Strukturna zasnova, sinteza in antioksidant, antileishmania, protivnetno in protirakavo delovanje novega acetiliranega derivata kvercetina

Za več informacij. kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Povzetek: Kvercetin(Q) je bioflavonoid z biološkim potencialom; vendar pa slaba topnost v vodi, obsežna encimska presnova in zmanjšana biološka uporabnost omejujejo njegovo biofarmakološko uporabo. Namen te študije je bil izvesti strukturno modifikacijo pri acetilaciji Qby, s čimer bi pridobili analog kvercetin pentaacetata (Q5), da bi raziskali biološke potenciale (antioksidativne, antileishmanične, protivnetne in citotoksične aktivnosti) v celičnih kulturah. Q5 smo karakterizirali s spektri FTIR, 'H in 13C NMR. Theantioksidantpotencial je bil ocenjen glede na radikal ABTS· plus. Protivnetni potencial je bil ovrednoten z merjenjem provnetnega citokinskega faktorja tumorske nekroze (TNF) in proizvodnje dušikovega oksida (NO) v peritonealnih makrofagih miši BALB/c. Testi citotoksičnosti so bili izvedeni z uporabo metode AlamarBlue v rakavih celicah HepG2 (človeški hepatokarcinom), HL-60 (promielocitna levkemija) in MCR-5 (zdravi človeški pljučni fibroblasti) ter z metodo MTT za celice C6 kulture (podganji gliom). Q in Q5 sta pokazala antioksidativno aktivnost 29 odstotkov oziroma 18 odstotkov, kar je utemeljeno z zamenjavo hidroksilnih skupin z acetilnimi skupinami. Q in Q5 sta pokazala od koncentracije odvisno zmanjšanje proizvodnje NO in TNF (str<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM). Končno je bila potrjena citotoksična superiornost Q5 （IC50=11 μM）, ki je pri 50 μM 24 ur povzročil spremembe v morfologiji celic glioma C6, za katere je značilna okrogla oblika telesa (o čemer še ni poročila v literaturi ). Analog Q5 je imel potencialne biološke učinke in je lahko obetaven za nadaljnje preiskave proti drugim celičnim kulturam, zlasti nevralnim.

Ključne besede: kvercetin; sinteza; kvercetin pentaacetat; antioksidant; antilejšmanija; protivnetno;citotoksično delovanje

Kliknite, če želite izvedeti več o izdelkih

1. Uvod

Kvercetinje bioflavonoid z dokazanim vplivom na zdravje in dobro dokumentiranimi biokemičnimi aktivnostmi. Ta spojina velja za enega najmočnejših antioksidantov med polifenoli [1-3]. Zaradi svojih lastnosti je bil kvercetin testiran za različne terapevtske aplikacije, kot nprantioksidant, antiparazitsko,protivnetnoin dejavnosti proti raku [4,5]. Pri parazitskih boleznih so flavonoidi zelo zanimiva skupina. To je posledica njihove nizke toksičnosti pri gostiteljih in več mehanizmov, s katerimi lahko modulirajo patološko spremenjene procese med okužbami [6].Flavonoidiimajo več tarč za zdravljenje lišmanioze in vključujejo tarče, kot so arginaza, ribonukleotid reduktaza in topoizomeraza II [7,8].

Kvercetinima številne protirakave aktivnosti pri več vrstah solidnih tumorjev. Poleg tega je bilo dokazano, da deluje v celicah HL-60 (ki izvirajo iz akutne mieloične levkemije (AML)), da znatno zmanjša rast tumorja z zmanjšanjem intratumorskega oksidativnega stresa, aktivacijo signala zunajcelične regulirane kinaze (ERK) in kasnejša apoptoza [9]. Kvercetin je izboljšal vnetni odziv z zmanjšanjem izražanja IL-6 in TNF s pozitivnim protivnetnim delovanjem v človeških populacijah makrofagov THP1 [10].

Med različnimi vrstami raka je gliom eden najbolj agresivnih in s slabo prognozo. Na žalost glavne terapije (kirurška odstranitev, obsevanje in kemoterapija) niso učinkovite. Povprečno skupno preživetje bolnikov ostaja približno 14 mesecev [11]. Kljub temu so nove spojine, kot so temozolomid [12], retinoidi [13] in flavonoidi [14], pokazale delovanje proti gliomu. Protitumorski učinki kvercetina so bili opisani proti celicam glioblastoma, ki je najbolj agresiven gliom [15].

Nenormalni imunski odzivi so vključeni v nastanek in razvoj velikega števila bolezni, vključno z avtoimunskimi boleznimi, alergijami, rakom in nevrodegenerativnimi boleznimi.Flavonoidiimajo potencialno imunomodulatorno delovanje in se proučujejo kot alternative za klinično uporabo. Kvercetin ima lahko pomembne imunomodulatorne učinke na celično proizvodnjo citokinov, pridobljenih iz profila Th-1 in Th-2, ter limfocitno proliferacijo, ki uravnava celično imunost [16]. Poleg tega lahko kvercetin različno modulira ekspresijo genov za interlevkin v mononuklearnih celicah periferne krvi (PBMC), kar daje prednost profilu Th-1, ki spodbuja celično imunost z interferonom gama (IFN-y), zmanjšanjem Th{ {6}} profil, vključen v humoralno imunost in aktivacijo makrofagov z IL-4 [17].

