Sinergistična imunost in zaščita pri miših s sočasno imunizacijo s cepivi DNA, ki kodirajo protein Spike in druge strukturne proteine ​​SARS-CoV-2

Povzetek:Pojav novih različic koronavirusa 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS CoV-2) je povzročil ponavljajoče se izbruhe okužb po vsem svetu. Te zelo mutirane različice zmanjšujejo učinkovitost trenutnih cepiv proti koronavirusni bolezni 2019 (COVID-19), ki so zasnovana tako, da ciljajo samo na beljakovino spike (S) prvotnega virusa. Razen za S SARS-CoV-2 je imunozaščitni potencial drugih strukturnih proteinov (nukleokapsida, N; ovojnice, E; membrane, M) kot tarčnih antigenov cepiva še vedno nejasen in vreden preiskave. V tej študiji so razvili cepiva s sintetično DNK, ki kodirajo štiri strukturne proteine ​​SARS-CoV-2 (pS, pN, pE in pM), miši pa so imunizirali s tremi odmerki z intramuskularno injekcijo in elektroporacijo. Predvsem je sočasna imunizacija z dvema DNA cepivoma, ki izražata proteina S in N, povzročila višja nevtralizirajoča protitelesa in je bila učinkovitejša pri zmanjševanju virusne obremenitve SARS-CoV-2 kot sam protein S pri miših. Poleg tega je sočasna imunizacija pS s pN ali pE + pM povzročila višjo celično imunost, specifično za protein S, po treh imunizacijah in povzročila blažje histopatološke spremembe kot samo pS po izzivu. Vlogo ohranjenih strukturnih proteinov SARS-CoV-2, vključno z proteini N/E/M, je treba nadalje raziskati za njihovo uporabo pri načrtovanju cepiv, kot so cepiva mRNA.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Ključne besede: COVID-19; SARS-CoV-2}}; ko-imunizacija; DNK cepivo; spike protein; strukturni protein

1. Uvod

Koronavirus 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV-2) je vzrok za koronavirusno bolezen 2019 (COVID-19), ki je povzročila milijone okužb in smrti po vsem svetu ter ogrozila zdravje ljudi in svetovno gospodarstvo . Čeprav učinkoviti terapevtski pristopi še vedno niso na voljo, so hitro napredovali, vključno z uporabo celične terapije CAR-T in nanotehnologije [1,2]. Cepljenje je učinkovit način za obvladovanje pandemije in različni regulativni zdravstveni organi so odobrili uporabo več cepiv [3,4]. Genom koronavirusa kodira štiri glavne strukturne proteine, in sicer proteine ​​konice (S), nukleokapside (N), membrane (M) in ovojnice (E), ki so odgovorni za sestavljanje viriona in zatiranje imunskega odziva gostitelja [5]. ]. Protein S je sestavljen iz 1273 aminokislinskih ostankov, ki vsebujejo dve podenoti, in sicer S1 in S2. Posreduje vstop virusa in je glavna tarča za razvoj cepiv proti koronavirusu [6–11]. Vendar pa ima protein SARS-CoV-2 S visoko frekvenco mutacij. Ni presenetljivo, da je pri SARS-CoV-2, virusu RNA, mutacija stalna in neizogibna. Od septembra 2020 se je pojavilo pet zaskrbljujočih različic SARS-CoV-2 (VOC), vključno z B.1.1.7 (UK, alfa), B.1.351 (Južna Afrika, beta), P.1 (Brazilija, Gama), B.1.617.2 (Indija, Delta) in B.1.1.529 (Južna Afrika, Omicron) (Andreano in Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Vsi imajo več mutacij v proteinu spike [12]. Te različice ogrožajo učinkovitost trenutnih cepiv proti COVID-19, ki so zasnovana tako, da ciljajo samo na koničast protein.

