Študija o vplivu acteosida (aktivna sestavina v Cistanche puščavci) na NAFLD z indukcijo avtofagije

2 rezultati

2.1 Primerjava LC 3- ⅱ Ravni ekspresije beljakovin v celicah HepG2, zdravljenih zDelujte in ECH relativni izraz LC 3- ⅱ ProteinV celicah HepG2, zdravljenih z BAFA1 (0. 67 ± 0. {{6} 4), je bilo bistveno višji kot v prazni kontrolni skupini (0. Relativni izraz LC {{1 {2 {2 {28}}}}}}}} ⅱ ⅱ Protein v celicah HepG2 v skupini Rapamicin+Bafa1 (1,24 {{3 {34}}}}}. (0. 28 ± {{4 0}}}}. 02). Izraz LC 3- ⅱ proteina v celicah HepG2 v skupini ECH+BAFA1 in skupine ACT+BAFA1 [0,43 ± 0,02 in 1,36 ± 0,11 sta bila znatno višja od tistih v skupini ECH in razlik (0,18 ± 0,01 in 0,02 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,28 ± 0,02.<0.05).

TCM Herb Cistanche za zaščito jeter

2.2 Primerjava LC 3- ⅱ Ravni ekspresije beljakovin v celicah HepG2, zdravljenih z različnimi koncentracijami ACT

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ Ravni ekspresije proteina celic HepG2 v Bafa1 v kombinaciji s 25, 5 0 in 1 0 0}} {l Act (1,17 {27}. 1,83 ± 0. 53 in 0. 97 ± 0,25) sta bila bistveno višja od tistih v skupinah 25, 50 in 100 μmol/L (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18 in 0,30 ± 0,15, s pomembnimi različicami (P<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Opomba: A. Imunoblotiranje beljakovin; B. Rezultati polkvantitativne analize; V primerjavi z skupino ACT brez BAFA1, AP<0.05.
Slika 1 Primerjava LC 3- ⅱ Ravni ekspresije beljakovin v celicah HepG2, zdravljenih z različnimi koncentracijami ACT

2.3 Primerjava sposobnosti preživetja celic HEPG2, zdravljenih z različnimi koncentracijami ACT za 24 in 48 ur

Vrednosti OD celic Hepg2 po intervenciji z 0, 2 0, 4 {{1 {12}}}}, 6 0, 8 0 in 1 {{{18 {22}} {22}} {22}} {22}} 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 {36}}}}}. 0. 94 ± 0. 15 in 0. 94 ± 0. 20; vrednosti OD celic HepG2 po intervenciji 48 ur so bile 3,06 ± 0,27, .96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 in .09 ± 0,22. Po 24 in 48 urah intervencije z različnimi koncentracijami ACT (f =0}. 213, 0,213, p =0. 96, 0,36) ni bilo bistvene razlike v vrednosti OD. Glej sliko 2.

Opomba: A. celice Hepg2 smo 24 ur zdravili z različnimi koncentracijami ACT; B. celice HepG2 smo 48 ur zdravili z različnimi koncentracijami ACT.

Slika 2 vrednosti OD pri 570 nm po 24 in 48 h zdravljenja z različnimi koncentracijami ACT

2.4 Primerjava ravni TG in oljno rdeče O obarvanje v in vitro celičnem modelu NAFLD po intervenciji ACT

Stopnja TG celic HepG2 v modelni skupini (34,15 ± 1,90) je bila bistveno višja kot v prazni kontrolni skupini (14,17 ± 2,74) in intervencijske skupine ACT (19,11 ± 1,68), razlike pa so bile statistično pomembne (P<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Opomba: A. TG raven; B. Oljno rdeče O obarvanje (20 ×); V primerjavi z modelom skupine, AP<0.05.
Slika 3 Primerjava ravni TG in oljne rdeče obarvanja v modelu NAFLD in vitro po zdravljenju

2.5 Primerjava avtofagosomov in lipidnih kapljic Po zdravljenju z ACT v primerjavi s prazno kontrolno skupino so se lipidne kapljice celic HepG2 v skupini za zdravljenje rapamicina in intervencijske skupine ACT znatno povečale, avtofagosomi LC3 celic Hepg2 v vesoljski intervencijski skupini. Glej sliko 4.