Nizka topnost v vodi, obsežna presnova in encimska razgradnja omejujejo biološko uporabnost in zmanjšujejo biofarmakološko uporabo kvercetina kot terapevtskega sredstva [13]. Zanimiv pristop za premagovanje nizke biološke uporabnosti polifenolov, da bi testirali in raziskali njihovo aktivnost in vivo, je kemična modifikacija naravne spojine, povečanje topnosti in upočasnitev presnove. Tako se preučujejo številne sintetične poti, kot so acetilacija, dodajanje aminov in bromiranje, modifikacija v oksime in kompleksiranje s hidrazini [18-20].

V tej študiji izvajamo strukturno modifikacijo kvercetina, s ciljem pridobiti analog kvercetin pentaacetata (Q5) za oceno antioksidativnega potenciala, protivnetnega delovanja in zaviranja rasti rakavih celic, hepatokarcinoma (HepG2), promielocitne levkemije. (HL-60) in celice podganjega glioma (C6).

2. Rezultati in razprava

2.1.Sinteza in karakterizacija

Za sintezo analoga kvercetina (3,3', A',5,7-pentaacetat) je bil uporabljen pristop totalne acetilacije, ki je bil prilagojen eksperimentalnim pogojem, ki jih najdemo v literaturi [21]. Na ta način se ohrani anhidrid ocetne kisline kot sredstvo za aciliranje in piridin kot katalizator.

Za dobljeni produkt (Q5), rumeno trdno snov, je značilno, da ima tališča v območju 178-186 stopinj, kar je združljivo z literaturnimi podatki [18]. Poleg tega je primerjalna analiza FTIR med kvercetinom in izdelkom pokazala odsotnost absorpcijskih pasov pri 3400 cm-1, ki so značilni za hidroksile kvercetina, in s pojavom pasov okoli 1600-1650 cm-'indikativnih za karbonil ester , ki prikazuje zamenjavo hidroksilnih skupin z acetilnimi skupinami: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,837,691 in 600 (Slika 1). Spektre smo primerjali s tistimi, ki so opisani v literaturi [21].

Analize z jedrsko magnetno resonanco (NMR) kvercetina (Q) in dobljenega produkta (Q5) so pokazale popolno acetilacijo z izginotjem singletov, značilnih za hidroksile nad 9 ppm v H NMR spektru (dodatne slike S1, S2 in S{ {4}}S6) in pojav velikih in značilnih signalov metila v alifatskih območjih spektra, med 2 in 3 ppm. Za 13C NMR spekter (dopolnilni sliki S3 in S7-S9) je dobljeni produkt pokazal povečanje reprezentativnih signalov estrskih karbonilov blizu 170 ppm in pojav signalov med 20 in 21 ppm, ki ustrezajo kemični premiki petih alifatskih ogljikov metilov, preverjeni z integracijo signalov. Spektre smo primerjali s tistimi, ki so opisani v literaturi [22].

Biasutto et al. [23] so bili pionirji v raziskovanju prekurzorjev na osnovi estrov, da bi povečali biološko uporabnost kvercetina. Na podlagi svojih študij sta Mattarei et al. [21] so pospešili celotno acetilacijo kvercetina in pridobili derivat Q5 z visokim izkoristkom (79-97 odstotkov). Nedavno so Mohajeri et al. [24] so dobili 85-odstotni izkoristek pri pridobivanju analoga Q5 pri segrevanju (180 stopinj 6 ur). V tej študiji je bila sinteza Q5 učinkovita in dobili smo eno spojino, ustrezno karakterizirano v skladu s podatki, opisanimi v literaturi.

2.2. Antioksidant ABTS· plus radikalna aktivnost

Primerjalna analiza antioksidativne aktivnosti Q in Q5 je pokazala, da je bil kvercetin (Q) bolj aktiven pri odstranjevanju radikala ABTS* plus kot O5 (29 odstotkov oziroma 18 odstotkov), z vrednostmi IC50 (v μM) 188,850±0,003 oziroma 379,560± 0,004 za Q oziroma Q5.

Antioksidativno delovanje flavonoidov je neposredno povezano z njihovo molekularno strukturo. Obstajata dva mehanizma, prek katerih lahko fenolne spojine izvajajo svoje antioksidativne funkcije: prenos atoma vodika in darovanje elektronov [25]. Izjemno antioksidativno delovanje kvercetina lahko pripišemo pomembnemu prispevku hidroksilnih skupin in njihovih vodikov, ki so v analogu Q5 nadomeščeni z acetili, s čimer se zmanjša sposobnost za doniranje vodika ali lovljenje prostih radikalov s sintetičnimi molekulami.

V znanstveni literaturi ni podatkov o antioksidativnem delovanju spojine Q5. Oh, et al. [26] so ovrednotili pripravke estra kvercetina in njihove antioksidativne aktivnosti, kar je pokazalo, da ima kvercetin najvišjo aktivnost odstranjevanja radikalov med testiranimi vzorci. Zato je bistven visok prispevek hidroksilnih skupin k antioksidativni aktivnosti kvercetina [27].

2.3.Antileishmania Actioity

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM v primerjavi z amfotericinom B （IC501,1 μM±0,1）. Poleg tega so ovrednotili učinke Q5 na promastigotne oblike L. amazonenses in ta spojina je pokazala nižjo vrednost IC50 （75,1 ± 4,7 μM） za to vrsto v primerjavi z L. braziliensis.

