Spermidin lajša miohondrijske poškodbe miokarda novorojenčkov pri podganah, ki jih povzroča intrauterina hipoksija, z zaviranjem oksidativnega stresa in uravnavanjem nadzora kakovosti mitohondrijev 1. del

Povzetek

Ozadje: Intrauterina hipoksija (IUH) poveča tveganje za srčno-žilne bolezni pri potomcih. Kot lovilec reaktivnih kisikovih vrst (ROS) je poliamin spermidin (SPD) bistvenega pomena za preživetje in rast zarodka in ploda. Vendar pa so potrebne nadaljnje študije o zaščiti SPD in mehanizmih za poškodbe srca, ki jih povzroča IUH, pri potomcih.

Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Feniletanoidni glikozidi Cistanche imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih se miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in ima sposobnost čiščenja reaktivnih kisikovih vrst ter preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, ima pa tudi dober učinek popravljanja na poškodbe anionov prostih radikalov timina.

Kliknite na Cistanches Herba za preprečevanje staranja

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Cilji: Namen te študije je bil raziskati preventivne učinke prenatalnega zdravljenja s SPD na poškodbe srca, ki jih povzroči IUH, pri novorojenih podganah in njihov osnovni mehanizem, povezan z mitohondriji.

Metode: Podganji model IUH je bil ugotovljen z izpostavljenostjo 10 odstotkom O2 sedem dni pred terminom. Medtem so sedem dni breje podgane dobivale SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Enodnevne potomce podgan so žrtvovali, da bi ocenili več parametrov, vključno z razvojem rasti, poškodbo srca, proliferacijo kardiomiocitov, oksidativnim stresom miokarda, celično apoptozo in mitohondrijsko funkcijo, ter imeli nadzor kakovosti mitohondrijev (MQC), vključno z mitofagijo, mitohondrijsko biogenezo in mitohondrijska fuzija/cepitev. V poskusih in vitro so bili primarni kardiomiociti izpostavljeni hipoksiji z ali brez SPD 24 ur.

Rezultati: IUH je zmanjšal telesno težo, težo srca, izražanje srčnega Ki67, aktivnost SOD ter ravni CAT in adenozin 5'-trifosfata (ATP) ter povečal izražanje BAX/BCL2 in število TUNEL-pozitivnih jeder. Poleg tega je IUH povzročil tudi nenormalnost mitohondrijske strukture, disfunkcijo in zmanjšano mitofagijo (zmanjšano število mitofagosomov), zmanjšano mitohondrijsko biogenezo (zmanjšano izražanje SIRT-1, PGC-1, NRF-2 in TFAM) in je povzročilo neravnovesje fisije/fuzije (povečan odstotek mitohondrijskih fragmentov, povečano izražanje DRP1 in zmanjšano izražanje MFN2) v miokardu. Presenetljivo je zdravljenje s SPD normaliziralo variacije parametrov, ki jih povzroča IUH. Poleg tega je SPD preprečil tudi kopičenje ROS, ki ga povzroči hipoksija, razpad potenciala mitohondrijske membrane in zmanjšanje mitofagije v kardiomiocitih.

Zaključek: Zdravljenje s SPD pri materi je povzročilo poškodbe srca, ki jih povzroča IUH, pri novorojenih potomcih podgan z izboljšanjem miokardne mitohondrijske funkcije prek antioksidacije in anti-apoptoze ter uravnavanja MQC.