Protein N virusa SARS-CoV-2 se veže na virusno RNA prek 140-aminokislinske vezne domene RNA v njihovem jedru na način "kroglice na vrvici". Med koronavirusi je zelo ohranjen, saj ima približno 90-odstotno zaporedno identiteto s SARS-CoV in je tudi edini strukturni protein znotraj viriona [13]. Poleg tega ima pomembno vlogo pri pakiranju virusne RNA v ribonukleokapsidni kompleks in je potreben za replikacijo virusne RNA, sestavljanje viriona in sproščanje iz gostiteljskih celic [14]. Na podlagi velike podobnosti zaporedja proteina N v koronavirusih se lahko predlaga kot tarča cepiva za navzkrižno zaščito. Prej smo ugotovili, da sočasna imunizacija z dvema DNA cepivoma, ki izražata proteina E in M, zagotavlja delno zaščito pred SARS-CoV-2, zato je treba to metodo upoštevati med razvojem cepiva [15]. Odvisno od okvirnega dokumenta WHO običajno obstaja sedem strategij za kandidate za cepivo proti SARS-CoV-2, ki jih je mogoče nadalje razdeliti v tri kategorije: prva, cepiva na osnovi beljakovin, vključno s cepivi proti inaktiviranim virusom, virusu podobna cepiva. cepiva proti delcem in proteinskim podenotam; drugič, cepiva na osnovi genov, vključno s cepivi, vektorskimi virusi, DNA cepivi in ​​mRNA cepivi; tretjič, kombinacija pristopov, ki temeljijo na beljakovinah in genih, kot so cepiva z živimi oslabljenimi virusi. Tehnologije DNK kot nove strategije cepiv, ki temeljijo na genih, lahko med predkliničnim testiranjem hitro primerjajo več možnih cepiv in strategij [16,17]. Teoretično so skoraj vsi virusni proteini potencialni imunogeni in tarče cepiva. Vendar kolikor nam je znano, imunogenost in zaščitni potencial sintetičnih cepiv DNA pri kodiranju proteinov SARS-CoV-2 S in drugih strukturnih proteinov še ni sistematično poročan. Štiri cepiva DNA, ki izražajo SARS-CoV-2 proteine ​​S, N, E in Ml, so ocenili glede njihove imunogenosti in zaščitne učinkovitosti pri miših, da bi raziskali imunološke učinke S v kombinaciji z drugimi strukturnimi proteini.

2. Materiali in metode

2.1. Celice

Celice Huh7.5 in celice 293T ledvice človeškega zarodka so bile skozi študijo gojene pri 37 ◦C v vlažni atmosferi pri 5 % CO2. Celice smo gojili v mediju DMEM (HyClone, Logan, UT, ZDA), dopolnjenem z 10% FBS (GEMINI Co., Šanghaj, Kitajska) in 1% penicilin-streptomicina (Gibco, New York, NY, ZDA). Vse celične linije so bile potrjeno negativne glede kontaminacije z mikoplazmo.

2.2. Izdelava DNK cepiv, ki kodirajo SARS-CoV-2 S/N/E/M

Gen za kodiranje proteina SARS-CoV-2 S/N, ki vsebuje N-terminalno zaporedje Kozak (GCCACC), ki mu sledi iniciacijski kodon (ATG), je bil sintetiziran z uporabo kodona, optimiziranega za sesalce (GenScript Co., Nanjing). , Kitajska). Nato je bilo klonirano v ekspresijski vektor pcDNA3.1 (+) preko razgradnje EcoRI in XbaI in poimenovano pS/pN (DNA cepiva) (slika 1A). Protein pE/PM je bil konstruiran in identificiran, kot je opisano prej [15]. Cepiva so bila pripravljena z uporabo kompletov Maxiprep brez endotoksinov (Qiagen, Peking, Kitajska), zaporedja pa so bila potrjena s sekvenciranjem Sangerjeve DNA. Ekspresija proteina S/N je bila potrjena z uporabo Western blottinga in protiteles anti-S (Sino Biological, Peking, Kitajska)/anti-N, razredčenih pri 1:1000. Ti poskusi so bili izvedeni, kot je opisano prej [15,18].

Slika 1. Zasnova in izražanje konstruktov beljakovinskega cepiva SARS-CoV-2 S/N na osnovi rekombinantne DNA. (A) Shematski diagram cepiv na osnovi rekombinantne DNA, ki kodirajo SARS-CoV-2 spike (PS), nukleokapsid (pN), ovojnice (pE) in/ali membranske (PM) proteine. (B) Ekspresija ciljnega proteina v DNA cepivih je bila potrjena z Western blot analizo celic 293T, transficiranih s plazmidi pS/pN/pE/pM.

2.3. Imunizacija in izziv

Samice miši BALB/c (Charles River Laboratories, Francija) pri starosti 6 tednov so bile nameščene na Nacionalnem inštitutu za zdravje pri delu in nadzor zastrupitev v okolju z nadzorovano temperaturo 21 °C in vlažnostjo z 12-urnimi cikli svetloba/tema. Medtem sta bili hrana in voda zagotovljeni ad libitum, vse poskuse na živalih pa je odobril Odbor za etiko poskusov na živalih kitajskega centra za nadzor in preprečevanje bolezni (China CDC). Raziskava je potekala v skladu z ustreznimi etičnimi predpisi.

Miši smo naključno razdelili v pet skupin in jih imunizirali samo s pS/pN ali sočasno imunizirali s pS + pN ali pS + pE + PM na dneve 0, 21 in 42 z intramuskularno injekcijo in elektroporacijo (35 mg/50 mL) (slika 2) [19,20]. Na kratko, DNA cepiva so bila vbrizgana v mišico tibialis anterior (TA) in takoj impulzirana z elektriko z uporabo 5 mm narazen dvoigelne elektrode (ECM830; BTX) z iglami. Serume miši smo zbrali za analizo humoralnega imunskega odziva in mišje vranice smo obdelali za merjenje celičnega imunskega odziva (slika 2).

