Prednosti akteozida - zdravljenje glioblastoma

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

TAE WOONG HWANG;DONG HUN KIM; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN‑HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA‑JIN KIM

1. Uvod

glioblastomje najpogostejši tip malignega primarnega možganskega tumorja ter najbolj invaziven in uničujoč primarni možganski tumor (1,2), s srednjo stopnjo preživetja ~18 mesecev z agresivno multimodalno terapijo. Trenutne odločitve o zdravljenju so omejene in vključujejo obsevanje, kemoterapijo in operacijo v kombinaciji z alkilirajočim sredstvom temozolomidom (TMZ) (3,4). Kljub dostopnosti agresivnih terapij bolniki zglioblastomimajo na splošno slabo prognozo (5). TMZ je glavno kemoterapevtsko zdravilo, ki se uporablja pri kliničnem zdravljenju malignihglioblastom(6-8); kot alkilirajoče sredstvo v seriji lahko prodre skozi krvno-možgansko pregrado (9-11). Med napredovanjem malignega glioblastoma in obsežno invazijo po možganih stalno naraščajoča odpornost proti zdravilu na TMZ zmanjšuje njegovo terapevtsko učinkovitost (12,13). V skladu s tem nova terapevtska zdravila za boj protiglioblastomse nujno iščejo.

Prejšnje študije so poročale, da so celice glioma podvržene celični smrti z avtofagijo ali programirano celično smrtjo tipa II kot odziv na TMZ (14,15). Avtofagijo lahko zavira 3-metiladenin (3-MA) ​​s pretvorbo z mikrotubulom povezane beljakovine 1 lahke verige 3 (LC3)-I v LC3-II, s čimer se zmanjšaglioblastomcelična smrt (16,17); vendar je vloga avtofagije odvisna od celičnega konteksta. Z izjemo citotoksične vloge med delovanjem TMZ je indukcija avtofagije s celičnim stresom citoprotektivni proces, ki odpravlja s stresom povzročene citoplazemske agregate, organele in makromolekule v celicah sesalcev prek lizosomskega sistema. Po drugi strani celice, ki sodelujejo pri vzdrževanju homeostaze, prejemajo energijo prek teh katabolnih procesov (18,19). Kompleksne vloge avtofagije kažejo, da ima lahko aktivator avtofagije učinke proti raku v kombinaciji z zdravljenjem s TMZ tako, da induciraglioblastomcelično avtofagijo brez škodljivih učinkov ali zagotavljanja koristi normalnim tkivom. Treba je omeniti, da je TMZ pokazal sinergistične terapevtske učinke v kombinaciji z vitaminom D, vključno z zatiranim preživetjem celic in povečano avtofagijo vglioblastomcelice. Poleg tega se je pokazalo, da ima kombinacija TMZ in vitamina D učinke proti raku in vivo, vključno z zmanjšano velikostjo tumorja in podaljšano stopnjo preživetja. Te študije kažejo, da ima lahko kombinirano zdravljenje sinergistične učinke proti raku prek avtofagičnih mehanizmov pri TMZglioblastomterapija (15).

Akteozidje feniletanoidni glikozid, ki je široko razširjen v več tonificirajočih tradicionalnih kitajskih zeliščnih zdravilih (20, 21). Številni farmakološki učinki, vključno z antioksidativnim, protirakavim, protivnetnim, antinefritičnim in antimetastatskimakteozid(22-24). Prejšnje študije so to pokazaleakteozidima zaščitne učinke pred poškodbami jeter, ki jih povzročata ogljikov tetraklorid in D-galaktozamin. Mehanizmi, na katerih temeljijo zaščitni učinki akteozida, so verjetno povezani z njegovo sposobnostjo zaviranja bioaktivacije, ki jo posreduje P450, in učinkov lovljenja prostih radikalov, ki jih povzroči izpostavljenost ogljikovemu tetrakloridu (25, 26).