Tasdemir et al. [8] so primerjali antitripanosomske in antileishmanijeve aktivnosti flavonoidov in njihovih analogov (pridobljenih iz kvercetina) in ugotovili, da so močna in učinkovita antiprotozoalna sredstva proti amastigotnim oblikam L donovani (IC50=1.0ug mL). -l). Za promastigotne oblike L. amazonensis, Fonseca in Silva et al.[27] našli IC50=31.4 uM v kulturah, obdelanih s kvercetinom v 48 urah. Poleg tega so poročali o popolni zaustavitvi celične rasti s 96 μM kvercetina v 96 urah, kar je pokazalo zadovoljivo antileishmanial-dal aktivnost. Cataneo et al. [28]ocenjevali antipromastigotni učinek kvercetina (do 192 μM） proti L.brasiliensis v peritonealnih celicah makrofagov. V promastigotnih kulturah L. major sta kvercetin in njegov analog kvercetin-pentaacetat pokazala učinek, odvisen od koncentracije (IC). 50 =2.5±0.92 oziroma 2.85±0.99 μM 【24】.

Nekateri avtorji so pokazali, da kvercetin inducira smrt promastigotov L ​​amazonensis z disfunkcijo mitohondrijske membrane, ki je posledica proizvodnje reaktivnih kisikovih vrst [27,28] in drugih tarč, kot so arginaza [7], ribonukleotidna reduktaza [8,29] in topoizomeraza II[30]. Rezultati, dobljeni v tej študiji, kažejo, da je treba druge teste obravnavati v perspektivi za testirane spojine (Q in Q5), upoštevajoč teste in silico za preiskavo tarč, ki so lahko vključene v opazovane mehanizme smrti.

2.4. Protivnetne in citotoksične aktivnosti

Nato smo se osredotočili na vrednotenje biološke aktivnosti novega derivata. Najprej so bile določene netoksične koncentracije Q in Q5 v peritonealnih makrofagih, pridobljenih iz miši BALB/c. Vrednosti CCs0 niso pokazale citotoksičnosti pri koncentracijah, enakih ali manjših od 80 μM （slika 2A, D）. Deksametazon ni bil citotoksičen pri testirani koncentraciji （20 µM）. Na podlagi tega so bili naslednji testi izvedeni pri koncentracijah, ki niso presegale 80 μM.

Imunomodulatorno aktivnost Q in Q5 so raziskali, da bi določili učinke spojin na izločanje vnetnega mediatorja. Imunomodulatorne učinke spojin (Q in Q5) so sprva ovrednotili v kulturah peritonealnih makrofagov s proizvodnjo dušikovega oksida. Kot je bilo pričakovano, je aktivacija makrofagov z LPS PLUS IFNy povečala količino proizvodnje nitritov (slika 2B, E). Zdravljenje s kvercetinom je v odvisnosti od koncentracije zaviralo nastajanje nitrita (p<>

Pentadaktilna spojina （Q5） ni pokazala podobne aktivnosti pri 20 μM. Zanimivo je, da je bila aktivnost pomembna pri najvišjih testiranih koncentracijah (40 in 80 μM) za obe spojini. Pri najvišji testirani koncentraciji (80 uM) so bili učinki spojin podobni tistim, ki so jih opazili pri kulturah aktiviranih makrofagov in obdelanih z 20 µM deksametazona. Spojine niso bile citotoksične za peritonealne makrofage pri testiranih koncentracijah （20, 40 in 80 µM）.

Za boljšo karakterizacijoprotivnetnoučinek spojin (O in O5) je bil vnetni citokin TNF kvantificiran z metodo encimsko vezanega imunskega testa (ELISA). Stimulacija makrofagov z uporabo LPS in INF-y je povzročila izrazito povečanje proizvodnje TNF. Zdravljenje z Q in Q5 je pomembno zmanjšalo nastajanje TNF (str<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Zmanjšanje vnetnih dejavnikov s kvercetinom je različno opisano, vključno z modulacijo za Th-2 vnetne profile, povezane z zaščito pri nevralnih boleznih [31,32]. Protivnetno delovanje kvercetina je dobro opisano v literaturi [33,34]. Vendar pa je malo študij, ki dokazujejo protivnetni potencial analoga O5. Ta študija potrjuje ugotovitve Chen et al. [35], ki je dokazal vlogo Q in O5 pri zaviranju proizvodnje NO, induciranega z LPS, na način, odvisen od koncentracije, brez škodljivih citotoksičnih učinkov za linijo makrofagov RAW 264.7. Poleg tega je ta študija pokazala učinek Q5 brez primere pri zaviranju vnetnega citokina TNF.

Dobljeni podatki kažejo na ohranitev učinkov na polsintetično molekulo (O5); vendar je lahko odmerjanje drugih dejavnikov, kot je citokin IL-10, perspektiva pri vrednotenju teh profilov. Zato lahko Q5 štejemo za potencialno molekulo za prihodnje in vitro in in vivo teste, katerih cilj je dodatna terapevtska alternativa s protivnetnim delovanjem.

Citotoksičnost testiranih spojin (Q in Q5) je bila ovrednotena pri 20, 40 in 80 uM z uporabo kolorimetrične metode AlamarBlue v zdravi celični liniji (MRC-5, človeški pljučni fibroblasti) in v dveh različnih rakavih celičnih linijah , HepG2 (človeški hepatocelularni karcinom) in HL-60 (človeška promielocitna levkemija), kot je prikazano na sliki 3. Doksorubicin je bilo standardno zdravilo, uporabljeno kot pozitivna kontrola.