1. Ozadje

Epidemiološke študije in študije na živalih kažejo, da je škodljivo intrauterino okolje povezano s povečanim tveganjem za srčno-žilne bolezni v odrasli dobi (1). Prenatalna hipoksija, najpogostejše neugodno intrauterino okolje, lahko povzroči, da plod ne more uresničiti svojega genetsko določenega potenciala rasti, kar se kaže kot zaostajanje rasti in okvara delovanja organov v off-spring (2). Kronična fetalna hipoksija je pogosto posledica nosečnosti s povečanim žilnim uporom placente, kot je predklampsija, med nosečnostjo na visoki nadmorski višini ali bolezni dihal pri materi. Še pomembneje, tretjino jih prizadene obstruktivni hipoventilacijski sindrom med spanjem (OSAHS) v pozni nosečnosti, povezujejo pa ga tudi z razvojem sindroma gestacijske hipertenzije. Najbolj kritična patofiziološka sprememba SAHS je kronična intermitentna hipoksija (3, 4). V več živalskih modelih je intrauterina hipoksija (IUH) povzročila zmanjšanje srčne učinkovitosti, diastolično in sistolično disfunkcijo, hipertrofično rast, zmanjšano proliferacijo kardiomiocitov in zapoznelo zorenje kardiomiocitov v fetalnem in neonatalnem srcu, s čimer se poveča tveganje za srčne motnje pri odraslih potomcih ( 5). Učinek programiranja kronične hipoksije lahko v glavnem pojasni mehanizem v kritičnih fazah razvoja srca, kar vodi do povečanja srčnega oksidativnega stresa in povečanja apoptoze celic pri potomcih (6-9). Koncept razvojnega programiranja je smiseln, ker je naša fiziologija v zgodnjem življenju veliko bolj voljna in plastična. Intrauterino stanje določa in programira koncepte fiziologije in metabolizma našega življenja. Skladno s tem fetalni adaptivni odziv na IUH vodi v razvoj srčno-žilnih bolezni pri odraslih (10). Mitohondriji so kompleksni organeli, ki igrajo ključno vlogo pri ustvarjanju celične energije in neštetih signalnih dogodkih v kleti. Strukturna in funkcionalna celovitost mitohondrijev je ključnega pomena za preživetje kardiomiocitov, in ko je ogrožena, motnja mit-hondrijske homeostaze povzroči razvoj karakalnih bolezni. V zadnjem času se je več študij osredotočilo na vlogo mitohondrijske disfunkcije, ki povzroča kronično prenatalno hipoksijo, pri posredovanju poškodb srca pri potomcih. Poročali so, da je bila ta mitohondrialna funkcija oslabljena, izražanje več mitohondrijskih mol pravil pa je spremenilo perinatalno srce, izpostavljeno IUH (11). Poleg tega IUH vodi do zmanjšane enz e aktivnosti mitohondrijskega kompleksa in disfunkcije srca pri končnih potomcih po miokardni ishemiji (12). V skladu s tem je bila ta študija namenjena odkrivanju molekularne povezave med prenatalno hipoksijo, oksidativnim stresom, mitohondrijsko disfunkcijo in poškodbo srca pri novih potomcih (13).

Razvoj in zorenje tega mitohondrijskega sistema velikega volumna v miokardu poteka predvsem v perinatalni in postnatalni razvojni fazi, predvsem zaradi presnovnega premika srca z uporabe glukoze ali maščobnih kislin za nastajanje adenozin 5'-trifosfata (ATP) po rojstvu. (14). Pojavljajoči se dokazi kažejo, da so mehanizmi mitohondrijske kontrole kakovosti (MQC) ključni dejavniki za zorenje kardiomiocitov (15). Nadzor kakovosti mitohondrijev, ki v glavnem vključuje mitohondrijsko biogenezo, mitofagijo skupaj z dinamiko, natančno nastavljeno regulativno mrežo, usmerja količino in kakovost mitohondrijev ter izboljšuje delovanje mitohondrijev in preživetje kardiomiocitov v stresnih razmerah (16). Koaktivator 1 (PGC-1) ​​receptorjev za aktiviranje peroksisomskih proliferatorjev (PPAR) ima ključno vlogo pri spodbujanju mitohondrijske biogeneze in delovanja v srcu (17). Proliferatorji peroksisomov – koaktivator 1/(-/-) receptorjev aktivirajo mišja srca, ki kažejo znake okvare dozorevanja in resne nepravilnosti v delovanju in gostoti mitohondrijev (18). Poleg tega izbris mediatorja mitofagije Parkin prepreči morfološko in funkcionalno zorenje mitohondrijev v neonatalnem stadiju (19). Mitohondriji so zelo dinamični organeli, podvrženi nenehni cepitvi in ​​fuziji, povezani z njihovo funkcijo. V poznem embrionalnem obdobju za car ac specifična genetska ablacija mitohondrijske fuzije pro v MFN1 in MFN2 pri miših po rojstvu kaže hudo mitohondrijsko disfunkcijo in razvije kardiomiopatijo (20). Presenetljivo je, da je nedavna študija pokazala, da kronična hipija moti mitohondrijsko dinamiko v prednjih možganih ploda prašiča (21). V skladu s tem lahko MQC deluje kot osrednja točka pri razvoju poškodbe miokarda pri novorojenčkih IUH. Vendar pa je malo znanega o učinkih prenatalne hipoksije na neonatalni srčni sistem MQC in o učinku disfunkcije MQC na zdravje srca novorojenčka. Ta študija je prevzela to nalogo, da bi raziskala z mitohondriji povezan mehanizem poškodb miokarda, ki ga povzroči IUH, pri novih potomcih in nadalje raziskala preventivne strategije za zmanjšanje srčne poškodbe zaradi IUH.

