Študija o nevroendokrini imunski funkciji Cistanche Deserticola in njenih izdelkov za kuhanje riževega vina na modelu podgan, povzročenih z glukokortikoidi-Ⅱ

3.2.4. Imunohistokemija

Nevronsko apoptozo nadzirajo številni apoptotični in antiapoptotični geni, predvsem gen Bax, ki spodbuja apoptozo, in antiapoptotični geni iz družine genov Bcl-2. Bcl-2 je lokaliziran v organelih, ki proizvajajo reaktivni kisik, kot so mitohondriji, endoplazmatski retikulum in jedrske membrane. Bcl-2 malo vpliva na kisikove proste radikale, vendar lahkopreprečujejo oksidativne poškodbe celic. Bax se prenaša iz citoplazme v mitohondrijsko membrano, spremeni strukturo mitohondrijske membrane in spodbuja sproščanje citokroma c ter indukcijo apoptoze.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V nadledvični citoplazmi je prišlo do izražanja beljakovin Bax in Bcl-2. Barvanje je pokazalo vse rumene delce. V primerjavi s skupino BC se je povprečna optična gostota proteina Bax v skupini MC znatno povečala (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Slika 5(b) kaže, da se je v primerjavi s skupino BC povprečna optična gostota proteina Bcl-2 v skupini MC znatno zmanjšala (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Protein kaspaza-3 je lokaliziran predvsem v citoplazmi v svoji prvotni obliki v normalnih tkivih in ima nizko ekspresijo. Pozitivni signali so bledo rumeni ali rjavkasto rumeni. V primerjavi s skupino BC se je izražanje kaspaze-3 v skupini MC znatno povečalo (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

V normalnih tkivih je bila ekspresija gena Fas zmanjšana, pozitivni signal za in situ hibridizacijo pa je bil rjavkasto rumen. Kot je prikazano na sliki 5(d), se je v primerjavi s skupino BC povprečna optična gostota proteina Fas v skupini MC povečala (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Protein FasL se nahaja predvsem v celični membrani ali citoplazmi, njegovi pozitivni signali pa so rjavi. V primerjavi s skupino BC se je povprečna optična gostota gena FasL v skupini MC znatno povečala (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Rezultati so pokazali, da CD in WCD lahkoinducirajo apoptozo v vnetnih celicahin zmanjša poškodbo nadledvične žleze s spodbujanjem izražanja proteina FasL in vezavo na protein Fas, aktiviranjem proteina kaspaze-3 in sprožitvijo kaskade kaspaze. Učinek skupine WCD-HD je bil najboljši.

3.3. Določanje imunske funkcije

3.3.1. Indeks imunskih organov

V primerjavi s tistimi v skupini BC sta se koeficient timusa in indeks vranice v skupini MC znatno zmanjšala (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Odkrivanje podskupin limfocitov T v periferni krvi

Odstotek celic CD4+ v zgornjem levem kvadrantu in celic CD8+ v desnem spodnjem kvadrantu v BC in vsaki skupini zdravil je bil višji kot v skupini MC. V primerjavi s skupino BC se je razmerje CD4+ThCD8+ znatno zmanjšalo v skupini MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Določanje ravni IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α in IFN-C v serumu

Slika 8 kaže, da se je v primerjavi s skupino BC raven IL-6, TNF- in IFN-c znatno povečala (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Rezultati eksperimenta z opazovanjem tkiva Lymus pod mikroskopom

Slika 9 kaže, da je bilo v skupini z BC prisotnih veliko število limfocitov. Limfociti in retikulociti so bili ohlapno razporejeni v središču z razpršenimi okroglimi ali ovalnimi timociti. Ni bilo nekroze, vnetne celične infiltracije in nenormalnih sprememb.

Skupina MC je pokazala veliko količino tkiva limfne nekroze, z neurejeno razporeditvijo limfocitov in retikulocitov v središču. Okrogli ali ovalni timociti so izginili, očitna je bila masivna celična degeneracija ali nekroza in prišlo je do vnetne celične infiltracije z nenormalnimi patološkimi spremembami.

V skupinah s CD so se morfološke značilnosti limfocitov normalizirale, razporeditev centralnih limfocitov in retikulocitov pa je bila skoraj normalna. Okrogli ali ovalni timociti so se obnovili, vendar je ostalo majhno število degenerativnih ali nekrotičnih limfocitov in infiltriranih vnetnih celic.