Kot je prikazano na sliki 3, za celice HepG2 kvercetin (Q) ni pokazal pomembne citotoksične aktivnosti pri najvišji raziskani koncentraciji（80 μM）, njegov analog pentaacetata （Q5） pa je pokazal zmanjšano aktivnost （IC{{4 }}.9 μM）. Za rakavo celično linijo HL-60 se je pokazalo, da kvercetin ni zelo aktiven (IC50=51.3 uM); zanimivo pa je, da je bil Q5 bistveno bolj aktiven kot kvercetin z IC50 33,6 uM. Standardno zdravilo doksorubicin je imelo vrednosti IC50 v razponu od 0,1 do 0,2 uM za rakave celične linije, ki kažejo pomembne citotoksične učinke na zdravo celično linijo MRC-5(tabela 1), kar ni bilo opaženo pri spojinah (Q in Q5) .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, kar kaže selektivni profil proti rakavi celični liniji. Nekaj ​​študij je pokazalo delovanje analoga kvercetina O5 v rakavih celičnih linijah. Vendar pa so aktivnost Q5 v liniji tumorskih celic HeLa dokumentirali Danihelovået al. [22], ki je pokazala, da so acetilirani estri kvercetina najučinkovitejši citotoksični derivati. Podatkov o citotoksični vlogi Q5 v celicah linije HepG2 ni bilo. V literaturi je bila najdena samo ena študija, ki je razkrila, da ima tetraacetilirani analog kvercetina pomemben učinek na inhibicijo celic linije HL-60 z aktivacijo kaspaze-3, ki spodbuja apoptozo [36].

Za dostop do citotoksičnosti v celični kulturi C6 je bila uporabljena kolorimetrična metoda MTT. Kvercetin in Q5 sta povzročila zmanjšanje absorbance MTT pri 57{{10}} nm, kar predstavlja aktivnost mitohondrijske dehidrogenaze in kaže na zmanjšanje viabilnosti celic v celicah C6. Kot je prikazano na sliki 4, je s kvercetinom povzročena citotoksičnost v celicah C6 v koncentracijah, višjih od 25 uM za 72 ur (slika 4A), medtem ko je 0.78 μM Q5 za 72 ur zmanjšalo sposobnost preživetja celic (slika 4B). ). Ugotovljeno je bilo, da je 50 uM kvercetina(O) in O5 zmanjšalo viabilnost celic na 41,3 odstotka ± 2,9 odstotka oziroma 47,5 odstotka ±1,2 odstotka v primerjavi s kontrolno skupino (100,0 odstotka ±6,4 odstotka) (slika 4A, B) . V kulturah C6, obdelanih z DMSO (0,05 odstotka), v primerjavi z neobdelanimi celicami niso opazili pomembnih sprememb v viabilnosti celic.

Na podlagi dobljenih rezultatov smo nato z optično mikroskopijo raziskali morfološke učinke spojin Q in Q5 （50 μM） na celice C6 po 24, 48 in 72 urah zdravljenja. Kvercetin pentaacetat（Q5） pri 50 μM je povzročil spremembe v morfologiji celic glioma C6 v prvih 24 urah z vidnim zmanjšanjem citoplazemskih podaljšanj v primerjavi s kontrolno skupino (slika 5). Po 48 urah zdravljenja s Q5 so celice prevzele zaokroženo morfologijo, za katero je značilna retrakcija celičnega telesa in brezoblična membrana (o čemer v znanstveni literaturi niso poročali), za razliko od kvercetina, ki je v tem času zdravljenja predstavljal morfološki vidik podobno kot fibroblasti [37]. Vse druge morfološke spremembe so bile vidne v celicah pod drugimi pogoji zdravljenja.

Hidroksilna substitucija z acetilnimi skupinami lahko spodbuja izboljšano celično absorpcijo analogov kvercetina, kar daje prednost različnim biološkim testom, zlasti v rakavih celicah [38,39]. Bispo da Silva et al. [40] so z obdelavo celic C6 s flavonoidoma rutinom in kvercetinom dokazali znatno zmanjšanje deleža adherentnih celic C6 s tanjšim in bipolarnim morfološkim fenotipom v primerjavi s kontrolnimi kulturami. Obdelava celic C6 s flavonoidi je po 24 urah zdravljenja zavirala migracijske lastnosti živih celic C6. V kontrolnih pogojih je mikroglija predstavljala okrogel fenotip; po zdravljenju z rutinom je več kot 50 odstotkov celic pridobilo razvejan, multipolarni fenotip, ostale pa so pridobile ameboidni fenotip, kar oboje kaže na aktivacijo.

Študije kažejo, da se kvercetin vmešava v regulacijo poti celične signalne transdukcije, povezane s celično smrtjo zaradi apoptoze, in v stopnjah napredovanja celičnega cikla [41,42]. Santos et al. [14] so pokazali potencialno zmanjšanje rasti GL-15 celic človeškega glioblastoma. Bi et al. [43] so vizualizirali indukcijo avtofagije celic človeškega glioblastoma U87 in U251 na način, odvisen od odmerka.