Slika 2. Shema imunizacije in izziva SARS-CoV-2. Časovni potek cepljenja, izzivov in odvzem krvi/tkiva. BALB/C miši so bile naključno razdeljene v skupine.

Poskusi izziva SARS-CoV-2 so bili izvedeni, kot je opisano prej [15,21]. Na kratko, miši smo anestezirali in nato transducirali intranazalno z 2,5 × 108 PFU Ad5-hACE2 v skupnem volumnu 45 µL. Pet dni po transdukciji so bile miši anestezirane in nato intranazalno izzvane z 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) v skupni prostornini 50 µL fiziološke raztopine. medpomnilnik. Vse delo z živim SARS-CoV-2 na mišjih modelih je bilo opravljeno v laboratorijih 3. stopnje biološke varnosti živali (ABSL-3).

2.4. Encimski imunosorbentni test

Encimsko vezani imunosorbentni testi (ELISA) so bili izvedeni, kot je opisano prej [15]. Na kratko, proteini S (kupljeni pri Sino Biological)/N (darilo podjetja Song), razredčeni v karbonatnem pufru (0.1 M, pH 9,6), so bili prevlečeni na 96-plošče z vdolbinicami EIA/RIA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) čez noč pri 4 ◦C. Plošče smo blokirali z 200 µL 10% kozjega seruma v PBS pri 37 °C 2 uri, čemur je sledilo petkratno pranje s PBST. Nato smo dodali vzorce seruma, serijsko razredčene v 2% kozjem serumu v PBS, in inkubirali 2 uri pri 37 °C, čemur je sledilo pet izpiranja s PBST. HRP-konjugirano kozje anti-mišje IgG Ab (1:5000) je bilo dodano pri 37 °C za 1 uro. V vsako vdolbinico smo dodali skupaj 100 µL substrata TMB in ga pogasili s 50 µL 2M H2SO4. Absorbanco smo odčitali pri valovni dolžini 450 nm z uporabo SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, Kitajska).

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

2.5. Okužba s psevdovirusi in poskusi nevtralizacije

Test nevtralizacije psevdovirusa je bil izveden, kot je opisano prej [21, 22]. Plazmid, ki izraža protein S prednikov virusa, je bil predhodno konstruiran [22]. Sintetiziran je bil gen za spike protein različice Omicron SARS-CoV-2 (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (darilo Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kitajska) z uporabo kodona, optimiziranega za sesalce, in kloniran v vektor pcDNA3.1, kot je opisano prej [22]. Na kratko, plazmidi, ki izražajo luciferazni reporter, in plazmidi, ki izražajo protein S, so bili sotransfektirani v celice HEK 293T z uporabo reagenta za transfekcijo X-treme GENE HP DNA. Celično kulturo smo osvežili 6 ur po transfekciji in supernatant, ki vsebuje psevdovirus, smo pobrali po 48 urah in shranili pri -70 °C. V testu nevtralizacije psevdovirusa je bila nato enaka mešanica seruma in virusa inkubirana pri 37 volumnih supernatanta, ki vsebuje psevdovirus, in nato dodana razredčenemu serumu. ◦C 1 uro. Gojišča celic Huh7.5 smo nato nadomestili s 100 µL mešanice seruma in virusa in jih inkubirali pri 37 °C 12 ur. Celice, gojene samo s psevdovirusi SARS-CoV-2, so izvajali vzporedno. Gojišča smo nato zamenjali z DMEM (2% FBS) in inkubacijo inkubirali pri 37 °C 48 ur. Nato smo izmerili signal luciferaze z uporabo kompleta za luciferazo kresnic Bright-Glo (Promega).

2.6. SARS-CoV-2 nevtralizacijski test

V tem poskusu je bil uporabljen SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Na kratko, serume smo dvakrat razredčili od začetne razredčitve 1:10, zmešali z enakim volumnom (10–15 pfu/jamico) živega SARS-CoV-2 in inkubirali 1 uro pri 37 ◦C, nato pa so jih dodali zasejanim celicam Vero. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C so opazili citopatski učinek (CPE) in zbrali 100 µL supernatanta kulture za ekstrakcijo nukleinske kisline in PCR z reverzno transkripcijo fluorescence v realnem času (RT-PCR). Srednji nevtralizacijski odmerek (ND50) je bil izračunan z uporabo metode Reed–Munch [15].