Poliamini (PA), vključno s putrescinom (PU), spermidinom (SPD) in sperminom (SP), so prisotni v skoraj vseh živih organizmih in so bistveni za preživetje, rast in razvoj zarodka in ploda (22-24) . Študije so pokazale, da lahko ovce, izpostavljene IUH, izboljšajo embrionalno displazijo z dodajanjem eksogenih poliaminov (25, 26). Poleg tega vse več literature nakazuje vlogo poliaminov pri lovljenju prostih radikalov in zaščiti DNK, beljakovin in lipidov pred škodljivimi poškodbami oksidativnega stresa. Ugotovljeno je bilo tudi, da dodatek poliamina podaljša življenjsko dobo v modelnih organizmih z antioksidativnimi, protivnetnimi in pro-poskusi, ki inducirajo mitofagijo (27-29). Nedavne študije so dokumentirale, da je dodatek SPD v prehrani kardioprotektiven in podaljšuje življenjsko dobo pri miših in ljudeh s spodbujanjem mitofagije in mitohondrijskega dihanja ter izboljšanjem delovanja srca (30, 31). Še pomembneje je, da smo že poročali, da je hipoksična izpostavljenost matere v poznih fazah razvoja ploda povzročila dased ana list in povečan katabolizem poliaminov v karakalnem tkivu novorojenih podgan. SPD je preprečil poškodbo srca pri mladičih podgan, ki so bile izpostavljene IUH, tako da je zaviral mitohondrijsko mentacijo (32).

2. Cilji

V tej študiji se domneva, da IUH povzroča pomanjkljivosti mitohondrijske strukture in delovanja s povečanjem oksidativnega stresa in uničenjem mehanizma MQC v srcu novorojenčka, materino zdravljenje SPD v maternici pa naj bi zmanjšalo poškodbo miokarda z zmanjšanjem razvojnega programa mitohondrijev. Ta študija lahko prispeva k razvoju preventivnih ali terapevtskih strategij za potomce IUH za preprečevanje srčno-žilnih bolezni pri odraslih.

3. Metode

3.1. Živali

Samci in samice podgan Wistar (stare 3 mesece) so bili kupljeni na Oddelku za laboratorijske živali na Harbin Medical University. Vse postopke je odobril Odbor za etično presojo Harbinske medicinske univerze (Kitajska), vsi poskusi pa so bili izvedeni v skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje. Podgane z razmerjem med samci in samicami 2:1 so bile naključno postavljene v kletko za parjenje. Naslednji dan so opravili vaginalne brise, da bi ugotovili prisotnost sperme v vaginalnih čepkih ali vaginalnih brisih, kar je bilo potrjeno kot ničelni dan nosečnosti. Breje podgane so bile v prostoru z nadzorovano vlažnostjo (60 odstotkov) in nadzorovano temperaturo (21 stopinj), cikel svetlo-tema pa je bil 12:12 ur.