Dobljeni rezultati potrjujejo Danihelova et al. [22], v katerem so acetilne skupine, vstavljene v molekulo kvercetina, spodbujale izboljšanje delovanja proti raku. Poleg tega so pokazali večji tropizem za rakave celice, zlasti za celice živčnih linij. Ta študija je brez primere v zvezi z analogom O5 pri zdravljenju celic glioma C6. Dell'Albani idr. [44] so pokazali boljše delovanje acilnih derivatov kvercetina v kulturah sevov človeškega glioma U373-MG in mišjega glioma 9L, kar kaže na poti smrti zaradi apoptoze. Sprememba celične morfologije v zaokrožen profil se lahko nanaša na mehanizme smrti, kot je apoptoza, ki jo na splošno pripisujejo kvercetinu [45-47]. V prihodnjih perspektivah lahko testi z zdravimi živčnimi celicami pomagajo razjasniti to hipotezo.

3. Materiali in metode

3.1. Reagenti in materiali

Vsi reagenti (kvercetin, piridin, anhidrid ocetne kisline, trikoloroizocianurna kislina, diklorometan, 2,4-dinitro-fenilhidrazin, hidroksilamin hidroklorid, natrijev acetat, petrolej eter, žveplova kislina, kalijev persulfat in nitrat) so bili analitske kakovosti in komercialno dostopni (Ouimex, Merck, Brazilija in Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Za pripravo vseh standardnih raztopin in vzorcev je bila uporabljena ultra čista voda (z upornostjo 18 MOcm-I), pridobljena iz sistema za čiščenje vode Milli-Q Plus (Millipore, Molsheim, Francija). Vsa laboratorijska steklena posoda je bila oprana v 10-odstotnem （ o/ø） raztopino HNO3 24 ur, speremo z vodo visoke čistosti in posušimo pri sobni temperaturi.

3.2. Sinteza in karakterizacija

Strukturni analog je bil pridobljen pokvercetinmolekularne modifikacije iz bolj dostopne in ponovljive sintetične poti (Penta acetilacija). Uporabili smo načela zelene kemije z zmanjševanjem uporabe snovi. Pentadaktilni analog (Q5) je bil pridobljen po molekularni modifikaciji kvercetina, po sintetični poti, ki uporablja anhidrid ocetne kisline kot sredstvo za aciliranje in piridin kot katalizator.

Zmes, ki je vsebovala kvercetin (300 mg, 1 npr.), anhidrid ocetne kisline (0,80 ml, 20 npr.) in piridin (7,5 ml), smo hranili pri magnetnem mešanju pri sobni temperaturi. Po 24 urah mešanja smo reakcijskemu mediju dodali 250 mL diklorometana. Nato smo reakcijo sprali z 10-odstotno HCl (3 × 100 ml), razredčenim NaOH (3 × 50 ml) in vodo (3 × 100 ml); posušen nad brezvodnim natrijevim sulfatom; filtriran; in uparjen v rotacijskem uparjalniku (Fisatom, Minas Gerais, Brazilija) [21]. Količina O5 in dobljeni izkoristek sta bila 280 mg oziroma 54 odstotkov.

Reakcijo strukturne modifikacije molekule kvercetina smo spremljali s tankoplastno kromatografijo (TLC) z uporabo zmesi heksana in etil acetata (1:1) kot topil. Za fizikalno-kemijsko karakterizacijo je bilo uporabljeno tališče. Infrardeči testi s Fourierjevo transformacijo (FTIR) z metodo oslabljenega popolnega odboja (ATR) so bili izvedeni z modelom FTIR Spectrum 100S (Perkin Elmer, Waltham, MA, ZDA), s pridobivanjem skenirajočih spektrov v srednjem infrardečem območju (4000 do 600 cm-1).

Vzorec (masa~5.0 mg) smo položili na kristal ATR in ga s pomočjo ročne mehanske stiskalnice izpostavili tlaku približno 20 N. Spektre FTIR je sledila programska oprema OriginPro8, OriginLAB4 (www.originlab.com, dostopno 10. septembra 2021). Spektri jedrske magnetne resonance (NMR) so bili posneti v spektrometru Bruker Avance IⅢI500 MHz (Uster, Švica)-500 MHz za 1H NMR in 125 MHz za 13C NMR z uporabo DMSO kot topila. Kemični premiki so bili izraženi v ppm lestvici (ug/mL), kloroform (CHCa) pa je bil uporabljen kot interna referenca.

NMR spektri so bili obdelani s programsko opremo TopSpin⑤4.0 (Bruker Biospin, Coventry, UK) in primerjani z literaturnimi podatki [38]. Podatki NMR so bili: 'H NMR(500 MHz, CDCl3)2,34(6H,s,-OCOCH3);2,35(3H,s,-OCOCH3);2,35(3H,s, -OCOCH3); 2,44 (3 H, s, -OCOCH3); 6,88 (1H, d, J=2.5 Hz); 7,34 (1H, d, J=2.0 Hz);7,36(1H,d,J=8,5);7,70 （1Hd, J=2,0Hz）;7,73（1H,dd,J1=8,5 Hz,J 2=2.0Hz）;13CNMR（125 MHz, CDCl3）δ 170.04;169.24;167.86;167.79;156.87;154.28;150.43;144.40;142.22;127.78;126.42;124.01;123.01;123.01. ;113,89;108,96;21,16;21,02;20,65; in 20.49.

3.3. Antioksidant ABTS* plus radikalna aktivnost

Aktivnost sekvestracije ABTS* plus je bila prilagojena iz metode, ki sta jo opisala Dorman in Hiltunen[48]. Kalijev persulfat in ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) smo raztopili v destilirani vodi, da smo dobili končno koncentracijo 2,45 mM oziroma 7 mM. Raztopino ABTS smo proizvedli z dodajanjem obeh raztopin v razmerju 1:1 in nato raztopino inkubirali pri sobni temperaturi 16 ur v temi.