3 razprava

NAFLD je najpogostejša kronična bolezen jeter na svetu, ki predstavlja približno 1/4 celotnega prebivalstva na svetu in je postala svetovna javnozdravstvena težava. Preveliranje je glavni dejavnik, ki vozi NAFLD. Excessive intake of nutrients by liver cells causes excessive fat deposition in the cells, leading to lipotoxic reactions such as cell stress (oxidative stress and endoplasmic reticulum stress), inflammasome activation, and cell apoptosis, and subsequently causing a series of changes in liver tissue phenotypes such as inflammatory stimulation, tissue regeneration, and fibrosis [14-15]. V zadnjih letih so študije pokazale, da ima avtofagija pomembno vlogo pri preprečevanju razvoja človeškega NAFLD. Rezultati odkrivanja indeksa, povezanega z avtofagijo, pri jetrih bolnikov z NAFLD in brezalkoholno boleznijo maščobnih jeter ter jetrih miši debelih in diete z veliko maščobami so pokazali, da je bil blokiran postopek avtofagije v hepatocitih, kar je privedlo do ogromnega kopičenja intraceličnih TG in drugih kapljic lipidov [16]. Druge študije so pokazale, da se je po tem, ko je bil ključni gen 7 avtofagije hepatocitov posebej potrjen pri miših, ki so se hranili z dieto z veliko maščobami, raven TG v mišjih hepatocitih znatno povečala [17]. Vendar pa se je po prekomerni ekspresiji gena ATG7 ali intervencije z avtofagijskimi induktorji, kot sta rapamicin in karbamazepin, maščobna degeneracija v mišjih jetrih znatno zmanjšala [18-20].
To kaže, da se lahko degeneracija maščob jeter znatno zmanjša z izboljšanjem aktivnosti avtofagije jeter, kar zagotavlja učinkovito strategijo za zdravljenje NAFLD. Naravni proizvodi se kot glavni vir razvoja novih zdravil pogosto uporabljajo pri preprečevanju in zdravljenju različnih bolezni jeter. Kot odličen produkt, ki se običajno uporablja v tradicionalni kitajski medicini, je Cistanche Desericte pritegnila široko pozornost na svoje farmakološke učinke, kot so nevroprotekcija, imunomodulacija, antioksidant, protirakač in zaščita jeter. Doslej je bilo več kot 120 spojin izoliranih iz Cistanche Deserickela, vključno s feniletanoidnimi glikozidi, terpenoidi in njihovimi glikozidi, lignani in njihovimi glikozidi, oligosaharidi, polioli in polisaharidi [21]. Med njimi so feniletanoidni glikozidi najbolj preučeni razred spojin v aktivnih sestavinah Cistanche Deserickola. ECH in ACT sta reprezentativni spojini cistanche desesticola feniletanoidnih glikozidov, ki imajo pozitivne učinke pri antioksidantih, ščitijo jetra, miokard, živčne celice in izboljšujejo spomin [22-23]. Vendar pa ni ustreznega poročila o literaturi o tem, ali so v proces avtofagije pri zaščiti jeter vključeni Cistanche Deseresecola Phenylethanoid glikozidi.

Avtofagija je proces samogradnje, ki je v telesu vseprisotna. Gre za katabolični postopek, v katerem avtofagosomi razgradijo celične presnovne odpadke. Proces avtofagije na splošno vključuje tri procese: začetek avtofagije, podaljšanje avtofagične membrane in avtofagično tvorbo lizosomov, ki jih regulirajo predvsem rapamicinski ciljni protein in fosfatidilinozitol -3 kinaze signalizacijskih poti. Avtofagosomi so označevalci celične avtofagije. V procesu tvorbe avtofagosomov ima pomembno vlogo niz beljakovin, povezanih z avtofagijo, vključno z ATG5 ~ 12 in LC3. Zato je ta študija konstruirala sistem za ocenjevanje avtofagije, na molekularni ravni zaznala raven ekspresije avtofagičnega markerja LC3 in ovrednotila avtofagijsko indukcijsko sposobnost dveh feniletanoidnih glikozidov cistante puščavske puščave v celicah HEPG2. Rezultati so pokazali, da se je po dodatku zdravljenja BAFA1 na podlagi intervencije avtofagijskega induktorja rapamicina medcelični LC 3- ⅱ celic HepG2 znatno povečal, kar kaže, da lahko sistem ocenjevanja avtofagije natančno oceni indukcijsko aktivnost avtofagije; Po ECH in ACT smo obdelali z BAFA1, izražanje LC 3- ⅱ proteina v celicah HepG2 v skupini ECH+BAFA1 in skupina ACT+BAFA1 je bila bistveno višja kot v skupini ECH in ACT, razlike pa so bile statistično pomembne (P<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and izvajanje zaščite jeterin druge biološke funkcije. Drugič, varnost je glavna pozornost pri razvoju zdravil. Za oceno varnosti ACT je ta študija nadalje preizkusila učinek ACT na sposobnost preživetja celic HepG2. Rezultati so pokazali, da sposobnost preživetja celic HepG2 skoraj ni vplivala na intervencijo z različnimi koncentracijami ACT, kar kaže, da se lahko ACT uporabi kot kandidatno zdravilo za nadaljnje preučevanje njegovih farmakoloških učinkov in molekularnih mehanizmov.