3.2. Model intrauterine hipoksije

Od 15. do 21. dne brejosti so podgane v skupini s hipoksijo (n=10) dali v zaprto komoro iz pleksi stekla, jim vbrizgali zrak in dušik ter jih spremljali z analizatorjem kisika (Pro OX12{{13). }}; BioSpherix, New York, ZDA), in ga vdihavamo z vsebnostjo kisika 10 odstotkov štiri ure na dan. Vzorci arterijske krvi so bili odvzeti iz desne femoralne arterije, izmerjene so bile vrednosti plina v krvi in ​​pH, da se je ohranil parcialni tlak arterijskega kisika 50 - 55 mmHg, nasičenost krvi s kisikom je bila vzdrževana pri 80 - 85 odstotkih in posebni postopki so bili izvedeni, kot je opisano prej (32). Poskusne podganje samice so bile naključno razdeljene v štiri skupine: kontrolna skupina (kontrola), skupina intrauterine hipoksije (Hpx), skupina intrauterine hipoksije plus spermidin (Hpx-Spd) in skupina intrauterine hipoksije plus spermidin plus inhibitor (Hpx-Spd-DFMO). ). Šest podgan na skupino je bilo intraperitonealno injiciranih 15. - 21 dan brejosti. Podgane so dobile 0,9-odstotno fiziološko raztopino (1 ml/kg/dan) v kontrolni skupini in skupini Hpx, SPD (5 mg/kg/dan) v skupini Hpx-Spd ter SPD (5 mg/kg/dan) in difluorometil -L-ornitin (DFMO, zaviralec ključnega encima sinteze poliaminov ODC) (5 mg/kg/d) v skupini Hpx-Spd-DFMO oz. Po porodu so 1-dnevne novorojenčke žrtvovali in izvlekli njihova srca za nadaljnje eksperimentalne študije.

3.3. Histološka analiza

Tkivo levega prekata podgan je bilo razrezano na < 1 cm debelo, fiksirano s 4 odstotki paraformaldehida, dehidrirano z alkoholom in vstavljeno v parafin. Vdelani parafin smo narezali na 5 mm debele rezine, nato posušili pri konstantni temperaturi pečice 60 stopinj, razvoskali s ksilenom in sledilo barvanje s hematoksilin-eozinom (HE). Rezine tkiva so opazovali, da bi ocenili spremembe v srčni morfologiji in strukturah z optičnim mikroskopom (Eclipse E200; Nikon, Tokio, Japonska).

3.4. Imunofluorescenčna analiza

Imunofluorescenčno barvanje Ki67 je bilo izvedeno, kot je opisano prej (33). Na kratko, tkivo levega prekata podgan je bilo fiksirano v 4-odstotnem formalinu, vdelanem v parafin; razvoskanje, hidracija in popravilo antigena so bili najprej zaključeni. Ta tkiva so bila 2 uri blokirana s 0,5-odstotnim govejim serumskim albuminom in nato inkubirana z zajčjim monoklonskim protitelesom Ki67 (1:100, AF1738, Beyotime, Kitajska) pri 4 stopinjah čez noč. Po izpiranju s PBS je bilo tkivo inkubirano z Alexa fluorom označenim kozjim anti-kunčjim IgG (1: 500, A 0468, Beyotime, Kitajska) in kontrastno obarvano z DAPI za jedra. Slike so bile pregledane in skenirane pod lasersko konfokalno mikroskopijo (OLYMPUS, FV1000, Japonska). Programska oprema je bila uporabljena za analizo kolokalizacije združenih slik.

3.5. Kvantifikacija fibroze

Srčno fibrozo so ocenili z Massonovim trikromnim barvanjem. Kot je opisano zgoraj, so bili deli srčnega tkiva novorojenih podgan razvoskani in hidrirani s standardnimi metodami in nato obarvani z Massonovim trikromom v skladu s protokoli. Za vsako srce sta bila uporabljena dva nesosednja prečna prereza. Odstotek fibrotičnega območja v celotnem miokardnem območju levega prekata je bil analiziran s programsko opremo ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. TdT posredovano dUTP Nick End označevanje in meritve apoptotičnih celic

Za določitev števila apoptotičnih celic v en dan starih srcih novorojenčkov podgan je bil uporabljen TdT-posredovan test dUTP nick end marking (TUNEL). Srčna tkiva smo obdelali po našem prej opisanem postopku z uporabo kompleta za odkrivanje celične smrti (Roche, Nemčija) v skladu z navodili proizvajalca. Trije stekelci iz vsakega bloka so bili ovrednoteni za odstotek apoptotičnih celic. Štiri diapozitivna polja so bila naključno pregledana z 200-kratno povečavo. Skupno je bilo v vsakem polju preštetih 100 celic.