Zato dokazi kažejo, da obojeakteozidin TMZ inducirata učinke proti raku prek celične smrti. Vendar pa njihova povezanost in učinki proti raku v kontekstuglioblastomje treba še pojasniti. Zato je bil cilj te študije preveriti sinergistične učinke proti rakuakteozidv kombinaciji s TMZ vglioblastomterapija. Za analizo protirakavih učinkov kombiniranega zdravljenja v C6 je bil izveden test viabilnosti celicglioblastomcelice (podganaglioblastomcelične linije), rezultate pa primerjali s tistimi po zdravljenju samo s TMZ. Za nadaljnjo proučitev mehanizma celične smrti, ki jo povzroči sočasno zdravljenje zakteozidin TMZ, v celicah C6 so pregledali gene, povezane z apoptozo in avtofagijo.

akteozid proti tumorju

2. Materiali in metode

Celična kultura:

Podgana C6glioblastomcelična linija je bila kupljena pri American Type Culture Collection (Rockville, MD, ZDA). Celice smo gojili v sterilnih pogojih pri 37˚C v vlažnem okolju s 5 odstotki CO2 v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS) in 1 odstotkom antibiotikov in antimikotikov (vsi Welgene, Daegu , Koreja).

Rastlinski material:

Abeliophyllum distichum Nakai [vavčer št. Park1001(ANH)] je bil zbran v tematskem parku Misun-hyang, gorski rekreacijski gozd Seongbul-Mountain, Koreja.

Indukcija kalusa:

Za induciranje tvorbe kalusa (27) smo iz svežih rastlin izolirali 1-cm2 velike eksplantate listov. Eksplant smo gojili na gojišču Murachige in Skoog (4-odstotna saharoza, 0.9-odstotni agar z dodatkom 1 mg/l naftalenocetne kisline in 1 mg/l 2,4-diklorofenoksiocetne kisline, pH 5,7) pri 25˚C. Kalus je bil induciran 20 dni kasneje. Zadostna količinaakteozidje bil pridobljen s subkulturo za ločevanje in čiščenjeakteozidiz kalusa (slika 1). Različne serije prečiščenegaakteozidso bili uporabljeni v vsakem poskusu. Vsak poskus je bil izveden trikrat z uporabo druge serije.

Izolacija in čiščenje:

Frakcije etil acetata smo koncentrirali v vakuumu in uporabili kot vzorec za čiščenje akteozida.Akteozidje bil izoliran in prečiščen s sistemom pospešene kromatografske izolacije (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Švedska) z uporabo kartuš SNAP KPHOSPHO‑SIL in SNAP Ultra (Biotage). Theakteozidočiščen iz kalusa je bil kvantitativno analiziran z uporabo standardnega akteozida s HPLC-PDA analizo. Končno smo iz kalusa pridobili akteozid s čistostjo večjo ali enako 95 odstotkov in ga uporabili kot vzorec za kemoterapijo na osnovi temozolomida.glioblastom.

Test 3-(4,5-dimetiltiazol-2-l)-,5-difeniltetrazolijevega bromida (MTT):

Za identifikacijo polovične maksimalne inhibitorne koncentracije TMZ (vrednost IC50) proti celicam C6 smo 1 x 104 celic v enoceličnih suspenzijah zasejali v posamezne vdolbinice plošč s 96 vdolbinicami in jih inkubirali 24 ur pri 37 °C pred zdravljenjem s TMZ pri navedeni koncentracije (1, 5, 10 in 20 mM) pri 37 °C 24 ur. Po določitvi vrednosti IC50 TMZ kot 5 mm smo celice 24 ur obdelali s 5 mM TMZ, 50 µM.akteozidali kombinacijo obeh (5 mM TMZ in 50 µMakteozid). V vsako vdolbinico (10 µl) smo dodali raztopino MTT (5 mg/ml) in gojili 2 uri pri 37 °C. Nato smo medij odstranili in dodali DMSO v volumnu 200 µl vsakega ter reagirali pri sobni temperaturi 30 minut. Za določitev viabilnosti celic smo izmerili absorbanco pri 595 nm.

Test celjenja ran:

Suspenzijo celic C6 v 1 ml smo gojili v plošči z 12 vdolbinicami in gojili do konfluence. Celice smo obdelali s TMZ,akteozid, ali TMZ plusakteozidin nato opraskate s sterilno 10-µl konico pipete, da ustvarite umetno rano. Ob 0 in 24 urah po rani so bile z invertnim mikroskopom posnete digitalne slike procesa celjenja rane. Migracija celic je bila kvantificirana z merjenjem velikosti brazgotine pri 0 in 24 urah z uporabo programske opreme za analizo slike, programske opreme ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 (NIH, Bethesda, Maryland, ZDA). Vsak poskus smo izvedli trikrat, meritve pa v treh izvodih.

