Sinergistični protivnetni učinki izvlečka Laminaria Japonica Fucoidan in Cistanche Tubulosa

Kot imunski odziv proti tujim antigenom makrofagi sproščajo protivnetne citokine, kot so faktor tumorske nekroze (TNF-), interlevkin-1 (IL- 1), IL-6 in drugi. Takšni citokini inducirajo kemotaktični dotok granulocitov, monocitov, limfocitov in mastocitov v poškodovano tkivo, kar spodbuja odstranitev antigena in okrevanje tkiva. Vendar prekomerna infiltracija in aktivacija celic poslabša poškodbe tkiva, kar povzroči edem (žilni izcedek) in bolečino, ki sta dobro znana pojava vnetja.

TNF- je pomemben dejavnik za indukcijo genske ekspresije sintaze dušikovega oksida (iNOS) v več celičnih linijah. Aktivacija iNOS vodi do proizvodnje dušikovega oksida (NO), ki ne samo modulira več fizioloških funkcij, kot sta baktericidno delovanje in vazodilatacija, ampak povzroča tudi vnetje. Po poškodbi tkiva pri razgradnji fosfolipidov celične membrane s fosfolipazami nastane arahidonska kislina. Arahidonska kislina se nadalje razgradi s ciklooksigenazo (COX) na prostaglandine (PG). Prekomerna količina PGE2, ki jo tvori COX-II, povzroči več citokinov za vnetje. Ker tako NO kot PGE2 delujeta kot glavna dejavnika za indukcijo vnetja in bolečine, sta poti TNF- –NO in COX-II–PGE2 glavni tokovi vnetnega procesa, ki ju zavirajo kortikosteroidi in nesteroidniprotivnetna zdravila(NSAID) oz.

Čeprav obstaja več steroidov in nesteroidnih protivnetnih zdravil zazdravljenje vnetnih bolezni, lahko ta zdravila povzročijo škodljive učinke na imunski sistem, prebavila, ledvice, jetra, centralni živčni sistem, krvni tlak in srčno-žilni sistem. Zato je treba čim bolj zmanjšati škodljive učinke kemičnih terapevtikov z njihovo zamenjavo ali uporabo v kombinaciji z naravnimi izdelki.

Fucoidan, sulfatni polisaharidni kompleks iz morskih alg, kot sta Laminaria japonica in Cladosiphon okamuranus, razširjen v mnogih državah, se že dolgo uporablja kot terapevt v orientalski medicini. V prejšnjih študijah je bilo dokazano, da fukoidan deluje antioksidativno, proti strjevanju krvi, proti raku inprotivnetne aktivnosti. Zato koristni učinki fukoidana na vnetne bolezni, ishemijo, imunsko disfunkcijo in tumorje pritegnejo pozornost raziskovalcev. Po drugi strani,Cistanche tubulosa(CT) se na Kitajskem pogosto uporablja tudi kot tradicionalno zdravilo. Poročali so, da ekstrakti CT zmanjšajo proizvodnjo TNF-á in IL- 4, ki sta glavna dejavnika za proizvodnjo NO v vnetnih poteh [19].

Takšne prejšnje ugotovitve so nas vodile k raziskovanju kombinirane učinkovitosti fukoidana in izvlečka CT na 2 glavnih poteh vnetja. Da bi pojasnili mehanizem delovanja, smo analizirali NO in PGE2 v eksudatih vnetja zračne mešičke, ki ga povzroča karagenan.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPREČEVANJEVNETNE DEJAVNOSTIPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiali in metode

Materiali

Polprečiščen fukoidan in vodni ekstrakt CT sta bila pridobljena pri Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Koreja). Fucoidan in ekstrakt CT smo hranili pri 4 stopinjah, zmešali (1:3) pred uporabo raztopili v prečiščeni vodi in dajali peroralno v volumnu 5 ml/kg.

Kultura celic in kvantifikacija NO

Celična linija mišjega makrofaga RAW 264.7 je bila kupljena pri American Type Culture Collection (Manassas, ZDA) in gojena v Dulbeccovem modificiranem Eagle's mediju (Sigma, St. Louis, ZDA), ki je vseboval 10 % fetalnega govejega seruma in antibiotike [100 U/mL penicilina (Sigma) in 100 µg/ml streptomicina (Sigma)]. Celice smo inkubirali v navlaženi atmosferi s 5 % CO2 pri 37 stopinjah.