3.7. Merjenje aktivnosti antioksidantnih encimov

Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) in katalaze (CAT) smo izmerili s komercialnimi kompleti (SOD: A001-3- 1 in CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, Kitajska) s spektrofotometrom (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Združene države). Po navodilih proizvajalca smo operacijo zaključili in izmerili koncentracijo beljakovin z metodo bicinhoninske kisline (Pierce, Rockford, Združene države) z govejim serumskim albuminom (BSA) kot standardom (34).

3.8. Merjenje vsebnosti adenozin 5'-trifosfata

Vsebnost ATP v srčnem tkivu je bila izmerjena s kompletom za testiranje ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Kitajska). Po navodilih proizvajalca smo lizat dodali v razmerju glede na maso tkiva, homogenizirali s steklenim homogenizatorjem in nato centrifugirali pri 4 stopinjah 12000 g. Supernatant je bil vzet in vsebnost ATP v vsakem vzorcu je bila odkrita z luminometrom (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, ZDA) BCA kit (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Kitajska). Za določitev koncentracije beljakovin in nato pretvorbo koncentracije ATP v nmol/g beljakovin smo uporabili metodo bicinhoninske kisline.

3.9. Transmisijska elektronska mikroskopija

Srčno apikalno tkivo smo razrezali na približno 1 mm × 1 mm × 1 mm majhne koščke in nato fiksirali v glutaraldehid fosfatnem pufru pri 4 stopinjah. Po rutinski dehidraciji, namakanju, vdelavi in ​​obarvanju so bili izdelani ultratanki rezi 50 - 70 nm. Ultrastrukturo srčnega tkiva smo opazovali pod transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) in fotografirali (H600 Hitachi, Tokio, Japonska). Posamezni mitohondriji in miofilamenti so bili preslikani pod pogojem 10000-kratne povečave s programsko opremo Image J različice 1.80 (National Institutes of Health), njihova območja pa so bila izmerjena iz vsakega srca (35). Medtem so bili identificirani mitohondrijski fragmenti < 1 µm3, ki niso bili razdeljeni (običajno okrogli), in povprečni odstotek mitohondrijskih fragmentov v vidnem polju je bil preštet z uporabo indeksa mitohondrijske fragmentacije (MFI).

3.10. Mitohondrijska izolacija

Mitohondrije smo izolirali pri 4 stopinjah z diferencialnim centrifugiranjem s kompletom za izolacijo mitohondrijev (Beyotime Biotechnology, Šanghaj, Kitajska). Na kratko, sveže srčno tkivo smo razrezali na koščke tkiva in centrifugirali z 10 volumni predhodno ohlajenega PBS, supernatant smo zavrgli, oborino 20 minut prebavili s tripsinom, dodali izolacijski pufer A centrifugirali, supernatant prenesli v drugo epruveto, ponovno centrifugirali in oborjena frakcija so bili izolirani mitohondriji. Končno srčno mitohondrijsko peleto smo resuspendirali v homogenizacijskem pufru, shranili na ledu in uporabili za poskuse mitohondrijske funkcije dihanja v 4 urah.

3.11. Merjenje mitohondrijske porabe kisika

Mitohondrijsko porabo kisika smo izmerili s kisikovo elektrodo tipa Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, Združeno kraljestvo) v mitohondrijskem pufru za dihanje. Piruvat (5 mM) in malat (5 mM) sta bila uporabljena kot substrat za mitohondrije, ki vsebujejo kompleks I, pri končni koncentraciji 500 µg proteina/mL. Z ADP stimulirano porabo kisika (dihanje v stanju 3) smo merili v prisotnosti 200 µM ADP in spremljali od ADP neodvisno porabo kisika (dihanje v 4. stanju). Respiratorno kontrolno razmerje (RCR, stanje 3 deljeno s stanjem 4) odraža porabo kisika s fosforilacijo (spajanje). Postopki so se nadaljevali, kot je opisano prej (36).