Nastalo raztopino, intenzivno obarvano, smo pred uporabo uravnali z etanolom v spektrofotometru na absorbanco {{0}}.7±0,05 nm pri 734 nm. Uporabili smo 30 μL vzorcev ali Trolox (Sigma Aldrich⑧, St. Louis, MO) kot referenčni standard pri različnih koncentracijah （5, 10, 25, 50, 75 in 100 μM）, ki smo jih dodali 3 ml raztopino ABTS* plus in počakajte, da reagira 6 minut. Absorbanco smo izmerili pri 734 nm proti slepemu vzorcu (etanol). Sposobnost čiščenja ABTS· plus je bila izračunana kot:

ABTS* plus učinek čiščenja (odstotki){{0}} (1- A0/A1)×100;

kjer je A0 absorbanca kontrole, A1 pa absorbanca vzorca ali standarda. Vse določitve so bile izvedene v treh izvodih. Vrednosti IC5so so bile izračunane in izražene kot povprečje ± SD v μM.

3.4.Antileishmania Actioity

Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125sev Leila) in Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456)promastigote (1 × 10 stopinj na vdolbino) so gojili v 96-plošči z vdolbinicami v Schneiderjev medij (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, ZDA), dopolnjen z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS; GIBCO) in 50 ug mL-' gentamicina (Life, Carlsbad, CA, ZDA) in obdelan z različnimi koncentracijami（ 100 μM; šest razredčitev 1∶2） Q5. Paraziti so bili inkubirani 72 ur pri 26 stopinjah. Nato je bilo v 2 urah dodanih 20 μL/jamico AlamarBlue （Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA）. Odčitavanje je bilo izvedeno v spektrofotometru z uporabo valovnih dolžin 570 in 600 nm. Izračun inhibicije aksenične kulture je bil določen na podlagi neobdelane kontrole [49].

3.5. Protivnetne in citotoksične aktivnosti

3.5.1.Droge

Deksametazon (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, ZDA), sintetični glukokortikoid, je bil uporabljen kot pozitivna kontrola v imunomodulacijskih testih. Doksorubicin (doksorubicinijev klorid, Laboratorij IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) je bil uporabljen kot referenčno zdravilo proti raku. Vse spojine smo raztopili v dimetil sulfoksidu (DMSO; PanReac, Barcelona, ​​Španija) in razredčili v mediju celične kulture za uporabo v testih. Končna koncentracija DMSO je bila v vseh poskusih manjša od 1 odstotka.

3.5.2.Živali

Miši BALB/c, stare 4-10 tednov, je zagotovil vivarij inštituta Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Brazilija), kjer so jih hranili v kletkah z največ petimi mišmi. Vse kletke so bile shranjene v aklimatizirani sobi pri 21 stopinjah ±1 stopinjah, v ciklu 12-h svetloba/tema, z vodo in hrano ad libitum v celotnem poskusnem obdobju. Poskuse z živalmi je odobril Odbor za etiko in uporabo živali Inštituta Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA (IGM-018/15).

3.5.3. Celice

Uporabljena sta bila HL-60(človeška akutna promielocitna levkemija) in HepG2 (človeški hepatocelularni karcinom) iz ameriške zbirke tipskih kultur – ATCC (Rockville, ML.ZDA). Za oceno selektivnosti kvercetina(O) in derivata O5 na proliferacijo nerakavih celic smo uporabili linijo MRC-5 (človeški pljučni fibroblast), prav tako pridobljeno iz ATCC. Celične linije smo gojili v celici steklenice za kulturo (75 cm3, prostornina 250 ml) z uporabo medija kulture RPMI 1640 (GibcoTM), dopolnjenega z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (GibcoM) in 50 ug/ml gentamicina (GibcoTM). Celice so hranili v inkubatorjih s 5 odstotno atmosfero CO pri 37 stopinjah in dnevno spremljanje. Vse celične linije so bile testirane na mikoplazmo z uporabo kompleta za odkrivanje mikoplazme z barvanjem Hoechst (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Celična linija C6 je bila pridobljena iz glialnih tumorjev podgan, induciranih z n-nitrozometilsečnino [50]. Te celice glioma so bile kultivirane, kot so opisali de Oliveira et al. [51]. Celice smo inkubirali pri 37 stopinjah v navlaženem inkubatorju pri 5 odstotkih CO2. Celice C6 smo gojili na posodah za celično kulturo （100- mm Ø, TPP） v mediju DMEM, dopolnjenem s 100 UI/mL penicilina G, 100 ug/mL streptomicina, 7 mM glukoze, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvata, in 10 odstotkov fetalnega telečjega seruma. Gojišče smo zamenjali vsaka 2 dni. Štiriindvajset ur pred zdravljenjem smo celice C6 zasejali v petrijevke s premerom 35 mm ali 96-plošče z vdolbinicami pri gostoti 3,5 × 10* celic/vdolbinico.

Vse celične linije so bile testirane na mikoplazmo z uporabo kompleta Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich), da se potrdi uporaba celic brez kontaminacije. Podatki o celičnih linijah so v bazi podatkov "Cell Bank of Rio de Janeiro (BCRJ)": celica HepG2 (koda: 0291), celica HL-60 (koda: 0104) in celica C6 (koda: 0057) .