Za oceno učinkov fukoidana in izvlečka CT na izločanje NO smo celice RAW 264.7 (1×106 celic/ml) inkubirali s fukoidanom ali izvlečkom CT (1–320 µg/ml) 5 minut. , čemur sta sledila interferon- (IFN-, 10 U/mL) in lipopolisaharid (LPS, 10 µg/mL) 24 ur. V naših predhodnih študijah je bilo potrjeno, da zdravljenje z IFN- plus LPS za aktivacijo celic RAW 264.7 ni vplivalo na sposobnost preživetja celic do 24 ur in da fukoidan in ekstrakt CT nista bila citotoksična do 1 mg/mL. Kot indikator NO smo izmerili koncentracijo nitrita (NO2 – ), oksidiranega produkta NO. Gojišče smo zmešali z enako količino Griessovega reagenta (1 % sulfanilamida, 0,1 % naftil etilendiamina v 2,5 % fosforne kisline) [21] in inkubirali pri sobni temperaturi 10 minut. Koncentracijo nitrita smo analizirali pri 540 nm, kjer smo za izdelavo standardne krivulje uporabili NaNO2.

Živali in zdravljenje

Samci miši ICR (stari 7 tednov) so bili kupljeni pri Daehan Biolink (Eumseong, Koreja) in nameščeni v prostoru s stalnimi okoljskimi pogoji (22±2ºC; 40-70% relativna vlažnost; 12-urna svetloba -temni cikel; svetlost 150-300 lux). Krma v peletih in prečiščena voda sta bili na voljo ad libitum. Vse poskuse na živalih je odobril Institucionalni odbor za oskrbo in uporabo živali (IACUC) Nacionalne univerze Chungbuk (CBNU), Koreja, izvedeni pa so bili v skladu s standardnimi operativnimi postopki (SOP) Centra za laboratorijske raziskave na živalih, CBNU.

Miši (n=8/skupino) smo peroralno zdravili s fukoidanom (18 ali 54 mg/kg), ekstraktom CT (54 ali 162 mg/kg) ali njuno mešanico (18+54, {{6 }} ali 90+270 mg/kg) enkrat na dan 7 dni. Nizki odmerki fukoidana (18 mg/kg) in izvlečka CT (54 mg/kg) so bili iz ocenjenih odmerkov za človeka 100 mg/telo (70 kg) in 300 mg/telo po prevodu telesne teže na površino (Km{{14). }} za človeka/Km=3 za miško). Visoki odmerki fukoidana in izvlečka CT so bili nastavljeni na 3-kratnik, sam ali v mešanici, mešanica najvišjega odmerka pa je bila določena na 5-kratnik, da bi ocenili največje sinergijske učinke.

Prvi dan zdravljenja s fukoidanom in ekstraktom CT so miši subkutano injicirali 10 ml sterilnega zraka v zadnjo stran, da so oblikovali vrečko [22, 23]. Po 2 in 5 dneh smo v vrečko ponovno vbrizgali 5 ml zraka. Eno uro po končnem zdravljenju je bil v vrečko vbrizgan 1 ml karagenana (1 % v fiziološki raztopini; Sigma) ali njegov nosilec (fiziološka raztopina).

Analize eksudatov

Zračno vrečko smo sprali z 1 ml hladne fiziološke raztopine 6 ur po injiciranju karagenana in zabeležili neto volumen tekočine za izpiranje. Skupno število vnetnih celic, nevtrofilcev, monocitov in limfocitov je bilo določeno s števcem lemežev. Koncentracije NO in PGE2 so bile določene z Griessovim reagentom (Sigma) in encimskim imunskim testom (EIA) z uporabo kompleta Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA BLOKIRANJE DELOVANJA NA KEMOTAKSIJO VNETNIH CELIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatološki pregled

Tkivo za oblogo vrečke je bilo odstranjeno in fiksirano v nevtralni raztopini formalina. V parafin vdelana tkivna stekelca smo obarvali s hematoksilin-eozinom in pod svetlobnim mikroskopom pregledali vnetne lezije.

Statistična analiza

Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± SE. Primerjave eksperimentalnih skupin so bile narejene z enosmerno analizo variance, ki ji je sledil popravek Tukeyjevega testa. vrednost AP<0.05 was considered statistically significant.

Rezultati

In vitro je zdravljenje s celično kulturo RAW 264.7, IFN- in LPS močno povečalo proizvodnjo NO (slika 1). Predhodna obdelava s fukoidanom (1–320 µg/mL) ni vplivala na sproščanje NO iz celične linije makrofagov (slika 1A). Za primerjavo je ekstrakt CT (32–320 µg/mL) znatno zaviral proizvodnjo NO, kar kaže na protivnetno delovanje (slika 1B).