Imunobloting:

Celice C6 smo obdelali s TMZ,akteozid, ali TMZ plusakteozidza 24 ur. Celice so bile lizirane na ledu z liznim pufrom RIPA (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 odstotek Nonidet P-40, 1 odstotek natrijevega deoksiholata, 0,1 odstotka SDS). dopolnjeno s koktajlom zaviralcev proteaze in fosfataze (Roche, Basel, Švica) 30 min. Po centrifugiranju pri 18,341 xg 15 minut pri 4˚C smo dobili supernatant. Koncentracija beljakovin je bila določena s testi Bradford Protein Assays (Bio‑rad, Hercules, CA, ZDA). Enake količine skupnih beljakovin (30 µg) so bile naložene v posamezne vdolbinice in frakcionirane z elektroforezo preko 10-15-odstotnega SDS-PAGE. Proteini so bili elektrotransferirani na poliviniliden difluoridne membrane (EMD Millipore, Bedford, MA, ZDA). Po inkubaciji v blokirni raztopini, ki vsebuje 5 odstotkov nemastnega mleka v fiziološki raztopini pufra Tween/Tris, 30 minut pri sobni temperaturi. Blote so testirali z 1:1,000-razredčenimi primarnimi protitelesi (kat. št. 9662, kaspaza 3; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, ZDA), B0-celični limfom 2 (sc- 7382, Bcl-2), protein X, povezan z Bcl-2 (kat. št. 2772, Bax), fosforiliran (p-)p53 (sc-101762), skupni-p53 (sc-6243), ‑aktin (kat. št. 4970; vse; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, ZDA), LC‑3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija), Rab7 (kat. št. 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (kat. št. 114), p-p38 (kat. št. 9211), total-p38 (kat. št. 9212), p-c-Jun N-terminalna kinaza (kat. št. 9251, p ‑JNK), total-JNK (kat. št. 9252), p-ekstracelularna signalno regulirana kinaza (kat. št. 9101, p-ERK), total-ERK (kat. št. 9102; vse Cell Signaling Technology, Inc. .) čez noč pri 4˚C. Temu je sledila inkubacija s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s hrenovo peroksidazo (1:2, 000; LF-SA8001A, kozji protimišji IgG-HRP) ali LF-SA8002A (kozji anti-zajčji IgG-HRP), AB Frontier, Seul, Koreja.) 2 uri pri sobni temperaturi. Beljakovine smo nato vizualizirali z izpostavljenostjo Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ZDA).

Imunofluorescenčno barvanje:

Lizosomsko povezan membranski protein 1 (LAMP1) in LC3 sta markerja za lizosomsko in avtofagijo. Celice (1x105 celic/vdolbino) smo pripravili na steriliziranih steklenih pokrovnih stekelcih (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ZDA) v treh izvodih. Po zdravljenju s TMZ,akteozid, ali TMZ plusakteozid24 ur so bile celice fiksirane v 4-odstotnem paraformaldehidu 30 min, blokirane s 5-odstotnim normalnim piščančjim serumom (S-3000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, ZDA), 0,1-odstotnim Triton X -100 in nato inkubirali 1 uro za permeabilizacijo in za blokiranje nespecifičnih interakcij protein-protein. Celice smo nato inkubirali z anti-LAMP1 (1:200; sc-19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) in anti-LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, ZDA) čez noč pri 4˚ C. Celice smo nato dvakrat sprali s PBS in inkubirali dodatni 2 uri v temi z mešanico sekundarnih protiteles Alexa Fluor 488 in 594 (1:200; Alexa Fluor 488 (A-11008) in 594 (A-11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ZDA) in ponovno sprali s PBS. Jedra so bila obarvana s 4,6-diamidino-2-fenilindolom (Sigma; Merck KGaA) in nato dvakrat sprana s PBS. Diapozitivi so bili nato nameščeni in slike so bile zajete pod laserskim konfokalnim mikroskopom LSM‑700.