3.5.4. Test citotoksične aktivnosti

Za oceno citotoksičnosti testiranih spojin (Q in Q5) na celicah HL-60 (človeška akutna promielocitna levkemija) in celicah HepG2 je bila uporabljena kolorimetrična metoda Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Alamar Blue (resazurin) je indikator, ki povzroči kolorimetrično spremembo in fluorescentni signal kot odgovor na presnovno aktivnost. Presnovno aktivne celice resazurin reducirajo v resorufin. Oksidirana oblika je modra (nefluorescentna/neživa celica), reducirana oblika pa je rožnata (fluorescentna/neživa celica). Zmanjšanje resazurina v resorufin odraža sposobnost preživetja celic [52].

V testu so bile celice porazdeljene v {{0}}plošče z vdolbinicami pri vnaprej določeni gostoti 0.3×1{{10}} stopinj celic/mL za celice linija HL-60 in 0.7× 10 celic/ml za celice linije HepG2. Spojine so bile dodane v seriji osmih koncentracij (80 do 0,62 uM), z izjemo doksorubicina, ki je bil uporabljen v koncentracijah v razponu od 0,003 do 5 μM. Negativna kontrola je prejela enako količino DMSO（0,025 odstotka）. Plošče smo inkubirali 72 ur v pečici pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2. Po tem obdobju smo dodali 20 μL/jamico Alamar Blue in plošče inkubirali še 4 ure. Plošče smo odčitali s spektrofotometrom (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ZDA), pri valovnih dolžinah 570 in 600 nm.

Viabilnost celic C6 smo določili z uporabo kolorimetrične metode, ki so jo opisali Hansen et al. [53]. MTT (3-4, 5-dimetiltiazol-2-il, 25-difeniltetrazolijev bromid) je bil raztopljen v koncentraciji 5 mg/ml v sterilni fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS) pri sobni temperaturi, raztopina pa je bila nadalje sterilizirana s prehodom skozi filter 0.2- mm in shranjena pri 4 stopinjah v temi. Pri preizkusu so bile celice porazdeljene v 96-plošče z vdolbinicami pri vnaprej določeni gostoti 3,5 × 10* celic/ml za celično linijo C6. Spojine smo dodali v seriji osmih koncentracij (80 do 0,39 uM).

V vsako vdolbinico smo dodali MTT pri končni koncentraciji 2 mg/ml in celice inkubirali 2 uri. Po tem smo celice lizirali z 20-odstotno （w/ø）natrijevim dodecil sulfatom （SDS） in 50-odstotno （o/ø） raztopino dimetilformamida （DMF） (pH 4,7） v inkubaciji čez noč pri sobni temperaturi [54,55] . Absorbanca je bila izmerjena s spektrofotometrom za branje mikroplošč (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (različica 3001, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finska). Za vsako koncentracijo je bilo uporabljenih osem ponovitev. Viabilnost celic je bila izražena kot odstotek absorbance pri 570 nm, kontrola pa je bila sprejeta kot 100 odstotkov. Po zdravljenju je bila morfologija celic ovrednotena s svetlobno mikroskopijo z optičnim mikroskopom (invertirani mikroskop Eclipse TS100, Nikon Instruments, Tokio, Japonska) in fotografirana z uporabo digitalnega fotoaparata (Coolpix S4300, Nikon Instruments, Tokio, Japonska).

3.5.5. Kultura makrofagov

Makrofage peritonealnega eksudata (2 × 105 celic/jamico) smo inkubirali v 96-ploščah z jamicami v mediju DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki PBS in 50 ug/ml gentamicina, v treh izvodih, stimuliranih ali ne z LPS (500 ng/mL) in IFN-y （5 ng/mL） in obdelan ali ne z različnimi koncentracijami spojin (20, 40 in 80 uM). Celice so hranili v inkubatorju pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2 4 24 h. Po tem obdobju so supernatante kulture zbrali za citokine in odmerjanje dušikovega oksida. V nekaterih testih za oceno citotoksičnosti je bil supernatant nadomeščen s srednjo in 10-odstotno Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in plošče smo inkubirali dodatne 4 ure. Odčitavanje na spektrofotometru je bilo izvedeno pri 570 in 600 nm.

3.5.6. Odmerjanje TNF

Merjenje TNF je bilo izvedeno iz supernatantov celičnih kultur z uporabo tehnike sendvič ELISA z uporabo razvojnih sistemskih kompletov Duoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MI, ZDA), v skladu s priporočili proizvajalca. Plošče ELISA （NUNC—IMMUNO PLATE Maxisorp Surface） so bile senzibilizirane s 50 μL/vdolbinico protitelesa za zajem, v koncentraciji 2 ug/mL, razredčene v PBS 1x in inkubirane 16 ur pri 4 stopinjah. Plošče so bile trikrat sprane z 1 × PBS/0.05 odstotki Tween 20 in blokirane s 100 μL/jamico 1 × PBS ter 0,05 odstotka Tween 20 in 0,1 odstotka govejega albumina za 2 uri. .

Nato 50 μL/vdolbinico vzorcev, slepo in standardno krivuljo rekombinantov, razredčenih v tris-fiziološkem pufru (20 mM Trix v bazi in 150 mM NaCl), ki vsebuje Dodali smo 0,1 % govejega albumina in 0,05 % tween 20 2 uri pri sobni temperaturi. Standard smo serijsko razredčili (1:2), od začetne koncentracije 2000 pg/mL, z 11 dvojnimi razredčitvami. Ploščo smo trikrat sprali s PBS/0,05 % tween in 2 uri inkubirali s 50 μL detekcijskega protitelesa (biotiniliranega) pri koncentraciji 400 ng/mL.