2.7. IFN-ELISpot test

Peptidne skupine, ki obsegajo celotno beljakovino S/N/E/M kot zaporedne 15-mere, ki se prekrivajo z 10 aminokislinami, je sintetiziral Scilight Biotechnology, LLC. Na vialo je bilo prisotnih približno 2,5 mg vsakega očiščenega peptida v peptidnem bazenu. Poskus je bil izveden, kot je opisano prej [18]. Na kratko, 96-plošče z vdolbinicami (BD ELISPOT Set, ZDA) so bile prevlečene z anti-IFN-zajemnim protitelesom in inkubirane čez noč pri 4 ◦C. Plošče smo po trikratnem izpiranju blokirali s popolnim gojiščem. Splenocite smo pobrali po evtanaziji miši 35. dan in 120 svežih enoceličnih suspenzij iz vsake skupine nasadili pri 5 × 106 na jamico in dodali peptide. Plošče smo nato 22 ur inkubirali pri 37 °C v 5 % CO2 in detektirali z bralnikom plošč ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, ZDA). Enota za oblikovanje točk (SFU) predstavlja IFN-, ki izloča celice T.

2.8. Vrednotenje zaščite pri miših po izzivu SARS-CoV-2

Poskusi so bili izvedeni, kot je opisano prej [15,21]. Na kratko, pljuča so bila pobrana po evtanaziji miši. Polovica tkiv je bila uporabljena za ekstrakcijo nukleinske kisline, fluorescenčno RT-PCR v realnem času in TCID50. Druga polovica je bila poslana na Visoko šolo za veterinarsko medicino Kitajske kmetijske univerze za patološko oceno.

2.9. Statistična analiza

Neparni t-testi, dvosmerni testi ANOVA in Dunnettov test večkratnih primerjav so bili izvedeni z uporabo GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-vrednosti < 0.05 so veljale za statistično pomembne (* p < 0.05; ** p < 0,01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Rezultati

3.1. Karakterizacija DNA cepiv

Ravni beljakovin E in M ​​so bile odkrite z uporabo Western blottinga. Z Western blot analizo smo izmerili ekspresijo kodiranih S/N/E/M proteinov SARS-CoV-2 v HEK-293T celicah, transficiranih s plazmidi pS/pN/pE/pM, z uporabo anti -S/anti-N protitelesa in anti-6 x His protitelesa v celičnih lizatih. Trakovi so se približali predvideni molekulski masi proteinov S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) in M ​​(22–25 kDa) (slika 1B).

3.2. Močna in trajna proizvodnja anti-S in/ali anti-N IgG, inducirana s pS in/ali pN DNA

Serum cepiv smo zbrali pri miših BALB/c po 35, 56, 96 in 120 dneh (slika 2). Ravni anti S/anti-N IgG so bile odkrite z ELISA testom. Velikost S- ali N-specifičnega odziva IgG, induciranega s pS ali pN, je bila povečana v serumu po prvem in drugem povečanju. Titri anti-S in anti-N IgG so bili višji v skupini pS + pN kot v drugih skupinah; vendar razlika ni bila statistično značilna (slika 3A, B). Zaznanih ni bilo močnih protitelesnih odzivov, specifičnih za beljakovine E/M, kar je skladno z rezultati prejšnje študije (podatki niso prikazani) [15].

Slika 3. Odzivi celic B na SARS-CoV-2 pri miših BALB/c. (A) Titri končne točke vezave IgG v serumu za SARS-CoV-2 S (A) in N proteina (B). (C) Nevtralizacijski titri so bili določeni na podlagi sistema psevdotipiziranega virusa SARS-CoV-2. (D) Nevtralizacijski titri proti SARS-CoV-2 so bili določeni z uporabo virusa SARS-CoV-2. (E) Test nevtralizacije, ki temelji na psevdotipiziranem virusnem sistemu SARS-CoV-2 Omicron. Prikazana so inhibicijska razmerja za serume iz lažnih (modrih), pS (rdečih), pS + pN (zelenih), pS + pE + pM (roza) in pN (oranžnih) skupin. Vrstice napak predstavljajo SEM, p-vrednosti pa so bile izračunane z dvosmerno ANOVA in Sidakovo post hoc analizo, kjer * p < 0.05

3.3. Visoke ravni nevtralizirajočih protiteles, ki jih povzroči sočasna imunizacija s cepivi pS in pN

Nevtralizirajoče titre serijsko razredčenih vzorcev seruma so določili s psevdotipiziranim virusom SARS-CoV-2. Najvišje ravni nevtralizirajočih protiteles (nAbs) so opazili v skupini pS + pN, pri čemer so recipročni geometrični povprečni titri EC50 dosegli 2988 (na 35. dan) in 3578 (na 56. dan) (slika 3C). Podobne rezultate so opazili s testom mikronevtralizacije živega virusa (MN), pri čemer so bile ravni nAbs v skupini pS + pN višje od tistih v skupini S 56. in 96. dan (p < 0.05; slika 3D). Poleg tega so bile ravni nAbs v skupini pS + pN 56. dan (druga okrepitev) znatno višje od tistih 35. dan (p <0,05; slika 3D).