3.12. Western blot analiza

Vzorec srčnega tkiva je bil pobran in shranjen pri -80 stopinjah. Zamrznjena srčna tkiva levega prekata so bila homogenizirana v ledeno mrzlem pufru za lizo RIPA (Beyotime Inc., Šanghaj, Kitajska P0013B). Koncentracije beljakovin so bile kvantificirane z uporabo kompleta za analizo beljakovin BCA (Beyotime Inc., Šanghaj, Kitajska P0006C). Vzorci, ki so vsebovali celotne beljakovine, so bili ločeni z 10 odstotki (w/v) SDS-PAGE in preneseni na PVDF membrano (Millipore, Bedford, MA, Združene države). Uporabljena so bila naslednja protitelesa: Protitelesa za GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16) }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) in BAX (1.1000,509599-2-Ig) so bili kupljeni pri Proteintechu (WuHan, Kitajska), BCL2 (1: 2000, sc-7382) in DRP1 (1:1000, sc-271583) sta bila kupljena pri Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) in PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, Združeno kraljestvo). Sekundarno protitelo (kozji anti-kunčji IgG, označen s hrenovo peroksidazo) je bilo iz družbe Beyotime Corporation (Šanghaj, Kitajska). Intenzivnost proteinskih pasov je bila kvantificirana z uporabo Fluor Chem Chemiluminescence gel sistema za slikanje (Protein Simple, ZDA). Optično gostoto proteinskih pasov smo analizirali s programsko opremo Image J, različica 1.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Model hipoksičnega kardiomiocita

Neonatalne podganje kardiomiocite (NRMC) smo izolirali in gojili s standardnimi metodami, kot je opisano prej (32). Na kratko, srca tridnevnih neonatalnih podgan so bila ekstrahirana, zmleta, kultivirana in nato prebavljena v 0.25 % tripsina in 0.02 % EDTA (Beyotime Biotechnology, Šanghaj, Kitajska). Po centrifugiranju smo oborino prenesli v DMEM, dopolnjen z 10 odstotki fetalnega telečjega seruma (Biolot, Rusija) in inkubirali v vlažnem zraku, ki je vseboval 5 odstotkov 2. Tri dni po zasejanju smo celice dali v stekleno hipoksično komoro (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY) in napolnjena z dušikom 8 minut, da se izprazni preostali kisik. Ti kardiomiociti so bili naključno razdeljeni v naslednje skupine: (1) kontrolna skupina (kontrola), celice, gojene v normalnih pogojih inkubacije; (2) skupina hipoksije (Hpx), celice, dane v hipoksično komoro za 24 ur in nato normalno gojene 24 ur; (3) Skupina Hpx-Spd, celice, postavljene v hipoksično komoro in inkubirane z 10 µmol/L SPD 24 ur; (4) Skupina Hpx-SpdDFMO, celice, postavljene v hipoksično komoro in inkubirane z 10 µmol/L SPD plus 2 mmol/L DFMO 24 ur.

3.14. Merjenje reaktivnih kisikovih vrst

Nastajanje ROS je bilo izmerjeno s testom obarvanja z dihidroetidijem (DHE) (kat. št. S0063, Beyotime, Kitajska). Na kratko, primarne kardiomiocite inkubiramo s 5 µmol/L DHE pri 37 stopinjah 30 minut, speremo s PBS in jih nato premaknemo pod mikroskop, da opazujemo spremembe v intenzivnosti fluorescence. Slike so bile posnete s fluorescenčnim mikroskopom Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japonska) pri valovni dolžini vzbujanja 535 nm, največja valovna dolžina emisije pa je bila 610 nm, n> 20 celic na skupino.