Ploščo smo trikrat sprali s PBS/{{0}}.05 % tween in inkubirali 20 minut z avidin-peroksidazo, razredčeno 1:200. Razvoj smo izvedli z dodatkom substrata TMB (Thermo Fisher) in prekinili z 0,05 M fosforno kislino. Odčitek reakcije je bil določen s spektrofotometrom (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, ZDA) s 450 nm filtrom. Analize so bile izvedene s programsko opremo Softmax 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, ZDA).

3.5.7. Odmerjanje dušikovega oksida

Proizvodnja nitrita v supernatantih makrofagov je bila ocenjena s kvantifikacijo njegovega oksidativnega produkta, nitrita, po metodi Griess [50]. Absorbanco smo določili v spektrofotometru (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, ZDA), s 570 nm filtrom. Analize so bile izvedene s programsko opremo Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, ZDA), rezultati pa so bili izraženi v μM nitrita na podlagi standardne krivulje natrijevega nitrita z začetno koncentracijo 400 uM.

3.6. Statistična analiza

Za določitev statistične pomembnosti primerjav med skupinami v študijah je bil uporabljen enosmerni test ANOVA, ki mu je sledil naknadni test večkratne primerjave Bonferroni. Rezultati so veljali za statistično pomembne, ko je p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Sklepi

Pogoji in reakcijski mediji za sintezo analogov kvercetina so pokazali učinkovitost pri pridobivanju ene spojine, ki je ustrezno označena, glede na podatke, opisane v literaturi. Primerjalna analiza antioksidativne aktivnosti Q in Q5 je pokazala, da je kvercetin (O) bolj aktiven pri odstranjevanju radikala ABTS* plus kot O5 (29 odstotkov oziroma 18 odstotkov). Zmanjšan antioksidativni potencial ni pokazal motenj v imunomodulacijskih in protitumorskih aktivnostih. Kemijske modifikacije, predlagane v tej študiji, so okrepile antiproliferativni učinek in ohranile protivnetno aktivnost, ne pa tudi citotoksične aktivnosti v zdravih testiranih celicah.

Prisotni acetilirani derivat (Q5) je izboljšal citotoksičnost v rakavih hepatocelularnih celicah (HepG2), celicah promielocitne levkemije (LH-60) in zlasti v celicah glioma (C6). Trgovane celice podganjega glioma C6 so pokazale morfološki vzorec celične smrti brez primere. Q5 pri 50 µM 24 ur je povzročil spremembe v morfologiji celic glioma C6, za katere je značilna okrogla oblika telesa (ki v znanstveni literaturi ni bila navedena), za razliko od kvercetina, ki je predstavljal fibroblastom podobno morfologijo.

Za boljše razumevanje učinkov acetiliranih derivatov kvercetina, zlasti v nevronskih celicah, so potrebne nadaljnje raziskave. Ta študija je prvič omogočila uporabo strukturno spremenjenega kvercetina v živčnih celicah za morebitne nevroprotektivne učinke.

Reference

1. Formica, JV; Regelson, W. Pregled biologije kvercetina in sorodnih bioflavonoidov. Food Chem. Toxicol. 1995, 33, 1061–1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Kvercetin in njegovi derivati: kemijska struktura in bioaktivnost—pregled. Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58, 407–413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Bioaktivni flavonoidi v zdravilnih rastlinah: struktura, aktivnost in biološka usoda. Asian J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12–23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Kvercetin: Flavonol z večplastnimi terapevtskimi aplikacijami? Fitoterapia 2015, 106, 256–271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, EKO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, CA; et al. Flavonoidi inducirajo celično smrt pri Leishmania amazonensis: In vitro karakterizacija s pretočno citometrijo in Ramanovo spektroskopijo. Analitik 2019, 144, 5232–5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇcková, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Antiparazitski učinki izbranih izoflavonov na ploske črve. Helmintologija 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reis, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Prehranski flavonoidi fisetin, luteolin in njihove pridobljene spojine zavirajo arginazo, osrednji encim pri okužbi z Leishmania (Leishmania) amazonensis. Food Chem. 2013, 141, 2253–2262. [CrossRef]

8. Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosun, F.; Rüedi1, P. Antitripanosomske in antileishmanialne aktivnosti flavonoidov in njihovih analogov: In vitro, in vivo, razmerje med strukturo in aktivnostjo ter kvantitativne študije razmerja med strukturo in aktivnostjo. Protimikrobno. Agenti Chemother. 2006, 50, 1352–1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, M.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Chow, JM; Lin, KH; Lin, YW; Liu, CC; et al. Kvercetin inducira apoptozo, ki izvira iz mitohondrijev, preko aktivacije ERK, posredovane z reaktivnimi kisikovimi vrstami, v celicah levkemije HL-60 in ksenograftu. Arh. Toxicol. 2015, 89, 1103–1117. [CrossRef]

10. Drummond, EM; Harbourne, N.; Marete, E.; Martyn, D.; Jacquier, J.; O'Riordan, D.; Gibney, ER. Inhibicija pro-vnetnih biomarkerjev v makrofagih THP1 s polifenoli, pridobljenimi iz kamilice, travniške sladice in vrbovega lubja. Phytother Res. 2013, 27, 588–594. [CrossRef]