dodajanje mNGAL celicam 2L3

Dokazano je, da spajanje NGAL in NGAL-R sekvestrira znotrajcelično železo in nadalje inducira apoptozo [29]. Poleg tega so študije pokazale, da lahko NGAL inducira apoptozo v modelu ADPKD in vitro in in vivo [25,31]. Da bi raziskali, ali bi mNGAL lahko induciral apoptozo celic 2L3, smo analizirali apoptozo celic 2L3 s pretočno citometrijo. Na podlagi ugotovitve, da je mNGAL zaviral proliferacijo celic 2L3 po 8-urnem zdravljenju z mNGAL (slika 3D), smo analizirali učinke mNGAL na celice 2L3 v prejšnjih (4 h) in poznejših (12 h) časovnih točkah.

Za analizo s pretočno citometrijo je bilo potrebno veliko večje število celic in krajše trajanje kulture kot pri predhodno izvedenih testih MTT; zato so celice 2L3 zasejali na 6-plošče z vdolbinicami in na celice nanesli višjo koncentracijo mNGAL (600–1200 µg/mL). Rezultati so pokazali, da je 1200 µg/mL mNGAL pomembno zaviralo preživetje celic po 4 in 12 urah zdravljenja, medtem ko je 600 µg/mL mNGAL zaviralo preživetje celic šele po 4 urah zdravljenja (slika 3E). Testi apoptoze so bili izvedeni s pretočno citometrijo za odkrivanje celic, obarvanih z aneksinom V-FITC in PI. Aneksin V ima visoko afiniteto za fosfatidilserin (PS) in se uporablja za identifikacijo apoptotičnih celic z izpostavljenim PS [33]. Glede na rezultate obarvanja lahko celice razvrstimo kot normalne (AV−/PI−), zgodnje apoptoze (AV+/PI−), pozne apoptoze (AV+/PI+) in nekroze (AV−/PI+) in so prikazane v kvadrantne diagrame (slika 3F). Celice v zgodnji apoptotični fazi ohranijo nedotaknjene membrane, kar se razlikuje od celic v pozni apoptotični fazi z razpadlimi membranami [34]. Rezultati so pokazali, da je bila stopnja apoptoze celic 2L3 (vključno z zgodnjo AV+/PI− in pozno AV+/PI+ apoptozo) znatno povečana v primerjavi s stopnjo kontrolne skupine po 12 urah zdravljenja z mNGAL (1200 µg/mL; slika 3F, G). ).

slika 1. Primerjava izražanja NGAL med celicami divjega tipa M-1 in celicami 2L3 ADPKD. (A) Struktura alelov divjega tipa in L3 gena Pkd1. Genotipizacija PCR je bila izvedena z uporabo primerjev pred in po prvem loxP znotraj introna 30 Pkd1. Zapolnjeni trikotniki: loxP; gen za odpornost na neomicin, ki ga poganja promotor mc1 (mc1-neo), obdan z dvema mestoma loxP, je bil vstavljen v intron 34 Pkd1. (B) PCR genotipizacija transkriptov Pkd1 celic M-1 (473 bp) in celice 2L3 (507 bp). Za kontrolo so bili uporabljeni transkripti Pkd1 divjega tipa (+/+), heterozigotnih (L3/+) in homozigotnih (L3/L3) miši. RT–qPCR je pokazal, da ima 2L3 znatno nižji Pkd1 (C) M-1, celice 2L3 pa so pokazale podobno morfologijo. Merilna lestvica: 100 µm. (D) Celice M-1 in 2L3 so bile obarvane z lektinom Lotus Tetragonolobus (LTL, označeno s fluoresceinom, zeleno) in aglutininom Dolichos biflorus (DBA, označeno z mino Rhoda, rdeče) in DAPI (modro) ter opazovane z konfokalni mikroskop. Merilna lestvica: 50 µm. RT–qPCR je pokazala, da ima 2L3 znatno nižjo raven izražanja Pkd1 (E) in višjo Lcn2 (NGAL) (F) kot celice divjega tipa M-1. (G) Ni pomembne razlike v nivojih izražanja Slc22a17 (NGAL-R) med celicami M-1 in 2L3. RQ: relativna kvantifikacija=2 −ΔΔCt; Gapdh je bil uporabljen kot notranja kontrola vsakega vzorca. Vrednosti so bile normalizirane na M-1. (H) Rezultati Western blota so pokazali, da je 2L3