Nevtralizacijsko aktivnost vsakega režima cepljenja proti različici SARS-CoV-2 Omicron so dodatno določili z uporabo psevdotipizirane platforme in vzorcev seruma. Nevtralizacijski profil proti virusu Omicron 35. in 56. dan je bil podoben kot proti virusu prednikov (slika 3E), kar nakazuje, da je imelo zdravljenje s PS + pN navzkrižno nevtralizacijsko moč.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

3.4. T-celični odzivi, ki jih povzroči cepljenje z DNA

Kot je bilo že opisano, so bili odzivi celic T proti antigenom SARS-CoV-2 S/N/E/M ocenjeni z uporabo IFN-ELISpot, kot je opisano prej [15]. Kot je bilo pričakovano, sta režima PS + pN in pS + pE + pM povzročila znatno višje ravni celic IFN + T, specifičnih za protein S, 12. dan 0 kot 35. dan (p < 0. 05; slika 4A). Poleg tega je bilo število celic IFN + T, specifičnih za protein N, na dan 120 (druga okrepitev) bistveno večje kot na dan 35 v skupini s pS + pN (p <0,05; slika 4B). Nazadnje je bilo število celic IFN + T, specifičnih za protein M, na 120. dan (druga okrepitev) v obeh skupinah bistveno večje kot na 35. dan (p < 0,05; slika 4D).

Slika 4. Odzivi celic T na posamezne strukturne proteine ​​SARS-CoV-2 pri miših BALB/c. (A) Odzive celic T so izmerili z uporabo IFN-ELISpot v splenocitih, stimuliranih 20 h s prekrivajočimi se peptidnimi skupinami, ki zajemajo SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, in (D) M proteini. Vrstice predstavljajo povprečje ± SD. Statistične analize so bile izvedene z uporabo dvosmerne ANOVA in Sidakovega post hoc testa, kjer * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 in **** p < 0,0001.

3.5. Sinergistična zaščita, povzročena s sočasno imunizacijo s pS/pN ali pS/pE/pM

Nato smo ovrednotili zaščitno učinkovitost cepiv DNK z uporabo miši hACE2, imuniziranih po izzivu z virusom prednikov SARS-CoV-2. Po izzivu so miši v lažni skupini pokazale postopno hujšanje. V nasprotju s tem so miši, imunizirane s pS ali pS+, pokazale blago izgubo teže takoj po okužbi, čemur je sledilo okrevanje (slika 5A). Pri miših, cepljenih s pS, pS + pN ali pS + pE + pM, niso odkrili živega virusa. Poleg tega je cepljenje s pS + pN bistveno zmanjšalo število kopij virusne RNA v primerjavi s tistimi, pridobljenimi samo s cepljenjem s pS (p=0.0228; slika 5B). Poleg tega je histopatologija pljuč pokazala, da so miši tako v lažni kot pN skupini pokazali žariščne lise vnetja, plevralno invaginacijo, alveolarni kolaps, visoko stopnjo infiltracije vnetnih celic in hemoragična področja. Za primerjavo so miši, zdravljene s pS + pN ali pS + pE + pM, pokazale blažje histopatološke spremembe in nižje rezultate INHAND po izzivu kot druga skupina (slika 5C).

Slika 5. Zaščitna učinkovitost imunizacije po izzivu z živim virusom SARS-CoV-2. (A) Miši smo stehtali dnevno (povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM), n=4) tri dni po izzivu. (B) Titer infektivnega SARS-CoV-2 v homogenatih pljuč tretji dan po izzivu, kot je bilo ugotovljeno s testom TCID5{{10}} in številom kopij RNA. Statistično pomembne razlike med skupinami so bile določene z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Dunnettov večkratni primerjalni popravek (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 in **** p < 0,0001). (C) Histopatološka analiza pljuč z barvanjem H&E.

4. Razprava

V tej študiji je sočasna imunizacija z dvema DNA cepivoma, ki izražata proteina S in N, povzročila visoke ravni nAbs in je bila zelo učinkovita pri zmanjševanju virusne obremenitve SARS-CoV-2 pri miših. Cepiva DNA, ki izražajo protein S, so po treh imunizacijah, ko so bile miši sočasno imunizirane z N/E in M ​​proteini, inducirala povečane ravni celične imunosti, specifične za protein S, in ublažila histopatološke spremembe po izzivu. Kolikor nam je znano, je to prvo poročilo, ki razkriva sinergistično izboljšanje imunosti in zaščite pri miših, ki uporabljajo cepivo DNA, ki kodira protein S, ko so sočasno imunizirane s cepivi DNA, ki kodirajo druge strukturne proteine ​​SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