Injiciranje karagenana v zračno vrečko miši je izrazito povečalo volumen eksudata v vrečki (slika 2). Tako povečano izločanje je bilo oslabljeno z zdravljenjem s fukoidanom (18 mg/kg) in ekstraktom CT (54 in 162 mg/kg). Predvsem je kombinirano zdravljenje s fukoidanom in izvlečkom CT dodatno zmanjšalo volumen eksudatov v primerjavi s posameznimi učinki, čeprav kombinacije višjih odmerkov (54+162 mg/kg in 90+270 mg/kg) niso pokazale dodatne učinkovitosti na najnižjo kombinacijo odmerkov (18+54 mg/kg) (slika 2A). Po injiciranju karagenana se je drastično povečala tudi koncentracija N v vrečki (slika 2B). V primerjavi z blagim učinkom fukoidana je ekstrakt CT izrazito znižal koncentracijo N stopinje. Kombinirano zdravljenje s fukoidanom in izvlečkom CT je dodatno znižalo raven NO v odvisnosti od odmerka. Podobno je bila povečana vsebnost PGE2 sinergistično potlačena s kombinirano terapijo s fukoidanom in ekstraktom CT (slika 2C).

Vzporedno z vnetnimi mediatorji v vrečki se je število vnetnih celic drastično povečalo z injiciranjem karagenana: 37,8, 4,8 in 24,1-krat kontrolne ravni za nevtrofilce, monocite in limfocite (tabela 1). Vendar sta fukoidan in izvleček CT pomembno zmanjšala infiltracijo vnetnih celic, pri čemer je bil fukoidan nekoliko boljši od izvlečka CT. Nepričakovano s sočasnim dajanjem fukoidana in izvlečka CT ni bil dosežen noben sinergistični učinek pri infiltraciji vnetnih celic.

Kot sklepamo iz infiltracije vnetnih celic v eksudatih, je podkožno tkivo, ki obdaja zračne mešičke, pokazalo hude vnetne lezije (slika 3). Opaženih je bilo ogromno celic v odebeljenem podkožnem tkivu, izpostavljenih karagenanu (slika 3B), v primerjavi s skoraj normalnimi lastnostmi pri kontrolnih živalih (slika 3A). Takšne vnetne lezije so bile izjemno oslabljene z zdravljenjem s fukoidanom (sliki 3C in 3D) ali ekstraktom CT (sliki 3E in 3F).

Predvsem so bili večji protivnetni učinki doseženi s kombinirano terapijo s fukoidanom in ekstraktom CT (slike 3G-3I).

Diskusija

Z uporabo in viv modela vnetja zračne mešičke, povzročenega z aragenanom, injiciranje zraka v hrbet glodalcev inducira proliferacijo celic, ki se razslojijo na površini votline in tvorijo strukturo, podobno sinoviji. V tem modelu je injiciranje infiltracije vnetnih celic, povzročene s karagenanom, povečalo eksudat, kar kaže na vaskularno puščanje. Zračna vrečka služi kot rezervoar vnetnih celic in mediatorjev, ki jih je mogoče zlahka izmeriti v tekočini, ki se nabira lokalno.

Med različnimi vnetnimi mediatorji, ki lahko inducirajo vaskularno prepustnost, je dobro znano, da sta NO in PGE2 glavna dejavnika, vključena v patogenezo številnih vnetnih bolezni. Znani so tudi kot mediatorji povzročanja in zaznavanja bolečine. iNOS, ki se izraža in aktivira v različnih tipih celic s stimulacijo s TNF- in/ali LPS med vnetjem, proizvaja visoke, obstojne koncentracije NO. NO je pomembna regulatorna molekula v različnih fizioloških funkcijah, kot je vazodilatacija, ki vodi do vaskularnega puščanja. PGE2, ki nastane iz arahidonske kisline prek COX, prispeva k razvoju številnih vnetnih bolezni, prekomerna proizvodnja PGE2 kot odziv na različne vnetne stimulacije pa je povezana z zvišanjem ravni COX-II in napredovanjem vnetja. Zato sta bili poti TNF- - NO in COX-II-PGE2 obravnavani kot dva glavna toka vnetnih procesov, ki ju blokirajo zaviralci iNOS (kortikosteroidi) oziroma COX (NSAID).