Slika 1. Kemijska zgradba akteozida.

Pretočna citometrija.

Celice so bile analizirane za Mitotracker Green in MitoSOX s pretočno citometrijo z uporabo pretočnega citometra FACSCanto II, kot je navedel proizvajalec (BD Biosciences). Po dveh izpiranjih s PBS so bile celice fiksirane v 4-odstotnem paraformaldehidu 30 min pri sobni temperaturi in permeabilizirane z 0,25-odstotnim Tritonom X-100 v PBS 20 minut. Celice smo obarvali s primarnimi protitelesi čez noč pri 4˚C (1:200) in nato s sekundarnimi protitelesi 1 uro na ledu. Po dveh izpiranjih s PBS so bile celice fiksirane v 4-odstotnem paraformaldehidu in takoj testirane. Podatki pretočne citometrije so bili zbrani z uporabo 10 000 celic in analizirani s programsko opremo FlowJo 7.6.1 (Tree Star, Inc., Ashland, Oregon, ZDA).

Statistična analiza:

Vsi podatki so bili analizirani z GraphPad Prism 5.0 in so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja. Podatki so bili analizirani z enosmerno analizo variance s Tukeyjevim post hoc testom večkratnih primerjav za primerjavo srednjih vrednosti med več skupinami. p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside: Anti-apoptoza

3. Rezultati

3.1 Sočasno zdravljenje s TMZ in akteozidnimi zaviralciglioblastomcelično proliferacijo in migracijo.

Kombinirano zdravljenje s TMZ inakteozidzavirajo sposobnost preživetja celic C6. TMZ je zmanjšal viabilnost celic na način, ki je odvisen od odmerka (slika 2A), medtem ko sam akteozid ni imel pomembnega učinka na nobeni ravni zdravljenja (slika 2B). Po 24-urni inkubaciji v gojišču, ki je vsebovalo TMZ z akteozidom ali brez njega, je bil opravljen test MTT za primerjavo citotoksičnosti različnih ravni zdravljenja. TMZ je pomembno zaviral viabilnost celic, medtem ko akteozid ni bistveno zaviral celične rasti. Kombinirano zdravljenje s TMZ in akteozidom je izrazito zmanjšalo viabilnost celic (slika 2C). Zdravljenje samo s TMZ ali akteozidom je zmanjšalo sposobnost celjenja ran (slika 3A). Razdalja rane (v odstotkih) je bila izmerjena z uporabo rezultatov, prikazanih na sliki 3A, s programsko opremo ImageJ. Razdalja do rane se je znatno povečala po kombiniranem zdravljenju (slika 3B) v primerjavi z vsakim posameznim zdravljenjem. Ti rezultati kažejo, da je bilo sočasno zdravljenje s TMZ in akteozidom učinkovit zaviralecglioblastomcelično proliferacijo in migracijo.