V več študijah so opazili imunodominantne epitope B-celic v regijah antigena N. Cepiva na osnovi dušika običajno ne morejo inducirati nAbs, verjetno zato, ker protein N ni prikazan na površini virusa. Predvsem je sočasna imunizacija s proteinoma S in N povzročila višje ravni nAbs proti virusu prednikov in virusu Omicron SARS-CoV-2 kot druge skupine. Povečani odzivi nAb so povezani z boljšim očistkom virusa in zaščitno učinkovitostjo. Naši rezultati so pokazali, da je bilo zdravljenje s pS + pN pri zmanjševanju virusne obremenitve SARS-CoV-2 po izzivu učinkovitejše kot samo zdravljenje s pS. Prejšnja študija je poročala, da so bili hrčki, imunizirani s cepivom, ki sočasno izraža proteina M in N, zaščiteni pred hudo izgubo teže in pljučno patologijo ter so imeli znatno znižane virusne titre v orofarinksu in pljučih po okužbi s SARS-CoV-2, kar je skladno z našimi rezultati [23]. Na žalost zmanjšanja titrov virusa ni mogoče posebej pripisati proteinu M ali N, ravni nAb pa v tej študiji niso bile ocenjene. Ena študija mRNA cepiva SARS-CoV-2 je poročala, da je sočasna imunizacija S + N povzročila povečan S-specifičen odziv T-celic CD8+ in aktivnost nevtralizirajočih protiteles, kar je zagotovilo boljšo zaščito v pljučih pred Delto različico v primerjavi s samim S, kar je skladno z rezultati te študije [24]. Druga študija je poročala, da je protein N transmisivnega koronavirusa gastroenteritisa spodbujal sintezo nevtralizirajočih protiteles, ko so bile prašičje celice TGEV-IMMUNE stimulirane s kombinacijo proteinov S in N in vitro, ta učinek pa bi lahko razložili z odzivom T-limfocitov pomočnikov na protein N [25].

Imunodominantni CD4+/CD8+ T-celični epitopi v regijah N-antigena so bili identificirani že prej. Več študij je poročalo, da cepiva, ki temeljijo na proteinu SARS-CoV-2 N, učinkovito inducirajo celični imunski odziv. Skupina S + N je po treh imunizacijah pokazala povečane ravni celične imunosti, specifične za protein S. Ena študija mRNA cepiva SARS-CoV-2 je poročala, da je kombinacija S + N povzročila povečan za S specifičen odziv T-celic CD8+ v primerjavi s samim S, kar je skladno z našimi rezultati [24]. Druga študija je poročala, da so bili odzivi T-celic na antigene S in N po samem prvem cepljenju z dvojnim antigenom hAd5 S + N enakovredni odzivom predhodno okuženih bolnikov s SARS-CoV-2- in in silico napovedovalnih modelov T-celic vezava epitopa HLA je pokazala, da bodo odzivi T-celic na cepivo hAd5 S + N ohranili svojo učinkovitost proti različici B.1.351. Poleg tega je plazma bolnikov, ki so bili predhodno okuženi s SARS-CoV-2-, pokazala večjo vezavno afiniteto na celice, ki izražajo konstrukt S-Fusion + N-ETSD z dvojnim antigenom, kot na samo hAd5 S-Fusion, kar še dodatno nakazuje, da je imunogenost Cepivo z dvojnim antigenom S + N je boljše od cepiva z enim antigenom S [26].

Živega virusa niso odkrili v pljučih in izguba teže po izzivu je bila ublažena v skupinah pS, pS + pN in pS + pE + pM, medtem ko zdravljenje s pN ni učinkovito zmanjšalo titra virusa. Te ugotovitve poudarjajo nepogrešljivost in učinkovitost proteina S kot tarče cepiva. Predvsem je imela sočasna imunizacija s pS in pN boljše učinke kot pS ali pN na očistek virusa. Skupina pS + pE + pM je pokazala manj histopatoloških sprememb v pljučih, kar je skladno z rezultati naše prejšnje študije [15]. Skupina S + N je imela malo kopij virusne RNK v pljučih, zmanjšano izgubo teže in hiter čas okrevanja po izzivu SARS-CoV-2 v primerjavi s skupino, imunizirano samo s S/N, kar je bilo skladno s rezultate te študije. Vendar pa nobena od skupin ni zaznala titrov nevtralizirajočih protiteles, kar bi lahko razložili z razlikami v raznolikosti cepiva in poskusnih živalih [26]. Ena študija vektorskega cepiva proti adenovirusu SARS-CoV-2 je poročala, da je cepivo S zagotovilo akutno zaščito možganov samo ob sočasni imunizaciji s cepivom N [27]. Druga študija je razvila cepiva Tri: ChAd, Bi: ChAd in Mono: ChAd, ki izražajo proteine ​​S1/N/RdRp, N/RdRp oziroma S1, in jih testirala na živalskem modelu B.1.351. Pri Mono: ChAdlungs so opazili obsežno grobo patologijo, medtem ko so bila pljuča Bi: ChAd in Tri: ChAd videti skoraj brez te patologije [28].