3.15. Določanje mitohondrijskega membranskega potenciala

Barvilo tetrametilrodamin etil ester (TMRE) je pozitivno nabito in se lahko selektivno nahaja v mitohondrijih. Široko se uporablja za določanje potenciala mitohondrijske membrane (∆Ψm). Skratka, delovno raztopino za barvanje s TMRE v koncentraciji 200 µmol/L smo dodali združenim obdelanim kardiomiocitom, temeljito premešali in postavili v celični inkubator pri 37 stopinjah za 20 minut. Supernatant smo aspirirali in celice sprali s PBS ter jih premaknili v invertni mikroskop, da bi opazovali spremembo intenzitete fluorescence. Valovna dolžina vzbujanja je bila 549 nm, emisijska svetloba pa 579 nm. Intenzivnost rdeče fluorescence je pokazala spremembo ∆Ψm, n > 20 celic na skupino.

3.16. Eksperiment mitohondrijske in lizosomske lokalizacije

V skladu z navodili sta Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Kitajska) in Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, Kitajska) uporabila analizo mitohondrijske in lizosomske kolokalizacije. NRCM smo naložili z 200 nM MitoTracker Green FM in 50 nM LysoTracker Red v HBSS 30 minut pred poskusi, celice smo sprali s PBS in nato dobili celične slike s fluorescenčnim mikroskopom Olympus FluoView FV1000. Laserska linija 488 nm je bila uporabljena za vzbujanje fluorescence MitoTracker Green, izmerjene med 505 in 515 nm. Za LysoTracker Red je bila uporabljena laserska linija 577 nm z meritvijo 590 nm. Prekrivanje intenzivnosti rdečih in zelenih slikovnih pik je bilo določeno s programsko opremo za kvantifikacijo na mikroskopu Nikon Eclipse, n > 20 celic na skupino.

3.17. Statistična analiza

Vse podatke iz eksperimentalnih skupin smo primerjali z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Bonferronijev post hoc test s programsko opremo GraphPad Prism različice 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) in programske opreme SPSS različice 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United države). Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SEM, stopnja pomembnosti pa je bila nastavljena na P < 0.05.

4. Rezultati

4.1. Potomci in značilnosti srca

Izmerili smo telesno težo (TT) in težo srca (TW) ter izračunali razmerje TW/TT (TW/TT) (slika 1). Rezultati so pokazali, da sta se TW in TW novorojenih podgan zmanjšala, HW/TT pa povečala zaradi intrauterine hipoksije. V primerjavi s skupino IUH sta se telesna masa in telesna teža neonatalnih podgan v skupini SPD povečala (P < 0.05), telesna teža/telesna masa pa se je zmanjšala (P < 0). 05); V primerjavi s skupino, ki je prejemala SPD, sta se TW in HW v skupini, zdravljeni z DFMO, zmanjšali (P <0,05), TW/TT pa se je znatno povečalo (P <0,05).