3.2 Akteozid in TMZ sinergistično vplivata na apoptozo v celicah C6.

Rezultati Western blot analize so pokazali, da so bile ravni razcepljene kaspaze-3, Bax in fosforiliranega p53 višje, ravni Bcl-2 pa nižje po kombiniranem zdravljenju s TMZ inakteozidkot po zdravljenju samo s TMZ (slika 4A).AkteozidV celicah C6, obdelanih s TMZ, so nato opazili delovanje mitohondrijev, ki jih posreduje, in nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS), ki so ključni mediatorji apoptotične signalizacije. Za preverjanje mitohondrijske mase je bila izvedena analiza razvrščanja celic, aktiviranih s fluorescenco, z uporabo MitoTracker Green. Sočasno zdravljenje s TMZ inakteozidpovzročilo večjo mitohondrijsko maso kot zdravljenje samo s TMZ (slika 4B). Nastajanje ROS je bilo bistveno večje po sočasnem zdravljenju s TMZ in akteozidom kot po zdravljenju s samim TMZ (slika 4C). Ti rezultati kažejo, da sta nastajanje ROS in mitohondrijska funkcija pomembni pri apoptozi, ki jo povzroči zdravljenje s TMZ in akteozidom. Sočasno zdravljenje s TMZ in akteozidom povzroči avtofagijo v celicah C6. Poročali so, da TMZ povzroča avtofagijo (28, 29); zato je ta študija proučevala, v kolikšni meri je bila avtofagija inducirana z zdravljenjem s TMZ in akteozidom. Celice C6 smo obdelali s TMZ z akteozidom ali brez njega; po 24 urah in celice smo obarvali za imunofluorescenco, da smo odkrili LAMP1 in LC3 kot označevalca avtofagije. Po kombiniranem zdravljenju so opazili višje ravni izražanja LAMP1 in LC3 (slika 5A). Raziskali so tudi ekspresijo beljakovin, povezano z avtofagijo, in ugotovili, da TMZ inducira pretvorbo LC3-I v LC3-II, kar je znak generiranja avtofagosomov. Po sočasnem zdravljenju s TMZ in akteozidom so opazili višjo stopnjo pretvorbe LC3-I v LC3-II kot pri zdravljenju s samim TMZ. Stopnje izražanja Rab7 in p62 so pokazale indukcijo avtofagije v celicah, obdelanih s TMZ (slika 5B). Te ugotovitve kažejo, da je sočasno zdravljenje s TMZ in akteozidom okrepilo avtofagični proces vglioblastomcelice.

3.3 Akteozid inducira izražanje genov na poti MAPK pri zdravljenju, ki temelji na TMZ.

Prejšnje študije so pokazale, da TMZ uravnava pot MAPK, vključno s p38, JNK in ERK (30). Zato je ta študija raziskala, aliakteozidvpliva na izražanje gena MAPK, povezano s TMZ. Celice C6 smo obdelali s TMZ z ali brezakteozid. Po 24 urah je zdravljenje s TMZ povzročilo višje ravni izražanja p-p38, p-JNK in p-ERK. Izražanje genov, ki jih regulira TMZ, je bilo po zdravljenju s TMZ in akteozidom bistveno večje kot pri zdravljenju s samim TMZ (slika 6). Ta opažanja kažejo na toakteozidvpliva na terapevtske mehanizme, ki temeljijo na TMZ, prek poti MAPK.

Akteozid protiglioblastom

Diskusija

Rezultati pričujoče študije kažejo, da kombinirano zdravljenje s TMZ zakteozidponuja terapevtski potencial zaglioblastomzdravljenja in predložiti dokaze, da je kemosenzibilizacija na kombinacijo TMZ inakteozidse lahko pojavi s povečanjem avtofagije. Kot mutacijaglioblastomcelice lahko povzročijo inaktivacijo apoptotične poti, indukcijo avtofagije s TMZ plusakteozidsočasno zdravljenje lahko predstavlja alternativno metodo zaglioblastomterapija. Vendar, ali je avtofagija edini mehanizem zaglioblastomzdravljenje s TMZ plusakteozidsočasno zdravljenje je treba še pojasniti.

Avtofagija je bistveni celični mehanizem za razgradnjo beljakovin in citoplazemskih organelov. Katabolična prednost inducirane avtofagije je lahko pomembna v stresnih razmerah; zato je lahko indukcija avtofagije prilagoditveni mehanizem za preprečevanje celične smrti (31–33). Prejšnje študije so poročale, da je zmanjšana avtofagija povezana z rakom (34–36). Poleg tega je več proteinov in signalnih poti, povezanih z avtofagijo, dereguliranih med maligno transformacijo, kar ima za posledico zmanjšanje avtofagne aktivnosti. Visoke ravni izražanja LC3 so bile povezane tudi s povečano stopnjo preživetja pri bolnikih zglioblastoms slabimi rezultati uspešnosti (37,38). Podobno rezultati te študije kažejo, da je lahko ponovna vzpostavitev normalne avtofagije latentna strategija zaglioblastomterapijo in lahko služi kot mehanizem za omejevanje nenormalne rasti tumorskih celic.