Poleg tega so imele necepljene živali visoko virusno obremenitev v pljučih, medtem ko je zdravljenje s Tri: ChAd bistveno zmanjšalo virusno obremenitev za 3,5 log. Za primerjavo sta obe cepivi Bi: ChAd in Mono: ChAd le zmerno zmanjšali virusno breme. Ti rezultati kažejo, da je lahko zaščitni učinek cepiva z dvojnim antigenom S/N proti različicam boljši kot pri cepivu z enim antigenom S, kar je skladno z našimi rezultati [28]. Nekaj ​​študij je poročalo, da se pri miših, imuniziranih z beljakovinami N, po okužbi s SARS-CoV pojavi hudo vnetje pljuč [29–31]. Prejšnje študije so tudi poročale, da imunizacija z adenovirusnim vektorskim cepivom, ki izraža N protein virusa mišjega hepatitisa, ščiti miši pred smrtonosno okužbo, kar dokazuje, da lahko N protein ustvari zaščitni učinek [32]. Poleg tega je imela skupina, imunizirana s cepivom CRT/N DNA, znatno zmanjšan virusni titer po izzivu, pri čemer je virus vakcinije izražal protein SARS-CoV N [33].

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Ena študija o proteinu S je pokazala, da kombinirano cepivo DNA/protein bolje inducira humoralno in celično imunost kot samo cepivo DNA/protein [8]. Cepiva, ki ciljajo samo na protein S, so pokazala zmanjšano učinkovitost pri zaščiti pred blagim do zmernim COVID-19, ki ga povzročajo nastajajoče različice. Vloge ohranjenih strukturnih proteinov SARS-CoV-2, vključno z proteini N/E/M, so vredne pozornosti pri načrtovanju in uporabi cepiv, saj mutacije na splošno ne vplivajo na odzive T-celic, ki jih povzroči cepivo proti ohranjenim epitopom. . Ena študija je poročala, da imajo bolniki, ki so preboleli SARS (n=23), 17 let po izbruhu leta 2003 še vedno dolgotrajne spominske celice T, ki so reaktivne na protein SARS-CoV N, ki je pokazal močno navzkrižno reaktivnost na SARS CoV{ {15}} N protein, ki dodatno potrjuje uporabo N proteina kot navzkrižne zaščitne tarče cepiva [34]. Ta študija je pokazala, da je sočasna imunizacija pS/pN povezana z višjimi odzivi nAb, boljšim očistkom virusa in izboljšanimi celičnimi imunskimi odzivi ter lahko zagotovi boljšo zaščito po izzivu SARS-CoV-2 v primerjavi s samim pS. Poleg tega se je pokazalo, da različice SARS-CoV-2 okužijo številne živalske vrste, pri nekaterih divjih živalih in hišnih ljubljenčkih pa so opazili prenos s človeka na žival [7]. Veterinarskemu cepivu SARS-CoV-2 je torej treba posvetiti več pozornosti. Poleg tega je lahko nanotehnologija močno orodje pri optimizaciji cepiv in je vredna več pozornosti [2].

Ta študija ima več omejitev. Prvič, opazili smo le strategijo cepiva DNA pri miših BALB/c, prihodnje študije pa bi morale oceniti imunogene učinke teh režimov cepljenja na drugih živalskih modelih. Drugič, potrebne so dodatne raziskave za popolno razumevanje molekularnih mehanizmov, na katerih temeljijo povečani nAb- in S-specifični odzivi CD8 T-celic, ki jih povzroči soimunizacija z uporabo proteinov S in N, in za izkoriščanje tega znanja za optimizacijo COVID-19 oblikovanje cepiva. Nazadnje, funkcija protiteles, specifičnih za N protein, si zasluži nadaljnjo študijo.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Na koncu je ta študija ocenila imunsko-zaščitni potencial sočasne imunizacije s proteini SARS-CoV-2 S, N, E in M. Več cepiv, ki ciljajo samo na protein S, imajo zmanjšan zaščitni učinek na nastajajoče variantne seve. Naši rezultati bodo postavili temelje za razvoj navzkrižno reaktivnega cepiva proti COVID-19 za nadzor trenutnih in nastajajočih različic SARS-CoV-2 ter preprečevanje morebitnih pandemije koronavirusa.