V skupinah WCD in skupini PC so bile morfološke značilnosti limfocitov bolje popravljene. Limfociti in retikulociti v središču so bili dobro poravnani, okrogli ali ovalni timociti so bili skoraj normalni, vendar je ostalo majhno število infiltriranih in degenerativnih limfocitov.

3.4. Ekspresija gena za beljakovine CaM

Vrednost RQ (CaM mRNA -aktinska mRNA) je veljala za pregled izražanja CaM mRNA. RQ skupine BC je bil 1. Ekspresija CaM mRNA v hipotalamusu v skupini MC se je znatno povečala (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Razprava

Kitajska farmakopeja [2] navaja, da se CD in WCD lahko uporabljata v kliniki kot glavni vrsti dekoktiranih kosov. Po poparjenju z riževim vinom seučinkuje proti staranju in krepi ledvice-jangso bili izboljšani. Z UPLC-QqQ-MS smo zaznali kvantitativne spremembe v kemični materialni bazi med procesom kuhanja riževega vina na pari. Iridoidni glikozidi so bili nestabilni in vsebnost teh glikozidov se je zmanjšala, celo ni bilo mogoče zaznati. Spremenila se je tudi vsebnost feniletanol glikozidov, kar je lahko povzročilo spremembe v farmakodinamiki in kliničnem učinku.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Klasični model pomanjkanja ledvičnega janga je bil ponovljen s subkutano injekcijo kortikosterona [19]. Preveliko odmerjanje kortikosterona bi lahko zaviralo izločanje CRH v hipotalamusu. Medtem je bila zavirana tudi skrivnost ACTH. Znižala se je raven hormona skorje nadledvične žleze in s tem zmanjšana funkcija HPA osi. Hipofunkcija osi HPA je pogosta značilnost pomanjkanja ledvičnega janga [20]. Nato podgane pokažejo pojave "izčrpanosti" in simptomi so v skladu s tistimi pri pomanjkanju ledvičnega janga na kliniki.

V skupini MC se je raven CRH, ACTH, T in CORT v serumu podgan znatno zmanjšala (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Modulacija deleža članov družine Bcl-2 je eden od temeljnih mehanizmov, s katerimi FasThFasL posreduje pot receptorja smrti, družina Bcl-2 pa uravnava mitohondrijsko pot [21]. Faktor Bcl-2, ki zavira apoptozo, in faktorji, ki inducirajo apoptozo, kot je Bax, vsi pripadajo družini Bcl-2 [22]. Apoptozo celice lahko določimo z relativnim razmerjem faktorjev, ki zavirajo apoptozo, in faktorjev, ki inducirajo apoptozo [23]. Mitohondriji imajo funkcijo osrednjih kontrolnih točk za številne oblike apoptoze [24]. Ta študija je pokazala, da lahko CD-MD in WCD izpeljejo izražanje Bax in povečajo Bcl-2 naizboljšanje pomanjkanja ledvičnega janga. Fas je glavni smrtni receptor, ki inducira apoptozo z vezavo z ligandom Fas (FasL) [25]. Izražanje Fas in FasL v skupini MC se je povečalo, medtem ko se je to izražanje znatno povečalo v skupini WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Pomanjkanje imunske funkcije je ena od pomembnih manifestacij pomanjkanja ledvičnega janga [28]. V tej študiji smo ugotovili, da se je indeks vranice in timusa v skupini WCD-MD znatno povečal (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

Os HPA je najpomembnejši regulativni sistem, saj uravnava izločanje glukokortikoidov in endokrini sistem za vzdrževanje sekretorne funkcije skorje nadledvične žleze [32]. Prekomerna ekspresija mRNA CaM v tkivu hipotalamusa je bila povezana s pomanjkanjem ledvičnega janga. CD in WCD lahko blokirata kalcijeve kanale, zavirata ekspresijo mRNA CaM v hipotalamusu in zmanjšata dotok kalcija ter tako zmanjšata aktivnost kompleksa Ca2+·CaM.

Nastanek pomanjkanja ledvičnega janga je kronični proces razvoja bolezni. Ledvica ni več zgolj anatomski pojem, temveč splošen izraz za nevroendokrini imunski in genitourinarni sistem. Nevroendokrino-imunsko omrežje (NEI) je pomemben integriran regulativni sistem [33]. CD in WCD lahko uravnavata delovanje osi HPAT in izboljšata okrevanje pomanjkanja ledvičnega janga. Ta rezultat zagotavlja eksperimentalno podlago za klinično preprečevanje in zdravljenje pomanjkanja ledvičnega janga.