Pri normalni avtofagiji so določene citoplazemske komponente izolirane znotraj avtofagosomov, ki se nato spojijo z lizosomom, da se razgradijo in reciklirajo (39, 40). Ko je avtofagija povečana, hitrost tvorbe avtofagosomov presega stopnje lizosomske razgradnje; to stanje imenujemo avtofagični stres. Če se stres ali nenormalna avtofagija nadaljuje, lahko pride do celične smrti zaradi izčrpanosti energije ali sprememb v ravnovesju beclin-1/Bcl-2. Apoptozo lahko sproži tudi hiperaktivnost avtofagosoma, ki zajame citoplazemske organele, vključno z mitohondriji ali endoplazmatskim retikulumom (41). Predlagano je bilo, da lahko splošna avtofagija povzroči celično smrt med normalnim citoplazmatskim in organelnim prometom v zdravih celicah. V tem procesu se celica 'kanibalizira' od znotraj, kar je ključna značilnost programirane celične smrti tipa II. Čeprav mehanizmi, s katerimiakteozidkrepi terapevtski učinek zdravila na osnovi TMZglioblastomterapija še ni v celoti razjasnjena, so učinki proti raku, ki jih kaže kombinirano zdravljenje, preučeno v tej študiji, lahko povezani s temi avtofagičnimi mehanizmi.

Akteozidje feniletanoidni glikozid, pridobljen iz rastlin (22,26). Prejšnje študije so poročale o različnih bioloških aktivnostih akteozida. Spremembe ravni izražanja razcepljene kaspaze-3 in LC3 v tej študiji kažejo, da zdravljenje s kombinacijo TMZ inakteozidinducirano apoptozo in avtofagijo v celicah C6 (sliki 4 in 5). Dokazano je, da ima kombinirano zdravljenje sinergistični učinek naglioblastomcelice. Čeprav druge možne mehanizme teh sinergističnih učinkov še ni treba razjasniti, je ta študija indukcijo avtofagije opredelila kot ključni tumoricidni mehanizemakteozidkemosenzibilizacijo med zdravljenjem s TMZglioblastomterapija.

Acteoside zdravi glioblastom

Reference

1. Friedman HS, Kerby T in Calvert H: Temozolomid in zdravljenje malignega glioma. Clin Cancer Res 6: 2585-2597, 2000.

2. Mrugala MM in Chamberlain MC: Mehanizmi bolezni: Temozolomid inglioblastom– pogled v prihodnost. Nat Clin Pract Oncol 5: 476-486, 2008.

3. Agarwala SS in Kirkwood JM: Temozolomid, novo alkilirajoče sredstvo z aktivnostjo v centralnem živčnem sistemu, lahko izboljša zdravljenje napredovalega metastatskega melanoma. Onkolog 5: 144-151, 2000.

4. Stevens MF, Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig GU, Lunt E in Newton cG: Protitumorski imidazotetrazini. 1. Sinteza in kemija 8-karbamoil-3-(2-kloroetil)imidazo[5,1-d]-1,2,3, 5-tetrazin-4(3H)-ona, novega protitumorskega zdravila širokega spektra agent. J Med Chem 27: 196-201, 1984.

5. Fulda S: Zdravljenje na podlagi celične smrtiglioblastom. Celična smrt dis 9: 121, 2018.

6. Chen PH, Shen WL, Shih CM, Ho KH, Cheng CH, Lin CW, Lee CC, Liu AJ in Chen KC: CHAC1-inhibirana pot Notch3 je vključena v citotoksičnost glioma, ki jo povzroča temozolomid. Nevrofarmakologija 116: 300-314, 2017.

7. Oshiro S, Tsugu H, Komatsu F, Ohmura T, Ohta M, Sakamoto S, Fukushima T in Inoue T: Učinkovitost zdravljenja s temozolomidom pri bolnikih z gliomom visoke stopnje. Anticancer Res 29: 911-917, 2009.

8. Van den Bent MJ: Adjuvantno zdravljenje gliomov visoke stopnje. Ann Oncol 17 (dodatek 10): x186-x190, 2006.

9. Shen W, Hu JA in Zheng JS: Mehanizem protitumorskih učinkov temozolomida na celice glioma. J Int Med Res 42: 164-172, 2014.

10. Barciszewska AM, Gurda D, Głodowicz P, Nowak S in Naskręt‑Barciszewska MZ: Nov epigenetski mehanizem delovanja temozolomida v celicah glioma. PLoS One 10: e0136669, 2015.