Reference

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganejeva, I.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. Uporaba celične terapije CAR-T zunaj onkologije: avtoimunske bolezni in virusne okužbe. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanotehnologija proti novemu koronavirusu (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2): diagnoza, zdravljenje, terapija in perspektive v prihodnosti. Nanomedicina 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. Čredna imunost na COVID-19: kje smo? Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Imunološki vidiki strategij cepiva proti COVID-19. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG. Strukturna analiza genoma SARS-CoV-2 in napovedi človeškega interaktoma. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mehanizmi vstopa SARS-CoV-2 v celice. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, A.; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. Kandidat za cepivo z linearno DNK, ki kodira vezavno domeno receptorja SARS-CoV-2, izzove močan imunski odziv in nevtralizirajoča protitelesa pri domačih mačkah. Mol. Ther. Metode Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Ščerbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Šanšin, DV; Isaeva, AA; Nesmejanova, VS; Volkova, NV; et al. Imunogenost kombiniranega cepiva DNK/protein proti COVID-19. Bik. Exp. Biol. med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et al. Cepiva s krožno RNK proti SARS-CoV-2 in nastajajočim različicam. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. Zasnova mRNA cepiva SARS-CoV-2, ki jo omogoča pripravljenost prototipa patogena. Narava 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. SARS-CoV-2 imunogenost kandidata za glikoproteinsko cepivo NVX-CoV2373 pri pavijanih in zaščita pri miših. Nat. Komun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abbiento, V.; Benincasa, L.; et al. Hibridna imunost izboljša celice B in protitelesa proti različicam SARS-CoV-2. Narava 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Vpogled v genom SARS-CoV-2, strukturo, evolucijo, patogenezo in terapije: pristop strukturne genomike. Biochim. Biophys. Acta Mol. Osnova. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Indijsko novo DNK cepivo proti COVID-19 za mladostnike in odrasle je prvo. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Roka.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. DNK cepiva, ki izražajo ovojnice in membranske proteine, zagotavljajo delno zaščito pred SARS-CoV-2 pri miših. Spredaj. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebaš, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morrow, MP; Silvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. Intradermalno cepivo SynCon®Ebola GP DNA je temperaturno stabilno in varno izkazuje prednosti celične in humoralne imunogenosti pri zdravih prostovoljcih. J. Infect. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. Imunogenost DNK kandidata za cepivo proti COVID-19. Nat. Komun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Pesem, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. Sočasna imunizacija s cepivi CHIKV VLP in DNA povzroči obetaven humoralni odziv pri miših. Front Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Priprava z dvema cepivoma DNA, ki izražata protein NS3 virusa hepatitisa C, ki cilja na dendritične celice, izzove boljši heterologni zaščitni potencial pri miših. Arh. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. Izboljšan učinek imunizacije z DNA in in vivo elektroporacije s kombinacijo plazmidov jedra virusa hepatitisa B-PreS1 in S-PreS1. Clin. Cepivo Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Žan, Z.; et al. Cepivo mRNA proti COVID-19 s strukturo jedra in lupine z ugodnim vzorcem biološke porazdelitve in obetavno imunostjo. Transdukt signala. Target Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Razvoj in učinkovitost psevdotipiziranega sistema SARS-CoV-2, kot je bilo ugotovljeno z učinkovitostjo nevtralizacije in testom zaviranja vstopa in vitro. Biosaf. Zdravje 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Replikacijsko bakterijsko vektorsko cepivo, ki izraža SARS-CoV-2 membranske in nukleokapsidne beljakovine, ščiti hrčke pred hudo boleznijo, podobno COVID-19-. Cepiva NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

25. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. Kombinatorno cepljenje z mRNA izboljša zaščito pred delta različico SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Sodelovanje med strukturnimi proteini prenosljivega gastroenteritisa coronavirus (TGEV) pri in vitro indukciji protiteles, specifičnih za virus. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Krojač, N.; Frost, K.; Booth, S.; Saješ, B.; et al. Enkratna imunizacija z rekombinantnimi virusi vakcinije ACAM2000, ki izražajo konico in nukleokapsidne proteine, ščiti hrčke pred klinično boleznijo, ki jo povzroča SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Razred, J.; Presneto.; Richner, JM A SARS CoV-2 nukleokapsidno cepivo ščiti pred distalnim širjenjem virusa. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Ja, G.; Luo, X.; et al. Dostava cepiva proti virusu COVID-19 naslednje generacije na sluznico dihal zagotavlja zanesljivo zaščito pred predniki in različicami SARS-CoV-2. Celica 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. Povečana ekspresija nukleokapsidnega proteina SARS-CoV v tobaku in njegova imunogenost pri miših. Vaccine 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. Predhodna imunizacija z nukleokapsidnim proteinom koronavirusa (SARS-CoV), povezanim s hudim akutnim respiratornim sindromom (SARS), povzroči hudo pljučnico pri miših, okuženih s SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Kumarice, R.; et al. Učinkovitost cepiva pri starajočih se miših, okuženih z rekombinantnim virusom SARS-CoV, ki prenaša epidemijo in zoonotske konične različice. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horžinek, MC; Rottier, PJ Konica virusa mišjega hepatitisa in proteini nukleokapsida, izraženi z adenovirusnimi vektorji, ščitijo miši pred smrtonosno okužbo. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hung, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; On, L.; Chen, PJ; et al. Generiranje in karakterizacija DNA cepiv, ki ciljajo na nukleokapsidno beljakovino koronavirusa hudega akutnega respiratornega sindroma. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et al. SARS-CoV-2-specifična T-celična imunost v primerih COVID-19 in SARS ter neokužene kontrole. Narava 2020, 584, 457–462. [CrossRef]