Avtofagija je zelo ohranjen biološki proces v celicah, rahle spremembe koncentracij zdravil pa bodo vplivale na raven celičnih avtofagosomov. Za nadaljnjo določitev optimalne koncentracije ACT za induciranje tvorbe avtofagosomov v celicah HepG2 je ta študija uporabila različne koncentracije ACT v kombinaciji z BAFA1 za zdravljenje celic HepG2 in odkrila stopnjo ekspresije LC 3- ⅱ proteina v celicah. Rezultati so pokazali, da lahko 50 μmol/L ACT znatno poveča raven avtofagosomov v celicah HepG2. Zato je ta študija uporabila 50 μmol/l ACT, da bi posegala v celični model NAFLD, zgrajena in vitro, in predhodno raziskala razmerje med njegovimZaščita jeterfunkcija in avtofagija.
Povezane študije o celičnih modelih NAFLD so pokazale, da se je po intervenciji in vitro s prostimi maščobnimi kislinami stopnja TG celic HepG2 znatno povečala in v celicah lahko jasno opazimo agregacijo mastnih lipidnih kapljic [24-25]. V tej študiji smo 24 ur uporabili 100 μmol/L PA za posredovanje v celicah HepG2 in vitro. Stopnja TG celic HepG2 v modelni skupini je bila bistveno višja kot v prazni kontrolni skupini. Hkrati je bilo mogoče v celicah jasno opaziti agregacijo lipidnih kapljic, kar kaže, da je bil model celic NAFLD uspešno konstruiran. Za nadaljnjo opazovanje učinka ACT na model celic NAFLD smo uporabili 50 μmol/L ACT za posredovanje v modelu NAFLD in vitro celic, učinek ACT na NAFLD pa je bil ovrednoten z odkrivanjem ravni TG in obarvanjem z rdečim oljem. Rezultati so pokazali, da sta bila po intervenciji ACT, raven TG in število mastnih lipidnih kapljic v celicah HepG2 bistveno nižja od tistih v modelni skupini, kar kaže, da ima ACT aktivnost zmanjšanja TG v modelu celic, ki ga povzroča PA. Za nadaljnjo preučevanje razmerja med aktivnostjo lipidov ACT in celično avtofagijo je ta študija uporabila LC 3- ⅱ specifična proteinska protitelesa in bodipy fluorescentne sonde za sočasno obdelavo avtofagosomov in lipidnih kapljic. Opaženo je bilo, da se je število avtofagosomov v celicah HEPG2 po intervenciji ACT znatno povečalo v primerjavi s kontrolno skupino, kar je bilo v tej študiji skladno z rezultati imunoblotiranja beljakovin, kar je še dodatno potrdilo, da ima ACT aktivnost, ki povzroča avtofagijo v celicah HepG2. Poleg tega po intervenciji zdravil medceličnimi avtofagosomi in lipidni kapljici so-lokalizirani, kar kaže na to, da lahko vpliv ACT na izboljšanje PA-inducirane degeneracije maščobne maščob, ki ga povzroča PA, vključuje vpletenost celične avtofagije. Vendar pa je treba v celičnem modelu NAFLD, ali ACT izvaja farmakološko aktivnost znižanja znotrajceličnih ravni Tg po lipofagični poti, še vedno razložiti z blokiranjem znotrajceličnega procesa avtofagije.
Če povzamemo, med obema feniletanol glikozidnimi spojinami cistanche puščave ima veliko sposobnost inducira avtofagijo v celicah HepG2. Hkrati je CT v celičnem modelu jetrne steatoze, ki ga povzroča PA, znatno zmanjšala raven TG v celicah HepG2. Po intervenciji ACT so imeli avtofagosomi in lipidne kapljice v celicah HEPG2 določeno razmerje ko-lokalizacije, kar kaže, da je avtofagija lahko nova pot, ki je vključena v farmakološki proces ACT v smislu zaščite jeter. Glej sliko 5. V naslednjih študijah bomo mehanizem delovanja pri zniževanju lipidov podrobno preučili z uporabo blokatorjev avtofagije za postavitev temeljev za prihodnji razvoj novih zdravil.