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPOVEDO VNETNIH BOLEZNI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V tej študiji je sočasno dajanje fukoidana in izvlečka CT zmanjšalo volumen eksudata v vrečki, kar nakazuje, da imata supresivno aktivnost proti vaskularnemu puščanju (slika 2A). V primerjavi s posameznimi učinki vsakega fukoidana in izvlečka CT se je kombinirano zdravljenje še povečalo, kar pomeni, da spojini dve stopnji delujeta sinergistično. Takšni sinergistični učinki med fukoidanom in ekstraktom CT so bili podprti z njunimi aktivnostmi na ravni NO in PGE2 v eksudatih (sliki 3B in 2C).

Zanimivo pa je, da je bilo potrjeno, da fukoidan neposredno ne zavira aktivacije makrofagov in vitro test (slika 1A). Podobno je bil zaviralni potencial fukoidana pri preskusu kopičenja NO in PGE2 in vivo relativno nižji kot pri ekstraktu CT (sliki 2B in 2C). Tak mehanizem delovanja fukoidana se razlikuje od neposredne inaktivacije celic z izvlečkom CT (slika 1B). Za primerjavo, fukoidan je pokazal visoko učinkovitost pri zaviranju infiltracije vnetnih celic v vrečkah (tabela 1). Fucoidan je bil boljši od ekstrakta CT pri blokiranju migracije nevtrofilcev, monocitov in limfocitov na mesta poškodbe tkiva, ki jih povzroča karagenan. Zanimivo je, da ni bilo sinergističnega protimigracijskega učinka, kar kaže na različne mehanizme delovanja med fukoidanom in izvlečkom CT: tj. fukoidan blokira infiltracijo vnetnih celic, medtem ko izvleček CT zavira aktivacijo celic.

Polimorfonuklearne celice, zlasti nevtrofilci, so glavne celične komponente, ki se rekrutirajo na akutna vnetna mesta, ki jih povzroča karagenan. Poleg tega imajo vnetne celice, kot so makrofagi in limfociti, osrednjo vlogo v vnetnem procesu z izločanjem citokinov. Pri predhodni obdelavi s fukoidanom ali izvlečkom CT je bilo število belih krvnih celic, ki so migrirale v zračne vrečke, vbrizgane s karagenanom, izrazito zmanjšano. Ta rezultat je bil skladen z učinkom, ki bi ga dosegli kortikosteroidi, kot je deksametazon, ne pa NSAID, vključno z indometacinom. Zato se domneva, da imata fukoidan in ekstrakt CT delno lastnost steroidov.

Poleg zaviralnega delovanja na vnetno celično kemotakso je videti, da ekstrakt CT zavira aktivacijo makrofagov. To je bilo potrjeno z njegovim zaviralnim delovanjem na NO in vitro in in vivo, ki je glavni vnetni mediator, ki ga proizvajajo makrofagi. Tako je lahko učinek ekstrakta CT na makrofage posledica supresije ekspresije mRNA in/ali neposredne inhibicije aktivnosti iNOS v teh celicah.

PGE2 je tudi eden glavnih vnetnih mediatorjev. Povečuje se vzporedno z edemom tkiva, ki ga zavirajo nesteroidna protivnetna zdravila, zaviralci COX. Karagenan lahko poveča proizvodnjo PGE2 z indukcijo mRNA COX-II in proteina COX-II v eksudatu vrečke. V tem modelu je karagenan znatno povečal količino PGE2 in je bil znatno zatrt z ekstraktom CT. Zanimivo je omeniti, da je bil ta rezultat skladen z učinkom, ki bi ga dosegli NSAID indometacin. Zato se iz rezultatov sklepa, da ima ekstrakt CT dodatne lastnosti nesteroidnih protivnetnih zdravil. Skupaj se domneva, da je izvleček CT v modelu vnetja, povzročenega s karagenanom, imel učinke, podobne kortikosteroidom in NSAID, in da je fukoidan okrepilprotivnetni učinki izvlečka CTz blokiranjem infiltracije vnetnih celic.

Čeprav opredelitev natančnega mehanizma delovanja zahteva nadaljnje študije, je mešanica fukoidana in izvlečka CT izrazito oslabila vnetne znake z blokiranjem poti TNF- –NO in COX-II–PGE2 pri vnetju zračnih mešičkov, ki ga povzroči karagenan. Te ugotovitve dokazujejo, da je lahko kombinirano zdravljenje s fukoidanom in ekstraktom CT obetaven kandidat za lajšanje različnih vrst vnetij, ki se odzivajo na kortikosteroide ali nesteroidna protivnetna zdravila.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPOVEDO VNETNIH BOLEZNI PHGS75% ECH 30% ACT 12%