4.2. Učinki SPD na morfološko strukturo miokarda, celično proliferacijo in fibrozo pri novorojenčkih, izpostavljenih

Rezultati obarvanja srca s HE so pokazali, da so srca enodnevnih potomcev, izpostavljenih IUH, pokazala oteklino in ohlapno razporejena miokardna vlakna. Vendar pa so srca IUH, zdravljena s SPD, ohranila sprejemljivo strukturo miokardnega tkiva (slika 2A). Nato smo ovrednotili število binuklearnih kardiomiocitov s tkivno rezino, obarvano s HE; število binuklearnih kardiomiocitov je bilo večje v skupini IUH kot v kontrolni skupini (P < 0.05). V primerjavi s skupino IUH se je delež binuklearnih kardiomiocitov v skupini zdravljenja SPD znatno zmanjšal (P < 0.05); DFMO je oslabil učinek SPD (P < 0.05) (slika 2C). Nadalje smo odkrili ekspresijo Ki67 (označevalec celične proliferacije) v miokardu podgan z metodo imunofluorescence. Višja kot je ekspresija Ki67, močnejša je rožnata fluorescenca z združitvijo rdeče in modre (slika 2E). Rezultati so pokazali, da se je v primerjavi s kontrolno skupino izražanje Ki67 v skupini IUH znatno zmanjšalo (P < 0.05), izražanje Ki67 pa se je po dajanju SPD znatno povečalo (P < { {28}}.05), učinek SPD pa je odpravil DFMO (P <0,05) (slika 2F). Ti rezultati kažejo, da lahko SPD zavre prezgodnji umik kardiomiocitov iz celičnega cikla, ki ga povzroča IUH, in spodbuja proliferacijo kardiomiocitov pri novih potomcih, izpostavljenih IUH. Nato smo uporabili Massonovo barvanje za odkrivanje sprememb v vsebnosti kolagena v miokardu in ocenili fibrozo miokarda z merjenjem površine kolagena (slika 2BandD). Ugotovili smo, da se je odlaganje miokardnega kolagena v srcih novorojenih podgan, izpostavljenih IUH, povečalo (P < 0,05), katerega raven je bila višja v primerjavi s kontrolno skupino. Nasprotno, območje miokardne fibroze po zdravljenju s SPD se je znatno zmanjšalo (P <0, 05). Vendar se je v primerjavi s skupino, zdravljeno s SPD, območje fibroze znatno povečalo v skupini HpxSpd-DFMO (P <0,05).

4.3. Učinki spermidina na mitohondrijsko strukturo miokarda, dihalno funkcijo in vsebnost adenozin 5'-trifosfata pri novorojenčkih, izpostavljenih intrauterini hipoksiji

Ultrastrukturne spremembe strukture srčnega tkiva in značilnosti mitohondrijev so bile analizirane s TEM (slika 3A). Programska oprema Image J je bila uporabljena za kvantificiranje odstotka vsebnosti mitohondrijev (območje mitohondrijev v celotnem območju celice) in območje mitohondrijev (sliki 3B in C). Rezultati so pokazali, da so bili v kontrolni skupini miokardni miofilamenti urejeni, struktura sarkomer čista, mitohondriji kompaktni, matriks gostejši, mitohondrijske kriste urejene. Vendar so mitohondriji nabreknili, pri nekaterih kardiomiocitih skupine IUH pa so opazili rahljanje matriksa in zmanjšano gostoto. V primerjavi s kontrolno skupino sta se zmanjšala delež mitohondrijev v kardiomiocitih in površina mitohondrijev (P < 0.05). Vendar pa so bili v srcih podgan pri zdravljenju s SPD miokardni miofilamenti čisti, struktura sarkomera je bila jasna, mitohondrijski matriks je bil kompakten in mitohondrijsko otekanje se je zmanjšalo. V primerjavi s skupino IUH se je povečal delež mitohondrijev v kardiomiocitih (P < 0.05), povečala pa se je tudi površina mitohondrijev (P < 0,05). DFMO je zaviral te učinke, ki jih povzroča SPD (P <0,05).

Uporabili smo piruvat/malat kot substrat za ovrednotenje mitohondrijske respiratorne funkcije, vključno s stopnjama dihanja 3 in 4 ter RCR (slika 3D - F). Opazili smo, da so bili v primerjavi s kontrolno skupino frekvenca dihanja v stanjih 3 in 4 ter RCR skupine IUH bistveno nižji (P < 0.{{10}}5). Zanimivo je, da se je RCR stanj 3 in 4 obnovil po zdravljenju s SPD (P < 0.05). Nasprotno pa so bili ti učinki SPD znatno zavrti v skupini, zdravljeni z DFMO (P < 0,05). Podobno se je v primerjavi s kontrolno skupino vsebnost miokardnega ATP v skupini IUH pomembno zmanjšala (P <0,05). V primerjavi s skupino IUH se je vsebnost ATP izjemno povečala v skupini, zdravljeni s SPD (P <0,05), DFMO pa je oslabil učinke SPD (P <0,05) (slika 3G). Te ugotovitve kažejo, da lahko SPD zaščiti miokardno mitohondrijsko strukturo in poškodbe funkcij ter prepreči upad ravni ATP pri neonatalnih potomcih podgan, izpostavljenih IUH.

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】